專利名稱：淋巴細胞腫瘤抗體的增強劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增強劑，其含有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(BRM)作為活性成分，作為用于淋巴細胞腫瘤治療的藥物，并且含有一種抗體作為活性成分，其能特異結(jié)合淋巴細胞腫瘤中表達的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
在生物中淋巴細胞主要負責免疫。全部來源于血液中相同干細胞的淋巴細胞通過骨髓或其它器官中多種分化誘導因子或生長因子的作用經(jīng)受反復分化，然后釋放至外周血中。根據(jù)分化的不同，大體將淋巴細胞分類為B細胞和T細胞。普遍認為，B細胞具有產(chǎn)生抗體的能力，而T細胞具有呈遞抗原的能力，具有細胞毒性，并且具有多種其它能力。當細胞在分化期經(jīng)歷致瘤性轉(zhuǎn)化并開始在骨髓、淋巴組織和外周血中異常生長時，它們變?yōu)樗^的淋巴細胞腫瘤。
由于最近新技術(shù)的引入，特別是應(yīng)用單克隆抗體分化細胞表面抗原的技術(shù)進展，現(xiàn)在能夠鑒定淋巴細胞的起源和/或階段。當前，同樣對于淋巴細胞腫瘤，現(xiàn)在不僅能夠確定腫瘤細胞的起源是T細胞還是B細胞，而且能確定成熟度。
根據(jù)腫瘤細胞的起源或成熟度，大體將淋巴細胞腫瘤分類為B細胞腫瘤和T細胞腫瘤。B細胞腫瘤根據(jù)成熟度分類為急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴細胞白血病(B-CLL)、前B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、濾泡性大腦皮質(zhì)淋巴瘤、彌漫性淋巴瘤、骨髓瘤，等等。T細胞腫瘤也根據(jù)成熟度分類為急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)、慢性T淋巴細胞白血病(T-CLL)、成人T細胞白血病(ATL)、非ATL外周T淋巴瘤(RNTL)，等等(Zukai Rinsho[Gan](臨床闡述[癌癥])，系列號17，白血病/淋巴瘤，Takashi Sugimura等人，醫(yī)學觀察(MEDICAL VIEW)，1987，B細胞腫瘤，Kiyoshi Kouzuki，Nishimura Shoten，1991)。
盡管醫(yī)學技術(shù)近來有所進展，但在淋巴細胞腫瘤治療方面仍有待改進。例如，急性淋巴細胞白血病(ALL)的治愈率低于20％。對于淋巴瘤，由于多種藥物聯(lián)合治療的進展，B淋巴瘤的治愈率相對較高，但晚期的治愈率仍為約50％。另外，T淋巴瘤是更加難以治愈的，其治愈率約為30％，成人T細胞白血病(ATL)低于10％。
另一方面，Goto，T.等人報道了一種通過用人骨髓瘤細胞免疫小鼠獲得的單克隆抗體(抗-HM1.24抗體)(血液(Blood)(1994)84，1922-1930)。當對移植有人骨髓瘤細胞的小鼠施用抗-HM1.24抗體時，該抗體以一種特殊方式在腫瘤組織中積累(Masaaki Kosaka等人，Nippon Rinsho(日本臨床)(1995)53，627-635)，表明抗-HM1.24抗體能通過放射性同位素標記、導彈療法(如放射治療)等用于對腫瘤定位的診斷。
另一方面，癌癥患者通常具有降低的免疫功能。由于認為這與致癌作用有關(guān)，所以正在進行提高這些功能的嘗試。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(BRM)用來以有利于生物的方向?qū)⑸锏闹苯雍?或間接反應(yīng)能力導向腫瘤，并在治療中應(yīng)用。它們主要增強巨噬細胞、T細胞等的功能，并能恢復免疫能力等。在應(yīng)用非特異性免疫激活物質(zhì)進行治療及研究的時候，研究了多種細胞因子的生物活性，并且大量生產(chǎn)據(jù)認為可能有效的細胞因子(Konnniti no Tiryoyaku(《今日治療性藥物》)(1995年版)，YutakaMizushima和Akimasa Miyamoto編，Nankodo K.K.，第17版第3次印刷，1995年6月20日發(fā)行)。

發(fā)明內(nèi)容
目前使用的治療淋巴細胞腫瘤的方法包括多種化學療法、放射療法、骨髓移植，等等。然而，上述方法中沒有一種是理想的，需要能緩解淋巴細胞腫瘤并延長患者存活時間的新的治療劑或治療方法。
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種針對抗淋巴細胞腫瘤的新型增強劑。
為了試圖提供這些治療方法，本發(fā)明的發(fā)明者檢查了抗-HM1.24抗體(Goto，T.等人，血液(1994)84，1922-1930)與生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的組合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)該組合應(yīng)用導致更強的細胞毒性，并且尤其在細胞毒性降低時恢復正常水平的細胞毒性，提示對淋巴細胞腫瘤有可能的抗腫瘤作用，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供一種抗體增強劑用于淋巴細胞腫瘤的治療，該抗體能特異結(jié)合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并具有細胞毒性，該增強劑含有一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物作為活性成分。
本發(fā)明也提供一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物增強劑用于淋巴細胞腫瘤的治療，該增強劑含有一種抗體作為活性成分，該抗體能特異結(jié)合具有如SEQ IDNO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并具有細胞毒性。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中淋巴細胞腫瘤是T細胞腫瘤。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中淋巴細胞腫瘤是B細胞腫瘤。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中B細胞腫瘤是骨髓瘤。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體是單克隆抗體。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中細胞毒性是ADCC活性。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體具有人抗體的恒定區(qū)Cγ。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中人抗體的恒定區(qū)Cγ是Cγ1或Cγ3。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體是抗-HM1.24抗體。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體是嵌合抗-HM1.24抗體。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體是人源化抗-HM1.24抗體。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體能特異結(jié)合可被抗-HM1.24抗體識別的表位。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物是干擾素、OK432、香菇多糖(lenthinan)、西索菲蘭、抑胃肽、云芝多糖、N-CWS、左旋咪唑、G-CSF、IL-2、IL-10或IL-15。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中抗體具有細胞毒性，在E/T比為50的條件下ADCC活性低于25％。
本發(fā)明也提供上述增強劑，其中ADCC活性用Cr(鉻)釋放試驗來測定。
本發(fā)明也提供在體內(nèi)使用的根據(jù)上述任意一項的增強劑。
本發(fā)明也提供一種用于淋巴細胞腫瘤的治療劑，該藥劑含有一種抗體和一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，其中抗體能特異結(jié)合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并具有細胞毒性。
附圖簡述

圖1是一張圖表，顯示當使用來源于健康人外周血的細胞作為效應(yīng)細胞時，人源化抗-HM1.24抗體對RPMI8226細胞顯示強細胞毒性。
圖2是一張圖表，顯示當使用來源于骨髓瘤患者外周血的細胞作為效應(yīng)細胞時，人源化抗-HM1.24抗體對RPMI8226細胞顯示細胞毒性。
圖3是一張圖表，顯示當使用來源于用大劑量環(huán)磷酰胺治療的骨髓瘤患者、經(jīng)受單采血液分離術(shù)的細胞作為效應(yīng)細胞時，人源化抗-HM1.24抗體對RPMI8226細胞顯示細胞毒性。
實施本發(fā)明的實施方案1.抗體制備1-1.雜交瘤制備產(chǎn)生用于本發(fā)明的抗體的雜交瘤基本上能用如下所述的已知方法構(gòu)建。HM1.24抗原蛋白質(zhì)或表達HM1.24抗原的細胞可用作致敏性抗原，并按常規(guī)免疫方法進行免疫。以常規(guī)細胞融合方法使這樣獲得的免疫細胞與已知的親本細胞融合，然后用常規(guī)篩選方法篩選，篩選出產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
單克隆抗體尤其可以用下列方法獲得。例如，對于作為致敏性抗原用于獲得抗體的HM1.24抗原表達細胞，能使用一種人多發(fā)性骨髓瘤細胞系KPMM2(日本未經(jīng)審查的專利申請公開文本(Kokai)號7(1995)-236475)或KPC-32(Goto T.等人，日本臨床血液學雜志(Jpn.J.Clin.Hematol.)(1991)32，1400)。此外，對于致敏性抗原，可以使用具有SEQID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)或含有能被抗-HM1.24抗體識別的表位的肽或多肽。
在此處使用時，將編碼具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的cDNA插入pUC19載體的XbaI酶切位點中，由此制備質(zhì)粒pRS38-pUC19。含有該質(zhì)粒的大腸桿菌已于1993年10月5日由國立生物科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏，為大腸桿菌DH5α(pRS38-pUC19)，保藏號為FERM BP-4434(參見日本未經(jīng)審查的專利申請公開文本(Kokai)號7(1995)-196694)。能用該質(zhì)粒pRS38-pUC19所含的cDNA片段通過基因工程技術(shù)制備含有能被抗-HM1.24抗體識別的表位的肽或多肽。
優(yōu)選地，出于對與細胞融合中所用親本細胞的相容性的考慮，選擇用致敏性抗原免疫的哺乳動物。它們通常包括但不限于嚙齒類動物如小鼠、大鼠、倉鼠等。
用致敏性抗原對動物的免疫采用公知的方法進行。例如，一種普通方法包括對哺乳動物腹膜內(nèi)或皮下施用致敏性抗原。
具體而言，如所希望的將一種用適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或生理鹽水等稀釋或懸浮的致敏性抗原與適量弗氏完全佐劑混合。乳化后，優(yōu)選地每4-21天對哺乳動物施用數(shù)次?；蛘?，在致敏性抗原免疫時可以使用合適的載體。
免疫并確定血清中目標抗體水平提高后，自哺乳動物中采取免疫細胞，進行細胞融合。優(yōu)選的免疫細胞尤其包括脾細胞。
作為其它親本細胞，可與上述免疫細胞進行細胞融合的哺乳動物骨髓瘤細胞優(yōu)選地包括多種已知的細胞系，如P3X63Ag8.653(免疫學雜志(J.Immunol.)(1979)1231548-1550)、P3X63Ag8U.1(微生物學與免疫學當代論題(Current Topics in Microbiology and Immunology)(1978)811-7)、NS-1(Kohler，G.和Milstein，C.，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)(1976)6511-519)、MPC-11(Margulies，D.H.等人，細胞(Cell)(1976)8405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，自然(Nature)(1978)276269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等人，免疫學方法雜志(J.Immunol.Methods)(1980)351-21)、S194(Trowbridge，I.S.，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)(1978)148313-323)、R210(Galfre，G.等人，自然(1979)277131-133)，等等。
上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合基本上可以按照如Milstein等人(Kohler，G.和Milstein，C.，酶學方法(Methods Enzymol.)(1981)733-46)所述等已知方法進行。
更具體而言，例如在細胞融合促進劑的存在下在常規(guī)營養(yǎng)肉湯中進行上述細胞融合。例如可以使用聚乙二醇(PFG)、仙臺病毒(HVJ)等作為細胞融合促進劑，另外，也可如所希望的加入二甲基亞砜等佐劑，提高融合效率。
所使用的免疫細胞與骨髓瘤細胞的優(yōu)選比例為，例如，免疫細胞比骨髓瘤細胞多1-10倍。可用于上述細胞融合的培養(yǎng)基的實例包括適合于上述骨髓瘤細胞系生長的RPMI1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基，和用于此類細胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基，此外，也可加入血清添加物如胎牛血清(FCS)。
細胞融合時，將預(yù)定量的上述免疫細胞與骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，以30-60％(w/v)的濃度向其中加入預(yù)先加熱至大約37℃的PEG溶液，如平均分子量約為1000-6000的PEG溶液，混合后獲得需要的融合細胞(雜交瘤)。然后通過重復連續(xù)的適當培養(yǎng)液加入及離心棄去上清液步驟，能除去雜交瘤生長所不需要的細胞融合劑等。
通過在常規(guī)選擇性培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基(一種含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來篩選所述雜交瘤。在該HAT培養(yǎng)基中的培養(yǎng)通常持續(xù)一段時間，這段時間足以實現(xiàn)除目標雜交瘤之外的細胞(非融合細胞)的殺傷，一般為幾天到幾周。進行常規(guī)有限稀釋法，其中篩選并單克隆地克隆產(chǎn)生目標抗體的雜交瘤。
除了通過用一種抗原免疫除人之外的動物而獲得上述雜交瘤之外，也能用HM1.24抗原或表達HM1.24抗原的細胞體外致敏人淋巴細胞，使產(chǎn)生的致敏淋巴細胞與骨髓瘤細胞(如U266)融合，獲得具有結(jié)合HM1.24抗原或HM1.24抗原表達細胞活性的目標人抗體(參見日本審查后專利公開文本(Kokoku)號1(1989)-59878)。此外，能按上述方法，用該抗原即HM1.24抗原或HM1.24抗原表達細胞免疫含有全部人抗體基因所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物，獲得希望的人源化抗體(參見國際專利申請WO93-12227、WO92-03918、WO94-02602、WO94-25585、WO96-34096和WO96-33735)。
這樣構(gòu)建的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤能在常規(guī)培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，或者能在液氮中貯存較長一段時間。
為了從該雜交瘤中獲得單克隆抗體，能述及一種用常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤并以上清液形式獲得抗體的方法，或者向與該雜交瘤相容的哺乳動物施用并在其中生長該雜交瘤，以腹水形式獲得抗體的一種方法。前述方法適用于獲得高純度的抗體，而后者適用于抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。
尤其能用Goto，T.等人(血液(1994)841922-1930)的方法構(gòu)建產(chǎn)生抗-HM1.24抗體的雜交瘤。能用這樣一種方法實施其中向BALB/c小鼠(日本CLEA生產(chǎn))腹膜內(nèi)注射產(chǎn)生抗-HM1.24抗體的雜交瘤，獲得腹水，從中純化抗-HM1.24抗體，該雜交瘤于1995年9月14日按布達佩斯條約的規(guī)定由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki prof.，日本，國際保藏號FERM BP-5233，或者用這樣一種方法在合適的培養(yǎng)基如含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基和5％BM-調(diào)和的H1(BoehringerMannheim生產(chǎn))、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))等培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述雜交瘤，從上清液中純化抗-HM1.24抗體。
1-2.重組抗體在本發(fā)明中能用一種經(jīng)重組基因技術(shù)產(chǎn)生的重組抗體作為單克隆抗體，其中從雜交瘤中克隆一種抗體基因，整合至合適的載體中，然后將其引入宿主中(參見，例如，Carl，A.K.，Borrebaeck和James，W.Larrick，《治療性單克隆抗體》(THERAPEUTIC MONOCLONALANTIBODIES)，英國MACMILLAN PUBLISHERS LTD.出版，1990)。
具體地，從產(chǎn)生抗體的雜交瘤中分離編碼希望抗體可變(V)區(qū)的mRNA。例如，通過用公知的方法如胍超速離心法(Chirgwin，J.M.等人，生物化學(Biochemistry)(1979)18，5294-5299)或AGPC法(Chomczynski，P.等人，分析生物化學(Analytical Biochemistry)(1987)162，156-159)制備總RNA進行mRMA的分離，然后利用mRNA純化試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))等從總RNA中純化mRNA。此外，能用Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))直接制備mRNA。
使用逆轉(zhuǎn)錄酶可由這樣獲得的mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。cDNA可以用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等合成。此外，對于cDNA的合成和擴增，可以使用利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的5’-Ampli FINDERRACE試劑盒(Clontech生產(chǎn))及5’-RACE法(Frohman，M.A.等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1989)17，2919-2932)。從獲得的PCR產(chǎn)物中純化目標DNA片段，與載體DNA連接。此外，由此構(gòu)建重組載體，然后將其引入大腸桿菌等，從中挑選菌落制備目標重組載體。目標DNA的堿基序列可以經(jīng)公知的方法如雙脫氧法證實。
一旦獲得編碼目標抗體V區(qū)的DNA，即可與編碼目標抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，然后將其整合入表達載體中。此外，也可將編碼抗體V區(qū)的DNA整合至已經(jīng)含有編碼抗體C區(qū)的DNA的表達載體中。
為了產(chǎn)生用于本發(fā)明的抗體，如下所述將抗體基因整合至表達載體中，使之在表達調(diào)節(jié)區(qū)如增強子和/或啟動子的控制下表達。隨后，可以將該表達載體轉(zhuǎn)化入宿主細胞，于是在其中能表達該抗體。
1-3.改變的抗體根據(jù)本發(fā)明，為了降低對人的異源抗原性，能使用人工改變的重組抗體如嵌合抗體和人源化抗體。這些改變的抗體能用公知的方法產(chǎn)生。
嵌合抗體能如此獲得將這樣獲得的編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后將其整合到表達載體中，并引入宿主中用于抗體在其中的產(chǎn)生(參見歐洲專利申請EP125023，和國際專利申請WO96-02576)。利用該已知方法，能獲得可用于本發(fā)明的嵌合抗體。
例如，攜帶含有嵌合抗-HM1.24抗體L鏈V區(qū)或H鏈的質(zhì)粒的大腸桿菌已經(jīng)于1996年8月29日由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏分別，為大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24L-gγ1)，保藏號為FERMBP-5646和FERM BP-5644(參見國際專利申請WO 98-14580)。
人源化抗體，也稱為重構(gòu)人抗體，其制備方法是將除人之外哺乳動物的抗體如小鼠抗體的互補性決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的CDR中。制備這些抗體的普通重組DNA技術(shù)也是公知的(參見歐洲專利申請EP125023和國際專利申請WO96-02576)。
尤其，由片段在末端互相重疊的幾種分開的寡核苷酸合成用于連接小鼠抗體CDR與人抗體構(gòu)架區(qū)(FR)的DNA序列。然后將寡核苷酸合成為一個整合的DNA。這樣獲得的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后將其整合到表達載體中，將其引入宿主中用于抗體生產(chǎn)(參見歐洲專利申請EP239400和國際專利申請WO 96-02576)。
對于通過CDR連接的人抗體的FR，選擇能形成有利地抗原結(jié)合位點的互補性決定區(qū)。需要時，可以替換抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)中的氨基酸，使得重構(gòu)的人抗體的互補性決定區(qū)可以形成合適的抗原結(jié)合位點(Sato，K.等人，癌癥研究(Cancer Res.)(1993)53，851-856)。
例如，攜帶含有人源化抗-HM1.24抗體L鏈a型和H鏈r型的質(zhì)粒的大腸桿菌已經(jīng)于1996年8月29日由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏，分別為大腸桿菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)，保藏號分別為FERM BP-5645和FERM BP-5643(國際專利申請WO 98-14580)。此外，攜帶含有H鏈s型的質(zhì)粒的大腸桿菌已經(jīng)于1997年9月29日由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏，為大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)，保藏號為FERM BP-6127。
人源化抗-HM1.24抗體L鏈a型的V區(qū)、人源化抗-HM1.24抗體的H鏈r型和人源化抗-HM1.24抗體的H鏈s型中每一種的氨基酸序列和核苷酸序列顯示于SEQ ID NO2、3和4中。位點-15到-1的氨基酸是信號序列。
對于嵌合抗體或人源化抗體，使用人抗體的C區(qū)，對于顯示細胞毒性的人抗體的C區(qū)，可使用人Cγ，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4。其中，含有Cγ1和Cγ3的抗體尤其具有強細胞毒性，即ADCC活性和CDC活性，優(yōu)選地用于本發(fā)明中。
嵌合抗體由來源于除人之外哺乳動物的抗體的可變區(qū)和來源于人抗體的C區(qū)組成，而人源化抗體由來源于除人之外哺乳動物的抗體的互補性決定區(qū)和來源于人抗體的抗體構(gòu)架區(qū)(FR)及C區(qū)組成。因此，其中人體中的抗原性降低，使得它們可用作本發(fā)明的治療劑的活性成分。
用于本發(fā)明的人源化抗體的一個優(yōu)選實施方案包括人源化抗-HM1.24抗體(參見國際專利申請WO98-14580)。
1-4.表達與產(chǎn)生如上所述構(gòu)建的抗體基因可以用公知的方法表達并獲得。對于哺乳動物細胞，可以用一種表達載體實現(xiàn)表達，該表達載體中含有一種常用的有效啟動子、待表達的抗體基因和其中poly A信號有效連接于其3’下游的DNA或含有該DNA的載體。啟動子/增強子的實例包括人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子。
另外，對于能在本發(fā)明中用于抗體表達的啟動子/增強子，能使用病毒啟動子/增強子，如反轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)，以及來源于哺乳動物細胞的啟動子/增強子，如人延伸因子1α(HEF1α)。
例如，當使用SV40啟動子/增強子時，按Mulligan等人(自然(1979)277，108)的方法可方便地實現(xiàn)表達，或者，當使用HEF1α啟動子/增強子時用Mizushima等人(核酸研究(1990)18，5322)的方法。
對于大腸桿菌，可如下進行表達有效連接常用的有效啟動子、抗體分泌的信號序列和待表達的抗體基因，隨后進行其表達。至于啟動子，例如，能提及l(fā)acz啟動子和araB啟動子。當使用lacz啟動子時，可以使用Ward等人(自然(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)的方法，當使用araB啟動子時，可使用Better等人(科學(1988)240，1041-1043)的方法。
至于抗體分泌的信號序列，當在大腸桿菌周質(zhì)中產(chǎn)生時，能使用pelB信號序列(Lei，S.P.等人，細菌學雜志(J.Bacteriol.)(1987)169，4379)。分離周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體后，在使用前適當?shù)刂卣郫B該抗體的結(jié)構(gòu)(參見，例如，WO 96-30394)。
至于復制起點，能使用來源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復制起點。此外，對于宿主細胞系統(tǒng)中基因拷貝數(shù)的擴增，表達載體可包含選擇性標記氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因，等等。
對于本發(fā)明所用抗體的產(chǎn)生，能使用任何產(chǎn)生系統(tǒng)?？贵w制品的產(chǎn)生系統(tǒng)包括體外或體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)。對于體外產(chǎn)生系統(tǒng)，能述及使用真核細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)和使用原核細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。
當使用真核細胞時，存在使用動物細胞、植物細胞和真菌細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。公知的動物細胞包括(1)哺乳動物細胞，如CHO細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、HeLa細胞和Vero細胞，(2)兩棲動物細胞，如Xenopus oocytes，或者(3)昆蟲細胞，如sf9、sf21和Tn5。公知的植物細胞包括，例如，來源于煙草(Nicotiana)屬的細胞，尤其是來源于經(jīng)受愈傷組織培養(yǎng)的煙草(Nicotiana tabacum)的細胞。公知的真菌細胞包括酵母，如酵母(Saccharomyces)屬，尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cereviceae)，或絲狀真菌，如曲霉(Aspergillus)屬，尤其是黑曲霉(Aspergillus niger)。
當使用原核細胞時，存在使用細菌細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。公知的細菌細胞包括大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
將目標抗體的基因經(jīng)轉(zhuǎn)化引入這些細胞中，并在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，能獲得抗體。培養(yǎng)按公知的方法進行。例如，能用DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM作為培養(yǎng)液，并可結(jié)合使用血清添加物如胎牛血清(FCS)。另外，通過向動物的腹腔等之中植入已經(jīng)引入抗體基因的細胞，也可在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。
至于其它的體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)，能述及那些使用動物和使用植物的系統(tǒng)。當使用動物時，存在使用哺乳動物和昆蟲的產(chǎn)生系統(tǒng)。
對于哺乳動物，能使用山羊、豬、綿羊、小鼠和牛(Vicki Glaser，光譜生物技術(shù)應(yīng)用(SPECTRUM Biotechnology Applications)，1993)。至于昆蟲，能使用蠶。
當使用植物時，例如能使用煙草。
將抗體基因引入這些動物或植物中，在這些動物或植物中產(chǎn)生抗體，并回收。例如，將一種抗體基因插入編碼在奶中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)如山羊β酪蛋白的基因中間，制備融合基因。向山羊胚胎中注射含有已經(jīng)插入抗體基因的融合基因的DNA片段，并將該胚胎引入雌性山羊中。從接受該胚胎的山羊所產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因山羊或其子代產(chǎn)生的奶中獲得目標抗體。為了提高轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有目標抗體的奶量，可以適當?shù)貙D(zhuǎn)基因山羊施用激素(Ebert，K.M.等人，生物/技術(shù)(Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
當使用蠶時，使蠶感染已經(jīng)插入目標抗體基因的桿狀病毒，從蠶的體液中能獲得目標抗體(Susumu，M.等人，自然(1985)315，592-594)。此外，當使用煙草時，將目標抗體基因插入一種植物表達載體如pMON530中，然后將該載體引入細菌如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中。然后用該細菌感染煙草如煙草，從煙草葉中獲得目標抗體(Julian，K.-C.Ma等人，歐洲免疫學雜志(1994)24，131-138)。
當如上所述在體外或體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體時，可分別將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA整合至表達載體中，同時轉(zhuǎn)化宿主，或者可將編碼H鏈或L鏈的DNA整合至一種單表達載體中，用其轉(zhuǎn)化宿主(參見國際專利申請WO 94-11523)。
如上所述產(chǎn)生的抗體能結(jié)合多種分子如聚乙二醇(PEG)用作修飾抗體。此處所用的“抗體”包括這些修飾抗體。為了獲得這些修飾抗體，可以化學修飾獲得的抗體。這些方法已經(jīng)在本技術(shù)領(lǐng)域中建立。
2.抗體的分離與純化2-1.抗體的分離與純化能從細胞內(nèi)或細胞外或宿主中分離如上所述產(chǎn)生及表達的抗體，然后可將其純化為均質(zhì)。用于本發(fā)明的抗體的分離和純化可通過親和層析完成。對于用于此的親和層析柱，能提及A蛋白柱和G蛋白柱。使用A蛋白柱的柱子的實例是Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。
此外，能不加任何限制地使用常規(guī)用于蛋白質(zhì)的分離及純化方法。本發(fā)明所用抗體的分離及純化可以通過適當?shù)亟Y(jié)合除上述親和層析之外的層析、過濾、超濾、鹽析、透析等來完成。例如，層析包括離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等等。
2-2.抗體濃度的測定通過吸光度測定或通過ELISA等能測定在上述2-1中獲得的抗體的濃度。因此，當使用吸光度測定時，用PBS(-)適當稀釋用于本發(fā)明的抗體或含有該抗體的樣品，然后在280nm測定吸光度，隨后用1mg/ml時1.35OD的吸收系數(shù)計算。當使用ELISA方法時，如下進行測定。向96孔板(Nunc生產(chǎn))中加入100μl用0.1M碳酸氫鹽緩沖液pH9.6稀釋為1μg/ml的山羊抗人IgG(BIO SOURSE生產(chǎn))，4℃溫育過夜來固定抗體。封閉后，加入100μl每種適當稀釋的本發(fā)明的抗體，或含有該抗體的樣品，或100μl已知濃度的人IgG作為標準，在室溫下溫育1小時。洗滌后，加入100μl 5000倍稀釋的堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體(BIOSOURSE生產(chǎn))，在室溫下溫育1小時。洗滌后，加入底物溶液溫育，隨后用3550型微量培養(yǎng)板酶標儀(Bio-Rad生產(chǎn))測定405nm的吸光度，計算目標抗體的濃度。
3.FCM分析可以通過流式細胞儀(FCM)分析檢測本發(fā)明的抗體與淋巴細胞的反應(yīng)性。至于細胞，能使用建立的細胞系或新分離的細胞。至于建立的細胞系，可使用T細胞系，如RPMI8402(ATCC CRL-1995)、急性成淋巴細胞白血病衍生的CCRF-CEM(ATCC CCL 119)、急性淋巴性白血病衍生的HPB-ALL(FCCH1018)、T淋巴瘤衍生的HPB-MLT(FCCH1019)、急性淋巴性白血病衍生的JM(FCCH1023)、急性成淋巴細胞白血病衍生的MOLT-4(ATCC CRL 1582)、急性淋巴性白血病衍生的Jurkat(FCCH1024)、急性成淋巴細胞白血病衍生的CCRF-HSB-2(ATCC CCL 120.1)、成人T細胞白血病衍生的MT-1(FCCH1043)和Lennert淋巴瘤衍生的KT-3(Shimizu，S.等人，血液(1988)71，196-203)，也可使用B細胞系，如EB病毒轉(zhuǎn)化的細胞CESS(ATCC TIB190)、EB病毒陽性B細胞SKW 6.4(ATCC TIB 215)、B淋巴瘤衍生的MC116(ATCC CRL 1649)、急性成淋巴細胞白血病衍生的CCRF-SB(ATCC CCL 120)、急性骨髓性白血病患者衍生的B細胞RPMI 6410(RCCH6047)、伯基特淋巴瘤衍生的Daudi(ATCC CCL 213)、伯基特淋巴瘤衍生的EB-3(ATCC CCL 85)、伯基特淋巴瘤衍生的Jijoye(ATCCCCL 87)和伯基特淋巴瘤衍生的Raji(ATCC CCL 86)，此外也可使用非T非B細胞系，如急性骨髓性白血病衍生的HL-60(ATCC CCL 240)、急性單核細胞白血病衍生的THP-1(ATCC TIB 202)、組織細胞淋巴瘤衍生的U-937(ATCC CRL 1593)、慢性骨髓性白血病衍生的K-562(ATCCCCL 243)、骨髓瘤衍生的RPMI8226(ATCC CCL 155)、骨髓瘤衍生的U266B1(ATCC TIB 196)、骨髓瘤衍生的KPMM2、骨髓瘤衍生的KPC-32和漿細胞瘤衍生的ARH-77(ATCC CRL 1621)。
用PBS(-)洗滌上述細胞后，向其中加入100μl用FACS緩沖液(含有2％胎牛血清和0.05％疊氮鈉的PBS(-))稀釋為25μg/ml的抗體或?qū)φ湛贵w，然后在冰上溫育30分鐘。用FACS緩沖液洗滌后，加入100μl25μg/ml FITC標記的山羊抗小鼠抗體(GAM，Becton Dickinson生產(chǎn))，然后在冰上溫育30分鐘。用FACS緩沖液洗滌后，將細胞懸浮于600μl的1ml FACS緩沖液中，用FACScan(Becton Dickinson生產(chǎn))測定每種細胞的熒光強度。
4.細胞毒性4-1.ADCC活性的測定本發(fā)明所用的抗體是具有如ADCC活性作為細胞毒性的抗體。
根據(jù)本發(fā)明，能用下列方法測定對淋巴腫瘤的ADCC活性。首先，用重力離心法從人外周血或骨髓中分離單核的細胞作為效應(yīng)細胞。
至于靶細胞(靶細胞T)，用51Cr標記RPMI8226(ATCC CCL-155)、CCRF-CEM(ATCC CCL 119)、(ATCC CCL 120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB-3(ATCC CCL-85)、MC116(ATCC CRL 1649)、CCRF-SB(ATCC CCL 120)、K-562(ATCC CCL 243)等，制備為靶細胞。隨后，向標記的靶細胞中加入準備測定ADCC活性的抗體并溫育。然后加入與靶細胞有適當比例的效應(yīng)細胞，并溫育。
溫育后，除去上清液，用γ計數(shù)器測定放射性，可用1％ NP-40進行最大游離放射性的測定。細胞毒性(％)能計算為(A-C)/(B-C)X 100，其中A是在抗體存在下釋放的放射性(cpm)，B是NP-40釋放的放射性(cpm)，C是不含抗體的培養(yǎng)基獨自釋放的放射性(cpm)。
4-2.細胞毒性的增強為了顯示細胞毒性如ADCC活性，優(yōu)選地使用Cγ(尤其是Cγ1和Cγ3)作為人抗體的恒定區(qū)(C區(qū))。此外，通過在抗體C區(qū)加入、改變或修飾部分氨基酸能誘導更強的ADCC活性或CDC活性。
通過以舉例方式，能述及通過氨基酸置換對IgG的IgM樣多聚體的構(gòu)建(Smith，R.I.F.和Morrison，S.L.，生物/技術(shù)(1994)12，683-688)、通過氨基酸添加對IgG的IgM樣多聚體的構(gòu)建(Smith，R.I.F.等人，免疫學雜志(1995)154，2226-2236)、串聯(lián)連接的編碼L鏈基因的表達(Shuford，W.等人，科學(1991)252，724-727)、通過氨基酸置換對IgG的二聚化(Carton，P.C.等人，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)(1992)176，1191-1195，Shopes，B.，免疫學雜志(1992)148，2918-2922)、通過化學修飾對IgG的二聚化(Wolff，E.A.等人，癌癥研究(1993)53，2560-2565)、通過改變抗體鉸鏈區(qū)中的氨基酸使效應(yīng)功能的引入(Norderhaug，L.等人，歐洲免疫學雜志(1991)21，2379-2384)，等等。其實現(xiàn)方法可通過使用引物的寡聚體位點特異誘變、使用限制酶酶切位點使堿基序列的添加，以及能產(chǎn)生共價鍵的化學調(diào)節(jié)物的應(yīng)用。
5.治療對象本發(fā)明提供一種抗體增強劑用于淋巴細胞腫瘤的治療，該抗體能特異結(jié)合具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有細胞毒性，該增強劑含有一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物作為活性成分。盡管治療對象是患有常見淋巴腫瘤的人類患者，但如下列實施例所述，顯然本發(fā)明也能用于具有降低的免疫功能的人類患者。此處使用的“降低的免疫功能”意思是細胞毒性如ADCC降低。
尤其，當在E/T比為50的條件下只發(fā)現(xiàn)ADCC活性低于25％的細胞毒性時，這是特別有利的。當通過施用抗癌劑等降低免疫功能時，發(fā)現(xiàn)ADCC活性低于25％。當測定上述ADCC活性時，培養(yǎng)時間(溫育時間)優(yōu)選地為4小時。作為一種測定ADCC活性的方法，Cr(鉻)釋放試驗或臺盼藍染色法是優(yōu)選的。
6.生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物本發(fā)明中作為活性成分含有的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(BRM)是一種具有激活免疫性活性的物質(zhì)。可用任何化合物作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，只要它能達到本發(fā)明的作用。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的優(yōu)選的實例包括干擾素、OK432、香菇多糖、西索菲蘭、抑胃肽、云芝多糖、N-CWS、左旋咪唑、G-CSF、IL-2、IL-10、IL-12或IL-15(Konnnitino Tiryoyaku(《今日治療性藥物》)(1995年版)，Yutaka Mizushima和Akimasa Miyamoto編，Nankodo K.K.，第17版第3次印刷，1995年6月20日發(fā)行；細胞因子94-Kisokara Saishin Johomade(《細胞因子94-從基礎(chǔ)到最新信息》)，Shinpei Kasakura編，Nihon Igakukan K.K.，第1版，1994年7月14日；Zusetsu Rinsho[Gan](臨床闡述[癌癥])，系列號19，(癌癥臨床進展)，Gan to Menneki(《癌癥與免疫》)(新版)醫(yī)學觀察K.K.，第二版(新版)，1993年8月31日發(fā)行)。其中，IL-2是特別優(yōu)選的。
這些生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物是在細胞毒性反應(yīng)中作用于效應(yīng)細胞，從而激活效應(yīng)細胞細胞毒性的物質(zhì)。這些生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物可以用公知的方法制備，并且可商業(yè)獲得。
7.施用途徑與藥物制備本發(fā)明的增強劑可以通過腸胃外途徑全身或局部施用，例如靜脈注射(如點滴)、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射和皮下注射。根據(jù)患者的年齡和病情能適當?shù)剡x擇施用方法。有效劑量選擇為每次施用每千克體重0.01mg-100mg。此外，也可選擇每名患者1-100mg優(yōu)選地5-50mg的劑量。對于生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，劑量選擇為每次施用1單位-1,000,000單位。
根據(jù)本發(fā)明，可以在向治療對象如腫瘤病人施用抗體之前或之后，施用能增強該抗體作用的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，只要它能增強抗體的作用即可，其中該抗體能特異結(jié)合具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并具有細胞毒性?；蛘撸芘c所述抗體同時施用。
根據(jù)本發(fā)明，所述抗體和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物不僅可以對腫瘤病人施用，而且可用于離體治療。于是，從患者外周血提取效應(yīng)細胞并用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物激活其免疫功能后，使效應(yīng)細胞返回患者?？梢栽谑剐?yīng)細胞返回患者之前或之后或同時施用抗體。本發(fā)明也可用于PBSCT(外周血干細胞的移植)的血漿分離置換。在PBSCT中，當返回提取的干細胞時可施用所述抗體和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物。
本發(fā)明包括如上所述的實施方案，只要所述抗體與生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的聯(lián)合應(yīng)用能增強其作用。
本發(fā)明的增強劑可以含有藥學可接受的載體或添加劑，這取決于施用途徑。這些載體或添加劑的實例包括水、藥學可接受的有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯多聚體、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯樹膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、雙甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、藥學可接受的表面活性劑等等。所用的添加劑可選擇為但不限于上述物質(zhì)或其組合，這取決于劑型。
本發(fā)明治療的目標疾病是淋巴細胞腫瘤，其中用于本發(fā)明的抗體在靶腫瘤細胞上與抗原結(jié)合。具體而言，多發(fā)性骨髓瘤、急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴細胞白血病(B-CLL)、前B淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、濾泡性大腦皮質(zhì)淋巴瘤、彌漫性淋巴瘤、急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)、慢性T淋巴細胞白血病(T-CLL)、成人T細胞白血病(ATL)、非ATL外周T淋巴瘤(PNTL)，等等。本發(fā)明的增強劑可用作這些淋巴細胞腫瘤的治療的增強劑。實施例現(xiàn)在將參照下列實施例在下文中更詳細地闡述本發(fā)明。然而應(yīng)當指出，本發(fā)明不以任何方式受這些實施例的限制。實施例ADCC活性的測定ADCC(抗體依賴細胞的細胞毒性)活性按照《免疫學常用方案》第7章，“人類的免疫研究”，編者Johan E，Coligan等人，John Wiley & Sons，Inc.，1993所述的方法測定。
1.效應(yīng)細胞的制備用密度離心法從健康人和多發(fā)性骨髓瘤患者的外周血或骨髓中分離單核細胞。然后，向健康人和多發(fā)性骨髓瘤患者的外周血和骨髓中加入等量的PBS(-)，它在Ficoll(Pharmacia生產(chǎn))-Conrey(DaiichiPharmaceutical Co.Ltd.生產(chǎn))(比重1.077)上分層，以400g離心30分鐘。收集單核細胞層后，用補充了10％胎牛血清(Witaker生產(chǎn))的RPMI1640(Sigma生產(chǎn))洗兩次，向細胞中加入或不加入(只有培養(yǎng)基)500U/mlIL-2(Genzyme生產(chǎn))、20ng/ml IL-10(Genzyme生產(chǎn))、20ng/ml IL-12(R&D生產(chǎn))、20ng/ml IL-15(Genzyme生產(chǎn))或5000U/ml M-CSF(GreeCross K.K.生產(chǎn))，培養(yǎng)3天。用相同培養(yǎng)基洗滌每種培養(yǎng)物兩次后，用相同培養(yǎng)液制備細胞密度為5×106/ml的細胞。
2.靶細胞的制備放射性標記人骨髓瘤細胞系RPMI 8226(ATCC CCL 155)，方法是在補充有10％胎牛血清(Witaker生產(chǎn))的RPMI 1640(Sigma生產(chǎn))中與0.1mCi51Cr-鉻酸鈉一起37℃溫育60分鐘。放射性標記后，用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗細胞三次，并調(diào)節(jié)為2×105/ml的濃度。
3.ADCC測定向96孔U底平板(Corning生產(chǎn))中加入50μl 2×105個靶細胞/ml、1μg/ml親和純化的人源化抗-HM1.24抗體或?qū)φ杖薎gG(Serotec生產(chǎn))，在4℃下反應(yīng)15分鐘。
然后，加入100μl 5×105個效應(yīng)細胞/ml，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，其中效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)的比值(E∶T)設(shè)定為50∶1。
取出100μl上清液，用γ計數(shù)器(ARC361，Aloka生產(chǎn))測定釋放到培養(yǎng)上清液中的放射性。對于最大放射性的測定，使用1％的NP-40(BRL生產(chǎn))。根據(jù)(A-C)/(B-C)×100計算細胞毒性(％)，其中A是在抗體存在下釋放的放射性(cpm)，B是NP-40釋放的放射性(cpm)，C是不含抗體的培養(yǎng)液單獨釋放的放射性(cpm)。
結(jié)果，當用來源于健康人外周血的細胞作為效應(yīng)細胞時，人源化抗-HM1.24抗體對RPMI8226細胞顯示強細胞毒性，而對照IgG幾乎不顯示細胞毒性(圖1)。當用來源于免疫功能降低的多發(fā)性骨髓瘤患者的細胞作為效應(yīng)細胞時，人源化抗-HM1.24抗體對RPMI8226細胞顯示細胞毒性，而對照IgG幾乎不顯示細胞毒性(圖2)。
然而，該活性弱于上述健康人中的活性(低于25％)。當加入IL-2、IL-10、IL-12或IL-15時，人源化抗-HM1.24抗體的細胞毒性增強。尤其對于IL-2，活性增強至幾乎與健康人相等的水平(圖2)。
此外，當來源于用大劑量環(huán)磷酰胺治療的骨髓瘤患者、經(jīng)受血漿分離置換的細胞作為效應(yīng)細胞時，人源化抗-HM1.24抗體對RPMI8226細胞顯示細胞毒性，而對照IgG幾乎不顯示細胞毒性(圖3)。然而，該活性弱于上述健康人中的活性(低于25％)。當加入IL-2、IL-10或IL-12時，人源化抗-HM1.24抗體的細胞毒性增強(圖3)。
這表明人源化抗-HM1.24抗體對腫瘤細胞(它們是來源于免疫功能降低的患者的效應(yīng)細胞)的細胞毒性增強弱于來源于正常人或免疫功能未降低的患者的效應(yīng)細胞。通過加入BRM如IL-2，能增強效應(yīng)細胞的細胞毒性，甚至達到健康人的水平。
因此，當對免疫功能降低的患者體內(nèi)或離體施用人源化抗-HM1.24抗體時，BRM的聯(lián)合應(yīng)用預(yù)計將進一步增強抗腫瘤作用。同樣，當對患者(其經(jīng)歷了將在外周血干細胞移植時經(jīng)受血漿分離置換的細胞返回該患者)體內(nèi)或離體地施用人源化抗-HM1.24抗體時，BRM的聯(lián)合應(yīng)用預(yù)計將進一步增強抗腫瘤作用。
參考實施例1.產(chǎn)生小鼠抗-HM1.24單克隆抗體的雜交瘤的制備按照Goto，T.等人，血液(1994)84，1992-1930的方法，制備產(chǎn)生小鼠抗-HM1.24單克隆抗體的雜交瘤。
每6周向BALB/c小鼠(Charles River生產(chǎn))的腹腔中注射兩次來源于人多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓的漿細胞系KPC-32(1×107個細胞)(Goto，T.等人，日本臨床血液學雜志(1991)32，1400)。
殺死動物之前三天，向小鼠脾臟注射1.5×106個KPC-32，以進一步提高小鼠的抗體產(chǎn)生能力(Goto，T.等人，Tokushima實驗醫(yī)學雜志(1990)37，89)。殺死動物后，取出脾臟，并按照Groth，de St.和Schreidegger(癌癥研究(1981)41，3465)的方法將取出的器官與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合。
通過應(yīng)用KPC-32的細胞ELISA(Posner，M.R.等人，免疫學方法雜志(1982)48，23)，篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體。將5×104個KPC-32懸浮于50ml PBS中，然后等分至96孔培養(yǎng)板中(U底，Corning，Iwaki生產(chǎn))，在37℃下風干過夜。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉后，加入雜交瘤的培養(yǎng)上清液，在4℃下溫育2小時。然后，與過氧化物酶標記的抗小鼠IgG山羊抗體(Zymed生產(chǎn))在4℃下反應(yīng)1小時。洗滌后，在室溫下與鄰苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite生產(chǎn))反應(yīng)30分鐘。
加入2N硫酸終止反應(yīng)，用ELISA酶標儀(Bio-Rad生產(chǎn))測定492nm的吸光度。為了除去產(chǎn)生抗人免疫球蛋白抗體的雜交瘤，預(yù)先向人血清吸附陽性雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并用ELISA篩選與其它細胞系的反應(yīng)性。挑選出陽性雜交瘤，用流式細胞術(shù)研究其與多種細胞的反應(yīng)性。將最后選出的雜交瘤集落克隆兩次，注射到降植烷處理的BALB/c小鼠的腹腔中，從中獲得腹水。
用硫酸銨沉淀法和A蛋白親和層析試劑盒(Ampure PA，Amersham生產(chǎn))由小鼠的腹水純化單克隆抗體。用Quick Tag FITC結(jié)合試劑盒(Boehringer Mannheim生產(chǎn))以FITC標記純化的抗體。
結(jié)果，由30個雜交瘤集落產(chǎn)生的單克隆抗體與KPC-32和RPMI 8226反應(yīng)?？寺『螅芯窟@些雜交瘤的培養(yǎng)上清液與其它細胞系或外周血單核細胞的反應(yīng)性。
其中，3個克隆是可與漿細胞特異反應(yīng)的單克隆抗體。這3個克隆中，篩選出對于流式細胞分析最有用、并且對RPMI 8226具有CDC活性的雜交瘤克隆，命名為HM1.24。通過ELISA用亞類特異的抗小鼠兔抗體(Zymed生產(chǎn))測定該雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的亞類?？?HM1.24抗體有IgG2aκ亞類。產(chǎn)生抗-HM1.24抗體的雜交瘤HM1.24于1995年9月14日由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba市，Ibaraki pref.，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏，保藏號為FERM BP-5233。參考實施例2.人源化抗-HM1.24抗體的制備人源化抗-HM1.24抗體是按照國際專利申請WO 98-14580所述的方法獲得的。
用常規(guī)方法從參考實施例1中制備的雜交瘤HM1.24中制備總RNA。由此合成編碼小鼠抗體V區(qū)的cDNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法和5’-RACE法擴增。獲得含有編碼小鼠V區(qū)的基因的DNA片段，與每種質(zhì)粒pUC克隆載體相連接，然后將其引入感受態(tài)大腸桿菌細胞中，獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中獲得上述質(zhì)粒。用常規(guī)方法測定質(zhì)粒中cDNA編碼區(qū)的堿基序列，并確定每一V區(qū)的互補決定區(qū)(CDR)。
為了構(gòu)建表達嵌合抗-HM1.24抗體的載體，將編碼小鼠抗-HM1.24抗體每一L鏈和H鏈V區(qū)的cDNA插入HEF載體中。此外，為了構(gòu)建人源化抗-HM1.24抗體，通過CDR移植法將小鼠抗-HM1.24抗體V區(qū)CDR移植到人抗體中。用人抗體REI的L鏈作為人抗體的L鏈，對于構(gòu)架區(qū)(FR)1-3，用人抗體HG3的FR1-3作為人抗體的H鏈，人抗體JH6的FR4用于FR4。替換H鏈V區(qū)FR中的氨基酸，使得CDR移植的抗體能夠形成合適的抗原結(jié)合位點。
為了在哺乳動物細胞中表達這樣構(gòu)建的人源化抗-HM1.24抗體L鏈和H鏈的基因，將每種基因分開引入HEF載體中，分別構(gòu)建表達人源化抗-HM1.24抗體L鏈或H鏈的載體。
通過向CHO細胞中同時引入這兩種表達載體，建立產(chǎn)生人源化抗-HM1.24抗體的細胞系。通過細胞ELISA，研究經(jīng)培養(yǎng)人羊膜細胞系WISH獲得的人源化抗-HM1.24抗體對該細胞系的抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性。結(jié)果表明，人源化抗-HM1.24抗體具有與嵌合抗體相等的抗原結(jié)合活性，至于使用生物素化小鼠抗-HM1.24抗體研究的結(jié)合抑制活性，它具有與嵌合抗體或小鼠抗體相等的活性。
順便提到，攜帶含有嵌合抗-HM1.24抗體L鏈或H鏈的質(zhì)粒的大腸桿菌已經(jīng)于1996年8月29日由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏，分別為大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)，保藏號分別為FERMBP-5646和FERM BP-5644。
此外，攜帶含有人源化抗-HM1.24抗體L鏈a型和H鏈r型的質(zhì)粒的大腸桿菌已經(jīng)于1996年8月29日由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏，分別為大腸桿菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)，保藏號分別為FERM BP-5645和FERM BP-5643。此外，攜帶含有人源化抗-HM1.24抗體H鏈s型的質(zhì)粒的大腸桿菌已經(jīng)于1997年9月29日由國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki pref.，日本，按布達佩斯條約的規(guī)定進行國際保藏為大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)，保藏號為FERM BP-6127。參考實施例3.編碼HM1.24抗原蛋白質(zhì)的cDNA的克隆1.cDNA文庫的構(gòu)建1)總RNA的制備如下所述克隆可被小鼠抗-HM1.24抗體特異識別的編碼HM1.24抗原蛋白質(zhì)的cDNA。
按照Chirgwin等人(生物化學18，5294(1979))的方法從人多發(fā)性骨髓瘤細胞系KPMM2中制備總RNA。然后，在20ml 4M硫氰酸胍(Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn))中充分勻漿化2.2×108個KPMM2。
在離心管中將勻漿物層加于5.3M氯化銫溶液上，然后于20℃在Beckman SW40轉(zhuǎn)頭中以31,000轉(zhuǎn)每分離心24小時，沉淀RNA。用70％乙醇洗滌沉淀，然后溶解于300μl含1mM EDTA和0.5％ SDS的10mMTris-HCl(pH7.4)中。加入鏈霉蛋白酶(Boehringer生產(chǎn))至濃度為0.5mg/ml，然后在37℃下溫育30分鐘。用酚和氯仿抽提該混合物，用乙醇沉淀RNA。然后將RNA沉淀溶解于200μl含1mM EDTA的10mMTris-HCl(pH7.4)中。
2)poly(A)+RNA的制備使用Fast Track 2.0mRNA分離試劑盒(Invitrogen生產(chǎn))，按照該試劑盒所附的方案，以如上所述制備的500μg總DNA作為原料，純化poly(A)+RNA。
3)cDNA文庫的構(gòu)建使用cDNA合成試劑盒TimeSaver cDNA合成試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))，按照該試劑盒所附的方案，以10μg上述poly(A)+RNA作為原料，合成雙鏈cDNA，然后進一步按照該試劑盒所附的方案，用DirectionalCloning Toolbox(Pharmacia生產(chǎn))將其與該試劑盒提供的EcoRI接頭連接。按照試劑盒所附方案進行EcoRI接頭的kination和限制酶NotI處理。此外，用1.5％低熔點瓊脂糖凝膠(Sigma生產(chǎn))分離并純化大小約為500bp或更大的添加接頭的雙鏈cDNA，獲得大約40μl添加接頭的雙鏈cDNA。
用預(yù)先以限制酶EcoRI和NotI及堿性磷酸酶(Takara Shuzo生產(chǎn))處理的pCOS1載體和T4 DNA連接酶(GIBCO-BRL生產(chǎn))連接這樣構(gòu)建的添加接頭的雙鏈cDNA，以構(gòu)建cDNA文庫。使構(gòu)建的cDNA文庫轉(zhuǎn)導大腸桿菌DH5α株(GIBCO-BRL生產(chǎn))，隨后估計大約2.5×106總大小的獨立克隆。質(zhì)粒pCOS1的構(gòu)建方法是，用EcoRI和SmaI消化表達載體HEF-PMh-gγ1(參見國際專利申請WO 92-19759)，刪除所含的DNA，并且將其與EcoRI-NotI-BamHI接頭(Takara Shuzo生產(chǎn))連接。
2.通過直接表達法的克隆1)對COS-7細胞的轉(zhuǎn)染在含有50μg/ml氨芐青霉素的2-YT培養(yǎng)基(《分子克隆實驗室手冊》，Sambrook等人，冷泉港實驗室出版社(1989))中培養(yǎng)大約5×105個上述轉(zhuǎn)導的大腸桿菌克隆，擴增cDNA，進行堿裂解法(《分子克隆實驗室手冊》，Sambrook等人，冷泉港實驗室出版社(1989))從大腸桿菌中回收質(zhì)粒DNA。使用基因脈沖發(fā)生裝置(Bio-Rad生產(chǎn))通過電穿孔法使這樣獲得的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS-7細胞。
然后，將10μg純化的質(zhì)粒DNA加入0.8ml COS-7細胞溶液中，其中細胞已經(jīng)以1×107細胞/ml懸浮于PBS中，并且對該混合物施以1500V和25μFD電容的脈沖。在室溫下恢復10分鐘后，將電穿孔的細胞在含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL生產(chǎn)的)DMEM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))中在37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)3天。
2)淘選皿的制備按B.Seed等人(美國國家科學院院報，84，3365-3369(1987))的方法制備包被有小鼠抗-HM1.24抗體的淘選皿。然后，向50mM Tris-HCl(pH9.5)中加入小鼠抗-HM1.24抗體至濃度為10μg/ml.向直徑60mm的細胞培養(yǎng)皿中加入3毫升這樣制備的抗體溶液，在室溫下溫育2小時。用0.15M NaCl溶液洗滌三次后，向培養(yǎng)皿中加入含有5％胎牛血清、1mMEDTA和0.02％ NaN3的PBS。封閉后，用于進行下列克隆。
3)cDNA文庫的克隆用含有5mM EDTA的PBS裂解如上所述轉(zhuǎn)染的COS-7細胞。以含有5％胎牛血清的PBS洗滌細胞一次后，將其懸浮于含5％胎牛血清和0.02％ NaN3的PBS中，至濃度約為1×106細胞/ml。將懸液加入如上所述制備的淘選皿中，在室溫下溫育2小時。以含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS輕洗三次后，用含有0.6％ SDS和10mM EDTA的溶液從與淘選皿結(jié)合的細胞中回收質(zhì)粒DNA。
使回收的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)導大腸桿菌DH5α。如上所述擴增后，用堿裂解法回收質(zhì)粒DNA。通過電穿孔法使回收的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS-7細胞，從如上所述結(jié)合的細胞中回收質(zhì)粒DNA。重復一次類似步驟，用限制酶EcoRI和NotI消化回收的質(zhì)粒DNA，從而確定大小約為0.9kbp的插入片段的濃度。此外，將一部分回收質(zhì)粒DNA已被轉(zhuǎn)導的大腸桿菌細胞接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2-YT瓊脂平板上。過夜培養(yǎng)后，從單菌落中回收質(zhì)粒DNA。用限制酶EcoRI和NotI消化，獲得克隆p3.19，其中插入片段的大小約為0.9kbp。
用PRISM染料終止循環(huán)測序試劑盒(Perkin Elmer生產(chǎn))，按照試劑盒所附方案對該克隆反應(yīng)，用ABI 373A DNA測序儀(Perkin Elmer制造)測定其堿基序列。該堿基序列及相應(yīng)的氨基酸序列示于SEQ IDNO1中。
工業(yè)實用性通過聯(lián)合使用抗-HM1.24抗體和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，尤其ADCC活性降低的效應(yīng)細胞的細胞活性得到提高。這表明抗-HM1.24抗體與生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的聯(lián)合應(yīng)用導致對淋巴細胞腫瘤的抗腫瘤作用的增強。
參考按專利合作條約細則13-2保藏的微生物，以及保藏單位的名稱。保藏單位名稱國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學與技術(shù)機構(gòu)地址1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本生物(1)名稱大腸桿菌DH5α(pRS38-pUC19)保藏號FERM BP-4434保藏日期1993年10月5日生物(2)名稱小鼠-小鼠雜交瘤HM1.24保藏號FERM BP-5233保藏日期1995年4月27日生物(3)名稱大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)保藏號FERM BP-5643保藏日期1996年8月29日生物(4)名稱大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)保藏號FERM BP-5644保藏日期1996年8月29日生物(5)
名稱大腸桿菌DH5α(pUC19-RVLa-AHN-gκ)保藏號FERM BP-5645保藏日期1996年8月29日生物(6)名稱大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)保藏號FERM BP-5646保藏日期1996年8月29日生物(7)名稱大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)保藏號FERM BP-6127保藏日期1997年9月29日序列表SEQ ID NO1序列長度1013序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA序列GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys1 5AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10 15 20 25ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG 145Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu30 35 40ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT 193Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu45 50 55CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG 241Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu60 65 70CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC 289Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala75 80 85ACC TGC AAC CAC ACT GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG 337Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu90 95 100 105AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT 385Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr110 115 120ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG 433Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu125 130 135AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC 481Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr140 145 150TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG 529Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu155 160 165ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln170 175 180AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC635TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG695GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT GTGGGGACAC755AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC815TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT875TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA935AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA995AAAATTCGGG CGGCCGCC 1013SEQ ID NO2序列長度379序列類型核酸拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA序列ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly-15 -10 -5GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala-1 15 10AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG 144Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val15 20 25AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys30 35 40 45CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA 240Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg50 55 60TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser65 70 75CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT 336Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser80 85 90ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C379Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105SEQ ID NO3序列長度418序列類型核酸拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA序列ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120SEQ ID NO4序列長度418序列類型核酸拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA序列ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120
權(quán)利要求
1.一種用于淋巴細胞腫瘤治療的抗體增強劑，該抗體能特異結(jié)合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并具有細胞毒性，該增強劑含有一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物作為活性成分。
2.一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的增強劑，用于淋巴細胞腫瘤的治療，該增強劑含有一種抗體作為活性成分，該抗體能特異結(jié)合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并具有細胞毒性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的增強劑，其中淋巴細胞腫瘤是T細胞腫瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的增強劑，其中淋巴細胞腫瘤是B細胞腫瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的增強劑，其中B細胞腫瘤是骨髓瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的增強劑，其中抗體是單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的增強劑，其中細胞毒性是ADCC活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的增強劑，其中抗體具有人抗體的恒定區(qū)Cγ。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的增強劑，其中人抗體的恒定區(qū)Cγ是Cγ1或Cγ3。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的增強劑，其中抗體是抗-HM1.24抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的增強劑，其中抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的增強劑，其中抗體是嵌合抗-HM1.24抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的增強劑，其中抗體是人源化抗-HM1.24抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項的增強劑，其中該抗體能特異結(jié)合可被抗-HM1.24抗體識別的表位。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項的增強劑，其中生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物是干擾素、OK432、香菇多糖、西索菲蘭、抑胃肽、云芝多糖、N-CWS、左旋咪唑、G-CSF、IL-2、IL-10或IL-15。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任意一項的增強劑，其中該抗體具有細胞毒性，在E/T比為50的條件下ADCC活性低于25％。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的增強劑，其中ADCC活性用Cr(鉻)釋放試驗來測定。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任意一項的離體使用的增強劑。
19.一種用于淋巴細胞腫瘤的治療劑，該藥劑含有一種抗體和一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，該抗體能特異結(jié)合具有如SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并具有細胞毒性。
全文摘要
一種用于淋巴細胞腫瘤治療的抗體增強劑,該抗體能特異結(jié)合具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì),并具有細胞毒性,該增強劑含有一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物作為活性成分。
文檔編號A61K45/00GK1275917SQ98810167
公開日2000年12月6日 申請日期1998年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月14日
發(fā)明者小阪昌明, 小石原保夫 申請人:中外制藥株式會社