專(zhuān)利名稱(chēng)：一種同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗原特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
抗原特異性T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，在抗感染、抗腫瘤以及超敏反應(yīng)和自身免疫病的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，其數(shù)量的多寡和功能的強(qiáng)弱直接反映了人體特異性細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)，在選擇治療方案、評(píng)價(jià)藥物療效、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程以 及疫苗效果監(jiān)測(cè)等方面都有著不同于抗體的重要參考價(jià)值。但是，與特異性抗體的檢測(cè)相t匕，特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能檢測(cè)都困難許多，方法少而復(fù)雜，試劑少而昂貴。T細(xì)胞膜上的TCR (T細(xì)胞抗原受體)與抗原提呈細(xì)胞膜上pMHC分子(MHC/抗原肽復(fù)合體)的特異性識(shí)別和結(jié)合是T細(xì)胞特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。pMHC四聚體技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞分析是目前檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)方法，最具特異性和準(zhǔn)確性。由于pMHC單體與TCR的親和力較低，解離速度快，不能用于特異性T細(xì)胞的分析，而研究表明四價(jià)的pMHC分子在親和力和生物效應(yīng)方面都是最佳的。1996年Altman等將生物素化的pMHC單體分子與熒光標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合，制成PMHC四聚體，能同時(shí)與同一 T細(xì)胞膜上的4個(gè)TCR分子結(jié)合，增強(qiáng)了與T細(xì)胞的結(jié)合力。該技術(shù)不斷發(fā)展，至今已成為特異性T細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)、功能分析、表位驗(yàn)證以及T細(xì)胞靶向治療等諸多方面的有力工具。由于pMHC四聚體的制備難度較大，商業(yè)產(chǎn)品少而昂貴，另一種特異性較低但試劑易得的檢測(cè)方法也應(yīng)用較多，即ELISP0T技術(shù)。在細(xì)胞培養(yǎng)孔中將待檢細(xì)胞群與特定抗原共孵育，刺激抗原特異性T細(xì)胞活化而分泌IFN-Y等，繼而被包被在孔底的抗IFN-Y等抗體捕獲，再經(jīng)酶標(biāo)抗體染色，根據(jù)顯色斑點(diǎn)的多少判斷抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量，實(shí)際體現(xiàn)的是接受抗原刺激后活化而分泌IFN- Y的細(xì)胞數(shù)量(包括非T細(xì)胞)。該法兼有分析T細(xì)胞活化和分泌細(xì)胞因子的功能，但抗原特異性較低。細(xì)胞因子的胞內(nèi)熒光染色法也有類(lèi)似的缺點(diǎn)。為了既高度特異又簡(jiǎn)單方便地檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞，人們?cè)趦蓚€(gè)方面不斷地進(jìn)行探索一是改進(jìn)和創(chuàng)新PMHC四聚體或多聚體的制備技術(shù)，使工藝簡(jiǎn)化，成本降低，促進(jìn)四聚體技術(shù)的推廣應(yīng)用。傳統(tǒng)的PMHC復(fù)合體制備方法是稀釋法，即將原核重組表達(dá)的MHC I類(lèi)分子的重鏈及β 2微球蛋白(或MHC II類(lèi)分子的α鏈及β鏈)與人工合成的抗原肽稀釋到緩沖液中進(jìn)行復(fù)性折疊，濃縮后再純化PMHC單體分子，而后經(jīng)生物素-親和素系統(tǒng)制備四聚體。主要缺點(diǎn)是步驟繁雜，費(fèi)時(shí)3天，復(fù)性效率低于5%，而且需要原核表達(dá)不同型別MHC分子的基因工程蛋白。對(duì)此，人們不斷進(jìn)行改進(jìn)，如2006年，Ruan等建立EBV轉(zhuǎn)化的能表達(dá)各型別HLA-A、-B和-C分子的B細(xì)胞系，從細(xì)胞膜上提取純化真核表達(dá)的α鏈，再經(jīng)稀釋法與外源性β2和抗原肽進(jìn)行折疊。受真核表達(dá)和操作繁雜的限制，此方法的產(chǎn)量也比較低下。另一種較新穎的改進(jìn)是條件性抗原肽策略，即將MHC重鏈、β 2和條件性抗原肽以傳統(tǒng)稀釋法制備成PMHC復(fù)合體，然后在紫外線的作用下使條件性抗原肽在特定部位斷裂而從復(fù)合體中解離，再加載新的目的抗原肽而制成新PMHC復(fù)合體。該法雖可更換抗原肽，但制備過(guò)程仍很復(fù)雜，難以大批量生產(chǎn)。2010和2011年，季明春和Samanta等先后報(bào)道了抗原肽-MHC I類(lèi)分子重鏈和β2相融合的單鏈重組蛋白技術(shù)，并制備了單鏈蛋白的四聚體。該技術(shù)省去了重鏈和β 2蛋白的體外折疊，但仍需將大分子量的融合蛋白恢復(fù)正確的pMHC空間構(gòu)象以及濃縮、純化等步驟，復(fù)性效率較低。因此，繼續(xù)發(fā)展更加簡(jiǎn)便和高效的PMHC制備方法仍十分必要。二是探索基于pMHC分子靶向的T細(xì)胞檢測(cè)的新方法，如pMHC芯片技術(shù)。2003年，Soen等將不同型別pMHC四聚體分子點(diǎn)至帶覆層的玻片表面制成芯片，然后將細(xì)胞懸液滴至芯片表面，抗原特異性T細(xì)胞即可與相應(yīng)的pMHC復(fù)合體相結(jié)合而吸附在相應(yīng)的斑點(diǎn)區(qū)域，洗去其他細(xì)胞后可肉眼觀察結(jié)果，也可利用微分干涉相差顯微鏡或熒光顯微鏡觀察。2007年，Deviren.等利用pMHC_Ig融合分子和抗Ig抗體制備了間接標(biāo)記的pMHC芯片。在此基礎(chǔ)上，Stone等建立了人工抗原遞呈芯片技術(shù)，即將pMHC單體或四聚 體、共刺激分子的抗體以及細(xì)胞因子捕獲抗體(例如抗IFN-Y、抗TNF、抗IL-4、抗顆粒酶B)等一起點(diǎn)在芯片的同一斑點(diǎn)中，抗原特異性T細(xì)胞識(shí)別并結(jié)合在含相應(yīng)pMHC分子的斑點(diǎn)內(nèi)(此時(shí)可計(jì)數(shù))，同時(shí)，在共刺激分子的刺激下活化而分泌細(xì)胞因子，并被同一斑點(diǎn)內(nèi)的細(xì)胞因子抗體捕獲，經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體染色后檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，評(píng)價(jià)特異性T細(xì)胞的功能狀況。2010年，Ge等也制備了人工抗原提呈芯片，并建立了熒光數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，檢測(cè)了患者和健康者體內(nèi)流感病毒抗原特異性的T細(xì)胞反應(yīng)以及胰島β細(xì)胞自身抗原特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。該法的主要優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)檢測(cè)針對(duì)一系列抗原表位的特異性T細(xì)胞，并同時(shí)進(jìn)行數(shù)量和功能的評(píng)價(jià)；但其缺點(diǎn)也比較明顯，如⑴僅靠PMHC分子與T細(xì)胞的結(jié)合力不易使特異性T細(xì)胞固定在芯片上，而在洗滌中易被沖掉；(2)芯片難以滿足細(xì)胞培養(yǎng)所需的良好條件，影響T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌；(3)芯片技術(shù)中不同熒光標(biāo)記物之間的干擾和影響Μ)臨床操作中需要芯片熒光檢測(cè)儀等設(shè)備，限制了在中小醫(yī)院的應(yīng)用等。人工抗原提呈細(xì)胞(artificialantigen-presenting cell, aAPC)是模擬 T 細(xì)胞活化的雙重信號(hào)機(jī)制，在載體表面展現(xiàn)MHC/抗原肽復(fù)合物及共刺激分子、黏附分子的配體或抗體，模擬天然抗原提呈細(xì)胞。近年來(lái)，以細(xì)胞大小的磁珠或膠乳微球做載體標(biāo)記PMHC多聚體和CD28抗體等分子的aAPC已成為在體外細(xì)胞培養(yǎng)或體內(nèi)治療中靶向結(jié)合和擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞的有力工具。2007年，我們利用pMHC四聚體制備了膠乳微球式aAPC，注入小鼠體內(nèi)有效誘導(dǎo)了抗腫瘤的主動(dòng)免疫反應(yīng)；2011年，我們又制備了殺傷性aAPC，在小鼠皮膚移植模型中誘導(dǎo)了同種反應(yīng)性T細(xì)胞的靶向殺傷和清除。迄今為止，未見(jiàn)有將pMHC四聚體技術(shù)、人工抗原提呈細(xì)胞技術(shù)與ELISP0T技術(shù)、磁性細(xì)胞分選技術(shù)及微孔反應(yīng)板整合一體制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的知識(shí)產(chǎn)權(quán)情況，也未見(jiàn)利用本發(fā)明方案檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明提供了能同步系列化檢測(cè)針對(duì)特定抗原的特異性T細(xì)胞的數(shù)量及其接受抗原刺激后的反應(yīng)活性，既高度特異，又簡(jiǎn)便易行，不需特殊儀器，易于在一般單位推廣應(yīng)用的同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法。
技術(shù)方案本發(fā)明的同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法，包括以下步驟I)制備主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體利用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)制備MHC分子與其所提呈的靶抗原的抗原表位肽的復(fù)合體分子，再利用生物素-親和素系統(tǒng)制備所述主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體；2)制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞將步驟I)中制備的主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體與共刺激分子配體一起共同包被磁性微米球或磁性納米顆粒，制備得到磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞；3)制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板在微孔反應(yīng)板的不同微量反應(yīng)孔中分別包被抗干擾素-Y、抗腫瘤壞死因子、抗白細(xì)胞介素-4和抗顆粒酶B抗體，用牛血清白蛋白封閉上述微量反應(yīng)孔，再將所述步驟2)中制備的磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞，按照針對(duì)主要組織相容性抗原MHC分子型別和抗原表位的不同加入不同的微量反應(yīng)孔中，制成磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板；4)抗原特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的檢測(cè)取待檢機(jī)體的血細(xì)胞標(biāo)本，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞PBMC，計(jì)數(shù)后將分離的單個(gè)核細(xì)胞PBMC加入步驟3)中制備的磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的每個(gè)微量反應(yīng)孔中，反應(yīng)O. 5^3小時(shí)后,將該磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板置于板式磁塊Plate Magnet上，洗滌微量反應(yīng)孔并傾倒上清液，從而去除未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞；移走板式磁塊Plate Magnet后將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液加入每個(gè)微量反應(yīng)孔中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)微量反應(yīng)孔中與磁珠結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量，即抗原表位特異性的胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量；將磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2Γ72小時(shí)，棄去淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液后用蒸餾水洗滌每個(gè)微量反應(yīng)孔，破壞細(xì)胞，棄除微量反應(yīng)孔內(nèi)所有磁珠及細(xì)胞碎片，將生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體加入微量反應(yīng)孔中，靜置O. 5 2小時(shí)后洗滌微量反應(yīng)孔，向每個(gè)微量反應(yīng)孔加入酶標(biāo)親和素繼續(xù)靜置O. 5^1. 5小時(shí)，洗滌微量反應(yīng)孔后加入酶底物顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)微量反應(yīng)孔的吸光度或者用顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)微量反應(yīng)孔中的斑點(diǎn)數(shù)，根據(jù)所測(cè)得的吸光度或斑點(diǎn)數(shù)評(píng)價(jià)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞接受人工抗原提呈細(xì)胞的雙信號(hào)刺激后活化并分泌細(xì)胞因子和顆粒酶B的能力。本發(fā)明的步驟2)中，共刺激分子配體為抗分化抗原28抗體和抗分化抗原137抗體的任一種或其混合物。本發(fā)明的步驟2)中，磁性微米球的直徑為4. 5μπι，磁性納米顆粒的直徑小于4. 5 μ m0本發(fā)明的步驟4)中，生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體為生物素標(biāo)記的抗干擾素-Y、抗腫瘤壞死因子、抗白細(xì)胞介素-4和抗顆粒酶B抗體的一種或多種，當(dāng)生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體為多種時(shí)，將它們分別加入不同的微量反應(yīng)孔中。本發(fā)明將pMHC四聚體技術(shù)、人工抗原提呈細(xì)胞技術(shù)與ELISP0T技術(shù)、磁性細(xì)胞分選技術(shù)及微孔反應(yīng)板整合一體，制備成磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板(aAPC-microplate):針對(duì)特定的靶抗原，先制備一系列MHC型別所提呈的抗原表位的pMHC四聚體，與CD28等共刺激分子的抗體共同包被磁性微球，制備一系列磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞；在微孔反應(yīng)板中包被抗IFN- Y、抗TNF和抗顆粒酶B等抗體，然后在微量反應(yīng)孔中加入磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞，制備成靶抗原特異性的T細(xì)胞數(shù)量和功能檢測(cè)反應(yīng)板。本發(fā)明的基本原理是全血中的抗原特異性T細(xì)胞借TCR與aAPC (磁珠)表面的pMHC四聚體特異性結(jié)合,在板式磁場(chǎng)(Plate Magnet)下固定于微量反應(yīng)孔中，未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞被洗去，顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔內(nèi)的剩余細(xì)胞，即該抗原表位特異性的T細(xì)胞數(shù)量；繼續(xù)培養(yǎng)中，特異性T細(xì)胞在磁珠提供的雙信號(hào)刺激下活化，分泌的細(xì)胞因子或顆粒酶B被孔底的抗體捕獲，經(jīng)酶標(biāo)抗體染色后檢測(cè)每孔中的OD值或在顯微鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)，評(píng)價(jià)特異性T細(xì)胞活化和分泌細(xì)胞因子的功能。本發(fā)明的檢測(cè)方法可用來(lái)檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能，特別是最重要的病原體抗原、腫瘤抗原、自身抗原或移植抗原特異性的胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞。有益效果本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明的方法是一種將pMHC四聚體技術(shù)、人工抗原提呈細(xì)胞技術(shù)與ELISP0T技術(shù)、磁性細(xì)胞分選技術(shù)以及微孔反應(yīng)板整合一體的免疫學(xué)方法，既保留了 PMHC四聚體技術(shù)的高度特異性、人工抗原提呈細(xì)胞在體外雙信號(hào)刺激T細(xì)胞增殖的優(yōu)勢(shì)以及ELIP0ST技術(shù)對(duì)細(xì)胞的功能性分析，又利用了磁性細(xì)胞分選的簡(jiǎn)便性和微孔反應(yīng)條板的高通量性和靈活性，最終使抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量、功能及系列化分析同步進(jìn)行，又不需特殊儀器，操作簡(jiǎn)便易行，能極大地降低特異性T細(xì)胞檢測(cè)的難度，易于在一般單位推廣應(yīng)用。(2)本發(fā)明的方法適用于針對(duì)各種病原體抗原、腫瘤抗原、自身抗原以及同種反應(yīng)性抗原等進(jìn)行特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能分析，為檢測(cè)各種感染、腫瘤、自身免疫病和移植排斥患者的特異性細(xì)胞免疫功能提供了簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)方法，對(duì)各種免疫性疾病的治療方案選擇、藥物療效評(píng)價(jià)、疾病進(jìn)程預(yù)測(cè)以及疫苗效果監(jiān)測(cè)等有著不同于抗體檢測(cè)的重要參考價(jià)值。(3)本發(fā)明方法避免了傳統(tǒng)方法對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)和功能分析分開(kāi)進(jìn)行的弊端，而且利用試劑盒可以同步針對(duì)一系列MHC型別所提呈的一系列抗原表位的特異性T細(xì)胞進(jìn)行分析，使攜帶不同HLA型別的大多數(shù)人群不用進(jìn)行HLA基因分型而直接使用試劑盒檢測(cè)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)人群至少與試劑盒中的一種HLA基因型別相匹配。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法，包括以下步驟I)制備主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體利用常規(guī)的基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)制備MHC分子與其所提呈的靶抗原的抗原表位肽的復(fù)合體分子，再利用生物素-親和素系統(tǒng)制備所述主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體。具體方案如下 ①特定MHC分子α鏈蛋白的重組構(gòu)建和表達(dá)選用人群中頻率較高的一組特定的MHC等位基因，針對(duì)每種等位基因設(shè)計(jì)引物，用常規(guī)RT-PCR技術(shù)從細(xì)胞DNA樣品中擴(kuò)增α鏈胞外區(qū)的基因，并利用PCR引物在3'端連接一段由15個(gè)氨基酸組成的生物素底物肽BSP的基因序列，然后構(gòu)建pET28a重組質(zhì)粒，鑒定序列后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用常規(guī)方法提取和純化包涵體蛋白。
②特定MHC分子β鏈蛋白(或β 2微球蛋白)的重組構(gòu)建和表達(dá)針對(duì)每種等位基因設(shè)計(jì)引物，用常規(guī)RT-PCR技術(shù)從細(xì)胞DNA樣品中擴(kuò)增MHC II類(lèi)分子的β鏈胞外區(qū)基因(或者M(jìn)HC I類(lèi)分子的β 2微球蛋白)，然后構(gòu)建pET28a重組質(zhì)粒，鑒定序列后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用常規(guī)方法提取和純化包涵體蛋白。③特定pMHC復(fù)合體的制備表位選擇針對(duì)某一特定抗原(如病原體抗原、腫瘤抗原、自身抗原或者同種抗原等)，選用一系列能被特定MHC分子所提呈的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位，并人工合成這些抗原肽。pMHC復(fù)合體的折疊利用常規(guī)的稀釋復(fù)性法或者離子交換層析法等技術(shù)，將特定MHC分子的α鏈、β 鏈(或者M(jìn)HC I類(lèi)分子的β 2微球蛋白)進(jìn)行復(fù)性，并與特定抗原肽進(jìn)行折疊，濃縮折疊液后用FPLC技術(shù)或其他技術(shù)純化折疊正確的pMHC復(fù)合體，并用分子篩層析法分析其組成和純度。④pMHC四聚體的制備純化后的pMHC復(fù)合體在生物素酶BirA的催化下使β 2微球蛋白末端的BSP與生物素結(jié)合(按Avidity公司產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行)，超濾除去多余的生物素，按一定比例分批加入鏈酶親和素(包被磁珠用)或熒光素PE標(biāo)記的鏈酶親和素(流式分析用)，超濾去除游離的鏈酶親和素即得PMHC四聚體。2)制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞將步驟I)中制備的主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體與共刺激分子配體一起共同包被磁性微米球或磁性納米顆粒，制備得到磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞。其中，共刺激分子配體為抗分化抗原28抗體和抗分化抗原137抗體的任一種或其混合物。具體方案如下取直徑4. 5 μ m的磁性微球(表面已基團(tuán)功能化)或者直徑小于4. 5 μ m的磁性納米顆粒 107，用無(wú)菌 PBS 洗滌處理。將 anti-His6、anti-CD28 和 anti_CD137 等單抗(2. 5μ g
2.5 μ g :2. 5 μ g)混合后加入beads懸液中，4° C緩慢旋轉(zhuǎn)I小時(shí)。無(wú)菌PBS (磷酸鹽緩沖溶液)離心洗漆3次后將beads重懸于封閉緩沖液中(O. IM PBS, 3%human sera, O. 05%sodiumazide),于4° C慢轉(zhuǎn)I小時(shí),讓血清蛋白封閉beads表面剩余的結(jié)合位點(diǎn)。洗漆后加入一種 pMHC 四聚體，2· 5μ g/107beads，于 4。C 再慢轉(zhuǎn) I 小時(shí)。至此，Anti_CD28 和 anti_CD137等共刺激分子的抗體被直接包被于beads表面,pMHC四聚體則通過(guò)anti_His6單抗的橋聯(lián)作用被間接包被于beads表面，從而形成磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞。3)制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板在微孔反應(yīng)板的不同微量反應(yīng)孔中分別包被抗干擾素-Y、抗腫瘤壞死因子、抗白細(xì)胞介素-4和抗顆粒酶B抗體，用牛血清白蛋白封閉上述微量反應(yīng)孔，再將所述步驟2)中制備的磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞，按照針對(duì)主要組織相容性抗原MHC分子型別和抗原表位的不同加入不同的微量反應(yīng)孔中，錫箔紙真空封孔后即制成磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板。4)抗原特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的檢測(cè)①標(biāo)本采集與HLA等位基因分型采集待檢機(jī)體的血細(xì)胞標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)分型方法確定每份標(biāo)本的HLA等位基因型別。
②人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板法對(duì)標(biāo)本的檢測(cè)用Ficoll分離液常規(guī)分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，利用計(jì)數(shù)板和顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞，在MHC等位基因型別相對(duì)應(yīng)的微量孔中加入100 μ I (約105細(xì)胞)PBMC，于370C孵育O. 5h、lh或者3h,將磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板置于板式磁塊(Plate Magnet)上，洗滌微量反應(yīng)孔并傾倒上清液，洗滌去除未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞。移走板式磁塊PlateMagnet后將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液加入每個(gè)微量反應(yīng)孔中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔中與磁珠結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量(即該抗原表位特異性的T細(xì)胞數(shù))。然后，微孔反應(yīng)板繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h或者72h，棄上清后用蒸餾水破壞細(xì)胞，經(jīng)TBST緩沖液洗滌棄除孔內(nèi)所有磁珠及細(xì)胞碎片，將生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體加入微量反應(yīng)孔中，室溫反應(yīng)O. 5h、lh或者2h，洗滌后補(bǔ)加酶標(biāo)鏈酶親和素繼續(xù)室溫孵育O. 5h、lh或I. 5h，洗滌后加酶底物顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值或在顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔中的斑點(diǎn)數(shù)，評(píng)價(jià)特異性T細(xì)胞接受人工抗原提呈細(xì)胞的雙信號(hào)刺激后活化并分泌細(xì)胞因子或顆粒酶B的能力。其中的生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體可以是生物素 標(biāo)記的抗干擾素-Y、抗腫瘤壞死因子、抗白細(xì)胞介素-4和抗顆粒酶B抗體的一種或多種，采用單一類(lèi)型的生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體也可以做評(píng)價(jià)，但是四種類(lèi)型的吸光度更能全面充分地說(shuō)明問(wèn)題，所以在一次檢測(cè)中可以四種材料都用。當(dāng)生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體為多種時(shí)，將它們分別加入不同的微量反應(yīng)孔中。
權(quán)利要求
1.一種同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 1)制備主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體利用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)制備MHC分子與其所提呈的靶抗原的抗原表位肽的復(fù)合體分子，再利用生物素-親和素系統(tǒng)制備所述主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體； 2)制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞將所述步驟I)中制備的主要組織相容性抗原MHC分子與抗原肽復(fù)合體的四聚體與共刺激分子配體一起共同包被磁性微米球或磁性納米顆粒，制備得到磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞； 3)制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板在微孔反應(yīng)板的不同微量反應(yīng)孔中分別包被抗干擾素-Y、抗腫瘤壞死因子、抗白細(xì)胞介素-4和抗顆粒酶B抗體，用牛血清白蛋白封閉所述微量反應(yīng)孔，再將所述步驟2)中制備的磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞，按照針對(duì)主要組織相容性抗原MHC分子型別和抗原表位的不同加入不同的微量反應(yīng)孔中，制成磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板； 4)抗原特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的檢測(cè) 取待檢機(jī)體的血細(xì)胞標(biāo)本，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞PBMC，計(jì)數(shù)后將所述分離的單個(gè)核細(xì)胞PBMC加入所述步驟3)中制備的磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的每個(gè)微量反應(yīng)孔中，反應(yīng)0. 5 3小時(shí)后，將該磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板置于板式磁塊PlateMagnet上,洗漆微量反應(yīng)孔并傾倒上清液,從而去除未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞； 移走板式磁塊Plate Magnet后將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液加入每個(gè)微量反應(yīng)孔中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)微量反應(yīng)孔中與磁珠結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量，即抗原表位特異性的胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量； 將磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 72小時(shí)，棄去淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液后用蒸餾水洗滌每個(gè)微量反應(yīng)孔，破壞細(xì)胞，棄除微量反應(yīng)孔內(nèi)所有磁珠及細(xì)胞碎片，將生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體加入微量反應(yīng)孔中，靜置0. 5 2小時(shí)后洗滌微量反應(yīng)孔，向每個(gè)微量反應(yīng)孔加入酶標(biāo)親和素繼續(xù)靜置0. 5^1. 5小時(shí)，洗滌微量反應(yīng)孔后加入酶底物顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)微量反應(yīng)孔的吸光度或者用顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)微量反應(yīng)孔中的斑點(diǎn)數(shù)，根據(jù)所測(cè)得的吸光度或斑點(diǎn)數(shù)評(píng)價(jià)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞接受人工抗原提呈細(xì)胞的雙信號(hào)刺激后活化并分泌細(xì)胞因子和顆粒酶B的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法，其特征在于，步驟2)中所述的共刺激分子配體為抗分化抗原28抗體和抗分化抗原137抗體的任一種或其混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法，其特征在于，所述步驟2)中,磁性微米球的直徑為4. 5 ii m,磁性納米顆粒的直徑小于4. 5 ii m。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法，其特征在于，所述步驟4)中的生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體為生物素標(biāo)記的抗干擾素-Y、抗腫瘤壞死因子、抗白細(xì)胞介素-4和抗顆粒酶B抗體的一種或多種，當(dāng)生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體為多種時(shí)，將它們分別加入不同的微量反應(yīng)孔中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同步檢測(cè)特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的方法，能同步系列化檢測(cè)針對(duì)特定抗原的特異性胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞的數(shù)量及其接受抗原刺激后的反應(yīng)活性，既高度特異，又簡(jiǎn)便易行，不需特殊儀器，能極大地降低特異性T細(xì)胞檢測(cè)的難度，易于在一般單位推廣應(yīng)用。系列化檢測(cè)是指該方法借助微孔反應(yīng)板能同步檢測(cè)由一系列人類(lèi)主要組織相容性抗原所提呈的針對(duì)一系列抗原表位的特異性T細(xì)胞，使針對(duì)靶抗原的檢測(cè)試劑盒既能覆蓋絕大多數(shù)人群，又能在一次檢測(cè)中分析多種抗原表位的特異性T細(xì)胞。本方法使分析機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫功能狀態(tài)變得簡(jiǎn)單方便，從而可促進(jìn)免疫性疾病的研究和治療。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102662054SQ20121014541
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者張建瓊, 沈傳來(lái) 申請(qǐng)人:東南大學(xué)