合酶（PARP)切割，在完 全培養(yǎng)基中，將表達mlgE. Fq的Ramos細胞（5 X 10 5個細胞/ml)與濃度為1 μ g/ml的嵌 合抗C ε mX mAb、奧馬珠單抗或?qū)φ湛贵w在37°C下一起孵育1小時。然后用對人IgG Fe片 段具有特異的山羊F(ab'）2片段以10 μ g/ml的終濃度處理細胞，并于37°C下再孵育24小 時。用冰冷的PBS洗滌5X IO6個細胞，并重懸浮于100 μ 1冰冷的改良RIPA裂解緩沖液 [20禮1'1^8&!17.4)、1501111似(：1、1%1'1^011-父100、0.5%脫氧膽酸、0.1%十二烷基硫 酸鈉（SDS)、5mM EDTA和蛋白酶抑制劑（Sigma-Aldrich)]中。將裂解物于冰上孵育20分 鐘。將樣品在4°C下以16000Xg離心20分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的I. 5ml管中，并儲存 于-80°C。用DC蛋白測定（Bio-Rad Laboratories)按照廠商的建議對每個澄清裂解物中 的蛋白量進行定量。將每個樣品的總蛋白含量進行標(biāo)準(zhǔn)化，并進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電 泳（SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜（GE Healthcare)上。從Cell Signaling Techonology 獲得半胱天冬酶3和PARP的兔多克隆抗體，并以1:500稀釋使用。HRP偶聯(lián)的山羊抗兔 IgG 二抗（Sigma-Aldrich)以 1:10, 000 稀釋使用。用 ECL 試劑（ImmobilonTM Western ； Millipore)對膜進行顯影。通過用β肌動蛋白的抗體（Sigma-Aldrich)探測印跡來核實加 載了等量的蛋白。在用c4B12、c26H2和奧馬珠單抗而不是ca20處理表達mlgE. Ramos 細胞24小時以后，半胱天冬酶3明顯切割成Mr 19-和17-kDa的片段。此外，在c4B12-、 c26H2-和奧馬珠單抗處理的表達mlgE. Fq的Ramos細胞中，利用識別M , 116kDa的完整 PARP和Mr 89kDa的切割產(chǎn)物的抗體可檢測到PARP的切割（圖4C)。
[0026] 附圖簡要說明
[0027] 圖1顯示代表C ε mX的連續(xù)片段的3個合成肽，及多種抗C ε mX mAb與這些肽的反 應(yīng)。以粗體顯示CemX結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，CH4-migis:SEQ ID N0:11;P1:SEQ ID N0:12; P2:SEQ ID N0:3；P4:SEQ ID N0:13〇
[0028] 圖2顯示多種抗C ε mX mAb與表達mlgE· ?(^或mlgE· Fe 5的CHO或Ramos細胞系 的結(jié)合。
[0029] 圖3A顯示嵌合c4B12和c26H2以多個E/T比誘導(dǎo)針對表達mlgE. Ramos細 胞誘導(dǎo)的ADCC。圖3B顯示嵌合c4B12和c26H2以劑量響應(yīng)的方式誘導(dǎo)針對表達mlgE. Fcl 的Ramos細胞的ADCC。
[0030] 圖4A顯示嵌合c4B12和c26H2在表達mlgE. Ramos細胞中所誘導(dǎo)的PS暴露 是劑量依賴性的。圖4B顯示在嵌合c4B12和c26H2所處理的表達mlgE. Ramos細胞 中觀察到凋亡的細胞核。圖4C顯示在嵌合c4B12和c26H2所處理的表達mlgE. Ramos 細胞中觀察到半胱天冬酶3和PARP的切割。
[0031] 圖5顯示親本小鼠4B12的VL和VH、VL和VH的各自所選的人生殖系模板KV2和 HV4以及人源化4B12 (hu4B12)的氨基酸序列比對，人源化4B12 (hu4B12)在比對中被標(biāo)記為 "R印Iace (取代）"。該hu4B12與嵌合4B12 (c4B12)對C ε mX重組蛋白和表達mlgE. FcL的 Ramos細胞具有相同的結(jié)合親和力，4B12輕鏈：SEQ ID N0:5;4B12重鏈：SEQ ID N0:8;KV2 輕鏈：SEQ ID N0:6 ;HV4重鏈：SEQ ID N0:9 ;Hu4B12(取代）輕鏈：SEQ ID N0:7 ;Hu4B12(取 代）重鏈：SEQ ID NO: 10。
[0032] 所引用的參考文獻
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【主權(quán)項】
1. 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括： 給予有需要的人個體有效量的選自GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID N0:2)和 HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID N0:3)的免疫原以及佐劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原是GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID N0:2)。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原是HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR (SEQ ID NO:3)〇
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述個體患有IgE介導(dǎo)的疾病。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述IgE介導(dǎo)的疾病是寒冷誘發(fā)的蕁麻瘆，慢性蕁麻 瘆，膽堿能性蕁麻瘆，慢性鼻竇炎，系統(tǒng)性肥大細胞增生癥，皮膚肥大細胞增生癥，過敏性支 氣管肺曲霉病，復(fù)發(fā)性先天血管性水腫，間質(zhì)性膀胱炎或嗜酸性粒細胞相關(guān)的腸胃病癥。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述IgE介導(dǎo)的疾病是過敏性疾病。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述過敏性疾病是過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性 皮炎。
8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是誘導(dǎo)對GLAGGSAQSQRAPDRVL (SEQ ID NO:2)具有特異性的抗體產(chǎn)生的抗體應(yīng)答。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抗體能夠結(jié)合B淋巴細胞上的膜結(jié)合IgE并誘 導(dǎo)B淋巴細胞的凋亡。
10. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述個體患有IgE介導(dǎo)的疾病。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述IgE介導(dǎo)的疾病是寒冷誘發(fā)的蕁麻瘆，慢性蕁 麻瘆，膽堿能性蕁麻瘆，慢性鼻竇炎，系統(tǒng)性肥大細胞增生癥，皮膚肥大細胞增生癥，過敏性 支氣管肺曲霉病，復(fù)發(fā)性先天血管性水腫，間質(zhì)性膀胱炎或嗜酸性粒細胞相關(guān)的腸胃病癥。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述IgE介導(dǎo)的疾病是過敏性疾病。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述過敏性疾病是過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng) 性皮炎。
14. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是誘導(dǎo)對 HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR (SEQ ID NO: 3)具有特異性的抗體產(chǎn)生的抗體應(yīng)答。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述抗體能夠結(jié)合B淋巴細胞上的膜結(jié)合IgE并 誘導(dǎo)B淋巴細胞的凋亡。
【專利摘要】本發(fā)明涉及可與人B淋巴細胞表面所表達的膜結(jié)合IgE(mIgE)的CεmX結(jié)構(gòu)域有效結(jié)合的抗體的產(chǎn)生和應(yīng)用。提出將位于人膜結(jié)合ε鏈的CH4結(jié)構(gòu)域和C末端膜錨定肽之間的52個氨基酸殘基的CεmX結(jié)構(gòu)域作為抗原位點，用于免疫靶向表達mIgE的B細胞。以前所報道的與CεmX的C末端的RADWPGPP(SEQ ID NO:1)肽結(jié)合的單克隆抗體，包括a20在內(nèi)，目前據(jù)發(fā)現(xiàn)與人B細胞上的mIgE的結(jié)合較差。我們發(fā)現(xiàn)，只有對CεmX的某些片段具有特異性的單克隆抗體可與人B細胞上的mIgE有效結(jié)合，這些片段例如GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:2)和HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO:3)，并因此具有靶向那些B細胞而用于治療IgE介導(dǎo)的疾病的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K39-385, A61P11-02, A61P11-06, A61P17-00, A61P37-08, A61P1-14
【公開號】CN104667271
【申請?zhí)枴緾N201510069440
【發(fā)明人】張子文, 陳君柏, 費迪亞斯·C·吳, 阿爾弗爾·F·洪
【申請人】中央研究院
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2010年2月25日
【公告號】CN102482351A, CN102482351B, EP2401300A1, EP2401300A4, US8460664, US8741294, US8974794, US20120207746, US20130302314, US20140220042, WO2010097012A1