專利名稱：抗原特異性活化t淋巴細胞，其檢測和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引起自體免疫反應的肽、這些肽與主要組織相容性復合物(MHC)分子的復合物、與這些肽或/和肽和MHC的分子的復合物反應的T細胞亞群，以及這些化合物的診斷和治療用途。
近年來在自體免疫疾病如風濕性關(guān)節(jié)炎和青年期糖尿病(IDDM)的發(fā)展過程的分子間相互作用關(guān)系的探索方面進展迅速，同時揭示了這種探索在這些疾病的早期診斷和病因治療中的實際應用。
現(xiàn)在可以肯定，在這些疾病的發(fā)展中除遺傳傾向外，環(huán)境因素也起作用。例如在IDDM中，在遺傳危險因素方面，只有幾個MHCⅡ型抗原的等位基因與該疾病密切相關(guān)。因此，可能通過分析這些等位基因確定IDDM的高危人群(參見，如Thomson等，Am.J.Hum.Genet.43(1988)，799-816，或Todd等，Nature 329(1987)，599-604)。
在IDDM發(fā)展中涉及的環(huán)境因素可能是作為免疫原的外源性肽序列。關(guān)于這一點還討論了病毒性抗原，其與內(nèi)源性結(jié)構(gòu)有部分同源性。在特別的情形下，特別是產(chǎn)后時期，通過食物吸收的抗原如牛血清白蛋白可產(chǎn)生免疫反應，由于與內(nèi)源性結(jié)構(gòu)的同源性，此免疫反應可引發(fā)自身攻擊過程。
胰島β細胞被細胞毒性淋巴細胞逐步破壞在IDDM病程中是很典型的。此過程在出現(xiàn)葡萄糖代謝明顯失調(diào)前很長時間就開始了。當出現(xiàn)可檢測的糖尿病表現(xiàn)時，90%以上的β細胞已被破壞。因此，為了對感染者提供病因治療，在高險人群中早期檢測這些自身攻擊T細胞就非常重要。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在自身免疫疾病中對內(nèi)源性組織的破壞在開始進行得非常慢。在此過程的起始階段，自身攻擊T細胞可能僅識別一個或幾個自身抗原。Kaufman等(Nature 368(1993)，69-72)和Tisch等(Nature 368(1993)，72-78)在Ⅰ型糖尿病的動物模型(NOD鼠)方面的工作表明，在此鼠系中自發(fā)糖尿病的實例中，起始T細胞介導的自身免疫反應定向于谷氨酸脫羧酶。在此情形中，在NOD鼠中開始時只有谷氨酸脫羧酶(GAD)C末端的1-2個表位被識別。在此時還不可能檢測到葡萄糖代謝的變化(如上所述)，但已可以檢測到胰島周炎(perinsulitis)。只是在該病的進展期，自身攻擊性T細胞識別的GAD肽譜才擴大。糖尿病變得明顯后，還可能檢測到抗其它胰島細胞抗原如peripherin、熱休克蛋白HSP65和羧肽酶H的預活化T細胞。
有證據(jù)表明在人體中Ⅰ型糖尿病發(fā)展的病因還與對GAD的免疫反應有關(guān)。例如，在80%以上的前驅(qū)糖尿病患者中可以檢測到抗GAD自身抗體，但據(jù)認為這些自體抗體的病因?qū)W作用小。相反，認為在Ⅰ型糖尿病中存在著T淋巴細胞逐步破壞胰島β細胞的過程。這些定向于GAD的T淋巴細胞已被幾個研究組檢測到(Harrison等，J.CLin.Invest，89(1992)，1161;Honeyman等，J.Exp，Med.177(1993)，535)。這些研究組發(fā)現(xiàn)的自身抗體與由GAD 67kd分子的208-404氨基酸組成的肽片段反應。
EP-A-0519469中公開了一些來自人GAD 65kd分子且能引起自身免疫反應的多肽。這些多肽的氨基酸序列為X-P-E-V-K-(T或E)-K-Z其中X代表由1-10個氨基酸組成的任選序列，Z代表由1-8個氨基酸組成的任選序列。
本發(fā)明的目的是提供新的自身反應性肽，它與Ⅰ型糖尿病人的T細胞反應，特別是與最近發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型糖尿病人的T細胞反應，并這樣確定早期自身-表位。
本發(fā)明的目的是通過適合于對自身反應性T細胞進行檢測、分離、增殖、無反應化或/和消除的肽、肽衍生物或可發(fā)生類似結(jié)合的分子來達到的。因此，本發(fā)明的主題為包括下列氨基酸序列的肽或肽衍生物(a)氨基酸序列(Ⅰ)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A，
(b)氨基酸序列(Ⅱ)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K，(c)

圖1或2所示的任何一種氨基酸序列，(d)至少6個氨基酸長度的在(a)、(b)或/和(c)所示氨基酸序列中存在的部分區(qū)域，或/和(e)具有與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力基本相當于(a)、(b)、(c)或/和(d)中所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
本發(fā)明的肽或肽衍生物優(yōu)選包括(a)氨基酸序列(Ⅰ)，(b)氨基酸序列(Ⅱ)，(c)氨基酸序列(Ⅰ)或/和(Ⅱ)的部分區(qū)域，或/和(d)具有與(a)、(b)或/和(c)中氨基酸序列基本相當?shù)?，與MHC分子結(jié)合的特異性或/親合力的氨基酸序列。
本發(fā)明的肽或肽衍生物優(yōu)選含有氨基酸序列(Ⅰ)的部分區(qū)域L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F或由此衍生物的保留N-末端L-P序列和C-末端H-F序列的序列。
氨基酸序列(Ⅰ)相當于人體GAD 65的氨基酸殘基266-290，氨基酸序列(Ⅱ)相當于人GAD65的氨基酸序列306-325。圖1和2所示氨基酸序列也是人GAD65的部分序列。
令人驚異地發(fā)現(xiàn)，相當于人GAD65的氨基酸序列266-285和306-325的肽特異性地與從最近發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型糖尿病人中分離到的T細胞亞群反應。因此，本發(fā)明的肽為早期自身一表位，可用于Ⅰ型糖尿病非常早期的診斷。另外，本發(fā)明的肽還可通過滅活與此肽反應的T細胞群而用于治療。
與具有氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)的本發(fā)明肽發(fā)生反應的T細胞亞群的優(yōu)選實例為T細胞系6/7和6/10，或具有相當?shù)慕Y(jié)合特異性的T細胞。T細胞系6/7和6/10已按照Budapest條約的規(guī)定，以保藏號DSM ACC 2172(6/7)和DSM ACC 2173(6/10)，于1994年5月10日在“Deutche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”(DSM)Mascheroder Wey 1b，38124Braunschweig，Germany保藏。
氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)為人谷氨酸脫羧酶(GAD)的65kd異構(gòu)體的部分區(qū)域，其完整氨基酸序列已由Bu等描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，2115ff)。氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)是這樣發(fā)現(xiàn)的從Ⅰ型糖尿病人外周血液建立T細胞系，然后用來自豬腦的GAD體外刺激，再用衍生自人GAD序列的合成肽序列在增殖試驗中測試這些T細胞系。
本發(fā)明的肽可用熟知的合成方法用化學方法制得，或通過將編碼這些肽的DNA序列在適合的宿主細胞中(特別是大腸桿菌)克隆和表達，用遺傳工程方法制得。
另外，本發(fā)明還包括具有上述特別說明的氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)或圖1和2所示氨基酸序列的部分區(qū)域的肽，其長度至少為6個氨基酸，優(yōu)選至少8個氨基酸，特別優(yōu)選至少10個氨基酸，最優(yōu)選至少15個氨基酸。
本發(fā)明肽的最小長度取決于其識別MHC分子、特異性地與其結(jié)合并與相應的T細胞受體反應的能力。
本發(fā)明肽中衍生自GAD并與MHC結(jié)合的區(qū)域最大長度優(yōu)選為100個氨基酸，特別優(yōu)選50個氨基酸，最優(yōu)選25個氨基酸。
除具有氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)或其部分區(qū)段的肽外，本發(fā)明還涉及包含有與上述序列基本相當?shù)呐cMHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的氨基酸序列的肽，其優(yōu)選從氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)或可發(fā)生類似結(jié)合的異源性物質(zhì)中通過取代、缺失或插入個別氨基酸殘基或氨基酸殘基短片段衍生而來的肽。
本發(fā)明還特別涉及這樣的肽變異體其序列與上述氨基酸序列不完全相同，但有相同的或密切相關(guān)的“錨位”(anchor position)。此處的專有名詞“錨位”指與MHC分子，特別是與DR3、DR4或DQ型的MHC分子結(jié)合所必需的氨基酸殘基。例如Hemmer等，在Cell 74(1993)，197-203中給出了與DRB10401發(fā)生起動結(jié)合的“錨位”。在本發(fā)明的肽中這種“錨位”得到保留，或用任選具有化學上密切相關(guān)的側(cè)鏈的氨基酸殘基代替相應的氨基酸殘基(如，纈氨酸代替丙氨酸、異亮氨酸代替亮氨酸，反之亦然)?？捎煤唵畏椒ù_定本發(fā)明肽中的錨位即檢驗上述特異肽的變異體與MHC分子結(jié)合的能力。本發(fā)明的肽，其特征在于它們具有與上述肽基本相當?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力。從具有氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)的肽或從圖1和2所示氨基酸序列衍生所得肽，優(yōu)選與母肽或其部分序列具有至少30%的序列同源性，特別優(yōu)選至少50%，最優(yōu)選至少有60%的同源性的肽。
這種已明確定義的肽的變異體的實例為來自人GAD67的相應的同類肽片段，其完整氨基酸序列也已由Bu等，同上描述。
專用詞“與MHC分子結(jié)合的基本相當?shù)奶禺愋曰?和親合力”還包括與氨基酸序列(Ⅰ)、(Ⅱ)或圖1和2所示氨基酸序列相比更高的特異性或/和親合力，這具體可在優(yōu)選長度為8-15個氨基酸的肽片段的例子中見到。
另外，本發(fā)明還包括肽衍生物。此用語包括其中一個或幾個氨基酸已通過化學反應衍生的肽。本發(fā)明所指的肽衍生物的例子具體為其中骨架或/和反應性氨基酸側(cè)基如游離氨基、游離羧基或/和游離羥基被衍生的那些分子。氨基衍生物的具體例子為磺酸或羧酸酰胺、硫代氨基甲酸乙酯衍生物和銨鹽如鹽酸鹽。羧基衍生物的例子為鹽、酯和酰胺。羥基衍生物的例子為O-酰基或O-烷基衍生物。另外，本發(fā)明的肽衍生物還包括其中一個或幾個氨基酸被20個“標準”氨基酸的天然或非天然氨基酸同系物所代替的那些肽。這種同系物的例子有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。
特別優(yōu)選這樣的肽它們具有與氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)的肽基本相當?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力，但與后者相反，它們不會使T細胞活化，但卻在T細胞中造成無反應性狀態(tài)。
本發(fā)明還包括這樣的多肽其中與MHC結(jié)合的肽片段為更大多肽單元的組分，在這個大多肽單元中，與MHC結(jié)合的肽與多肽單元其余部分之間最好具有預定的斷裂點，如蛋白酶裂解點。
本發(fā)明的另一個主題是那些帶有能發(fā)出信號的物質(zhì)或標記基團的肽或肽衍生物，標記基團，例如有熒光標記基團(如若丹明、藻紅蛋白)、地高辛、生物素、放射性基團或毒性基團(如，蓖麻蛋白、霍亂毒素等)。本發(fā)明的肽與標記基團偶聯(lián)使得肽能夠用作體內(nèi)或體外(如成像)的診斷試劑或用作治療試劑。另外，本發(fā)明的肽還能以例如環(huán)化形式或寡聚形式存在，在這幾種形式中，那些在與MHC分子結(jié)合中具有重要作用的序列被間隔區(qū)分離。
本發(fā)明還涉及那些與前述肽或肽衍生物具有基本相當?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的肽模擬物。肽模擬物可以代替肽與MHC分子相互作用，并且與原肽相比，它們的代謝穩(wěn)定性增加、生物利用度提高以及作用時間延長。肽模擬物的產(chǎn)生方法由Giannis和Kolter在“Angew.Chem.”、105(1993)，1303-1326中，Lee等在Bull.Chem.Soc.Jpn.66(1993)，2006-2010中，及Dorsch等在“Kontakte”(Darmstadt)(1993)(2)，48-56中作了描述。參考這些文獻中公開的關(guān)于本發(fā)明肽模擬物的制備。
另外，本發(fā)明還涉及含有至少一種本發(fā)明的肽、肽衍生物或肽模擬物和至少一種MHC分子或MHC分子的肽結(jié)合衍生物的復合物。在此復合物中，肽、肽衍生物或肽模擬物與MHC分子或MHC分子的肽結(jié)合衍生物結(jié)合，結(jié)合常數(shù)優(yōu)選為至少10-7l/mol，特別優(yōu)選為10-8-10-9l/mol。另外，肽、肽衍生物或肽模擬物還可與MHC分子共價連結(jié)，例如通過光聯(lián)劑或共價遺傳肽-MHC融合。這樣的肽-MHC融合蛋白優(yōu)選含有HLA-DRβ鏈和遺傳融合到其上的自身反應性肽的融合蛋白。該復合物特別優(yōu)選含有MHCⅡ型分子或其肽結(jié)合衍生物。
MHCⅡ型分子優(yōu)選為DR型，例如DR1、DR2、DR3或DR4型。MHCⅡ型分子特別優(yōu)選為DR B1 101、DR B1 0301、DR B1 0401、DR B1 0402、DR B1 0404或DR B1 1601亞型。最優(yōu)選DR B1 0101或DR B1 0401亞型的MHCⅡ型分子。T細胞系6/7(DSM ACC2172)在DR B1等位基團0401和0101或/和1601存在下，在含有氨基酸序列(Ⅰ)的自身反應性肽的刺激下增殖。發(fā)現(xiàn)它在DR B1等位基團0401存在下，在含有氨基酸序列(Ⅱ)的自身反應性肽的刺激下增殖。T細胞系6/10(DSM ACC2173)在DR B1等位基團0401存在下，在含有氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)的自身反應性肽的刺激下增殖。
編碼上述MHCⅡ型分子的亞型的基團的核苷酸序列公開在Corell等(Mol.Immunol.28(1991)，533-543)中。此處可參考這些文獻。
“MHC分子的肽結(jié)合衍生物”包括天然MHC分子通過蛋白水解裂解或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的MHC分子的片段，其基本保留了它們的肽結(jié)合特性。另外此用語還應理解為包括除與肽結(jié)合有關(guān)的MHC部分外還含有另外的多肽組分的融合蛋白。
本發(fā)明的肽-MHC復合物優(yōu)選通過無肽MHC分子或MHC分子衍生物與本發(fā)明的肽、肽衍生物或肽模擬物結(jié)合的方法而產(chǎn)生。無肽MHC分子可通過例如將天然MHC分子展開以解離結(jié)合肽，并將空的MHC分子再卷曲的辦法而產(chǎn)生(見Dornmair和McConnell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87(1990)，4134-4138和WO91/14701)。
另一方面無肽的MHC分子還可以通過MHC分子或其衍生物的重組生產(chǎn)而制得。這樣的例子有MHCⅡ型分子在成纖細胞中表達(Germain和Malissan，Ann.Rev.Immunol.4(1990)，281-315)，和無膜錨(anchor)的可溶性MHCⅡ型分子衍生物在CHO細胞內(nèi)表達(Wettstein等J.Exp.Med，174(1991)，219-228，Buelow等，Eur.J.Immunol，23(1990)，69-76)，及通過在昆蟲細胞內(nèi)的桿狀病毒表達系統(tǒng)表達MHCⅡ類分子(Stern和Wiley，Cell68(1992)，465-477;Scheirle等，J.Immunol，149(1992)，1994-1999)。MHCⅠ型分子也在CHO細胞中(Fahnestock等，Sicience258(1992)，1658-1662)，在昆蟲細胞中(Jackson等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 89(1992)，12117-12120;Matsamura等，J.Biol.Chem.267(1992)，23589-23595)及在成纖細胞中(Mage等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)，10658-10661)表達。
另外，還已知無肽MHC分子可以在大腸桿菌中表達(Parker等，Mol.Immunol，29(1992)，391-378;Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)，8403-8407;Garboczi等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)，3429-3433;Altman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90(1993)，10330-10334)。本發(fā)明參考了這些出版物中描述的MHC分子或MHC分子衍生物的重組表達技術(shù)。
本發(fā)明復合物的MHC組分優(yōu)選為重組MHC分子或其肽結(jié)合衍生物，特別優(yōu)選其中膜錨部分或完全缺失的可溶性MHC分子衍生物。
為了鑒別可以提呈本發(fā)明的自身反應性肽的MHC分子，將供體的抗原提呈細胞與標記形式的本發(fā)明肽一起孵育，最好先將天然MHC分子變性以解離結(jié)合肽。然后標記的MHC-肽復合物可與亞型特異性抗體一起進行免疫沉淀，后者是針對于MHC分子的構(gòu)架組織特異性決定簇，然后通過標記肽的存在鑒別此MHC分子。
另外，供體的EBV(Epstein-Barr Virus)轉(zhuǎn)化的B細胞可用作抗原提呈細胞。
例如可以這樣從重組MHC分子衍生物制備本發(fā)明復合物通過PCR技術(shù)從供體經(jīng)過EBV轉(zhuǎn)化的B細胞系的CDNA之中分離MHC分子如MHC DR3、DR4或DQ分子的α和β鏈的可溶部分的DAN片段，作為表達相應MHC分子的模板。在此步中，優(yōu)選通過適當選擇PCR引物，在α和β鏈的C末端引入純化輔助段，例如寡聚組氨酸片段(如六聚組氨酸片段)。然后，PCR產(chǎn)物可亞克隆在大腸桿菌中，并表達為包涵體?？捎靡阎椒▽w穩(wěn)定化(參見，以上關(guān)于MHC分子在大腸桿菌中表達的參考文獻)可用金屬螯合親合色譜法純化MHC蛋白。然后，α和β亞單位在肽存在下復活。
如上所述，本發(fā)明的肽-MHC復合物還可帶有標記基團，在此情形下，標記基團可用已知方法與復合物中的肽組分以及MHC組分結(jié)合。
本發(fā)明的另一主題為寡聚的肽-MHC復合物，其含有至少兩個MHC分子或MHC分子衍生物，它們通過共價或非共價相互作用而連結(jié)。這種寡聚的肽-MHC分子復合物與已知的單體復合物(對MHC分子而言)相比，一個優(yōu)點是其親合力高，因此診斷或/和治療效力高。
在本發(fā)明的一種實施方案中，這種寡聚的復合物可按已知方法制備，單體肽-MHC復合物通過化學偶聯(lián)試劑共價交聯(lián)，化學偶聯(lián)劑如從琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶硫基)丙酸酯、3-馬來酰亞氨基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞氨基己?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯、二(馬來酰亞氨基甲基)醚、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯、戊二醛等。任選地，也可能修飾肽組分或MHC組分的個別氨基酸使特異的偶聯(lián)試劑優(yōu)選進攻該位置。這樣，蛋白組分用重組方法或肽組分用化學合成方法另外引入的半脫氨酸或賴氨酸就可以用SH聯(lián)結(jié)劑或通過氨基進行偶聯(lián)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，可以這樣制備寡聚的肽-MHC復合物，使連結(jié)于MHC分了的肽組分作為寡聚體，即含有至少2個MHC連結(jié)區(qū)的肽分子，其中對連結(jié)MHC分子起重要作用的序列由間隔區(qū)相互分離。這些間隔區(qū)一般含10-15個氨基酸。使用小的親水氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸或其結(jié)合來構(gòu)成這些間隔區(qū)。當無肽MHC分子在這些肽寡聚體存在下復活時，即形成了本發(fā)明的寡聚復合物，其所含MHC分子與寡聚肽組分通過非共價鍵作用交聯(lián)。
另外，可通過修飾重組產(chǎn)生的MHC分子來制備寡聚的肽-MHC復合物。在構(gòu)建表達重組的MHCⅡ型分子α或β鏈的載體時，可能在一基因段上進行克隆，優(yōu)選在C-末端，該基因段編碼被抗體識別的表位。此抗體可為IgG型，但優(yōu)選為IgM型。然后復活的單體肽-MHC復合物與能識別所引入表位的抗體一起孵育，以形成非共價交聯(lián)的由幾個抗體和幾個肽MHC復合物組成的免疫復合物?？捎檬熘姆肿由飳W技術(shù)，如插入限制性位點或定點突變，將編碼表位的DNA段引入編碼MHC分子α或β鏈的DNA片段中。
本發(fā)明的寡聚的肽-MHC復合物優(yōu)選含有氨基酸序列(Ⅰ)、(Ⅱ)、圖1和2所示的氨基酸序列、它的部分區(qū)域或/和從中衍生的氨基酸序列的肽，或其肽衍生物或肽模擬物。優(yōu)選用寡聚復合物作為Ⅰ型糖尿病的診斷或治療試劑。
因此，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明肽、肽衍生物、肽模擬物或/和肽-MHC復合物作為活性成分，必要時與一般藥物添加劑結(jié)合的藥物組合物。此組合物可以另外還有輔助刺激成分，如細胞因子，如IL-2和IL-4或/和表面抗原B7(Wyss-Coray等，Eur.J.Immunol，23(1993)，2175-2180);Freeman等，Science262(1993)，909-911)，它們能與T細胞表面分子CD-28結(jié)合。輔助刺激組分的存在可改進或/和調(diào)節(jié)組合物的治療效果。
另外，本發(fā)明涉及含肽、肽衍生物、肽模擬物或/和肽-MHC復合物的藥物組合物在制備診斷試劑方面的用途，即用于診斷影響免疫系統(tǒng)的疾病或疾病素質(zhì)(predisposition)，或診斷腫瘤疾病或腫瘤疾病素質(zhì)，特別是診斷自身免疫疾病或自身免疫疾病素質(zhì)，如Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病，優(yōu)選Ⅰ型糖尿病。
然而也可以用類似的方法應用于診斷其它自身免疫疾病。這種自身免疫疾病的例子有多發(fā)性硬化，其中可以檢測抗髓磷脂基質(zhì)蛋白或蛋白脂蛋白的活性T細胞;風濕性關(guān)節(jié)炎，其中可檢測抗Ⅱ型膠原、細胞角蛋白和Hsp65的活性T細胞;Basedow病，其中可檢測抗甲狀腺過氧化酶的活性T細胞。
一般來說，對影響免疫系統(tǒng)的所有疾病的診斷應用是可能的，如動脈硬化。在此情形下，已證明疾病與對熱休克蛋白Hsp 65的免疫應答有關(guān)(Xu等，Lancet 341，8840(1993)，255-259)。
另一應用是與腫瘤抗原反應的T細胞的診斷檢測。例如抗黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE1的T細胞，它是從黑色素瘤病人中分離到的(Vander Bruggen等，Science 254(1991)，1643-1647)。在用傳統(tǒng)方法由于細胞量不足而檢測不到腫瘤的階段，本發(fā)明的寡聚復合物，可用于檢測這些T細胞。另外，特異性反應的T細胞的檢測還可用于監(jiān)測抗腫瘤接種反應。
本發(fā)明因此還涉及檢測特異性T細胞亞群的方法，其特征在于將含T細胞的樣品，優(yōu)選來自體液如全血的樣品，與本發(fā)明的肽、肽衍生物、肽模擬物或/和本發(fā)明的復合物接觸，即可檢測T細胞與肽與復合物的反應。T細胞與復合物或肽的特異性反應可通過例如T細胞增殖的增加來檢測，后者可通過例如摻入的放射活性來測量。另一方面，還可用標記肽或復合物直接測定與T細胞的反應。在此方案中，優(yōu)選使用偶聯(lián)有熒光標記的肽或復合物。例如可通過FACS分析進行評價，就是使T細胞先與偶聯(lián)有T細胞特異性抗體的第一熒光標記物接觸，然后與偶聯(lián)有第二熒光標記物的肽-MHC復合物接觸，通過熒光圖譜分析檢定雙標記細胞。這樣就測定出以那些與本發(fā)明肽或肽衍生物或/和與本發(fā)明肽-MHC復合物具有特征性反應活性的T細胞亞群。由于特異性T細胞群在血中濃度低，作為此方法的第一步，應該優(yōu)選選擇預活化的T細胞，如通過與IL-2孵育或/和與IL-2受體抗體孵育得到特定濃度的IL-2受體陽性T細胞，然后用例如免疫磁法分離抗體結(jié)合細胞。另外，可以在T細胞與肽或復合物接觸后進行預活化T細胞的選擇。
在此方法的改進中，還可以測定預活化自身反應性T細胞(即有IL-2受體作為表面標記的T細胞)與非活化的自身反應性T細胞(即無IL-2受體的T細胞)的比例。
此方法可特別用于診斷Ⅰ型糖尿病，還可用于診斷影響免疫系統(tǒng)的其它疾病，或用于診斷這些疾病的素質(zhì)。
本發(fā)明另外涉及含本發(fā)明肽、肽衍生物、肽模擬物或/和肽-MHC復合物的藥物組合物在制備治療或預防影響免疫疾病的試劑方面的用途。關(guān)于本發(fā)明的肽和本發(fā)明的肽-MHC復合物的治療用途，可以使用例如與毒素偶聯(lián)的肽或肽-MHC復合物來治療疾病，另外還可以把肽單獨使用或作為復合物的成分來治療疾病，雖然它們與T細胞受體結(jié)合，但不引起T細胞活化，即具有無反應化作用。
這種無反應化肽類似物的治療作用是由于這樣的事實T細胞受體(TCR)必需與被Ⅰ型或Ⅱ型MHC抗原提呈的肽相互作用，才能活化T細胞。在此過程中，肽的錨位氨基酸具體負責與MHC分子結(jié)合，而肽中的其它氨基酸的貢獻是與TCR相互作用從而對T細胞產(chǎn)生刺激。因此有可能在肽中由于氨基酸的取代而產(chǎn)生肽類似物，由于存在錨位點，它們?nèi)阅芘cMHC份子結(jié)合，但僅產(chǎn)生部分T細胞活化或不活化(參見，如Sloan-Lancaster等，Nature 363(1993)，156-159)。這樣，肽類似物有例如使特異表面分子的表達達到更高水平(如IL-2受體，LFA-1)的作用，但不發(fā)生增殖或細胞因子的表達。與這樣的肽類似物作用的T細胞被轉(zhuǎn)化成所謂的無反應性狀態(tài)，即既使接下來用免疫原性肽常規(guī)刺激后，它們也不再增殖。該無反應性狀態(tài)持續(xù)至少7天，因此可用于治療自身免疫疾病。
本發(fā)明的另一治療應用是此肽或肽和MHC分子的復合物可用作抗原。在此情形下，這種抗原可作為免疫原，即刺激免疫反應的試劑，或作為耐受原(tolerogen)，即產(chǎn)生免疫耐受的試劑。作為免疫原的應用，例如可用作對抗腫瘤抗原的接種。為此目的，此處不用整個腫瘤細胞，可能注射能被T細胞識別的腫瘤特異性肽與相應的MHC分子的復合物，特別是寡聚復合物，以引起抗腫瘤的T細胞反應。為了增加免疫刺激，還可能將此復合物與另外的刺激物質(zhì)結(jié)合使用。例如細胞因子如IL2或IL4適合此目的，它可任選并優(yōu)選與本發(fā)明的肽-MHC復合物共價連結(jié)。另一種可能性是將此復合物與那些與激活T細胞有關(guān)的輔助組分結(jié)合以活化T細胞，特別是與抗原提呈細胞的上所必需的表面分子結(jié)合，如表面分子B7。
優(yōu)選的治療配方是將載有肽的MHC分子整合在人工載體中，如脂載體，此配方中還可任選含有膜結(jié)合分子如B7或/和固定化細胞因子。
本發(fā)明另外涉及與本發(fā)明的肽或肽-MHC復合物反應的T細胞亞群的分離。此方法是將例如來自預先采來自病人的體液的含T細胞的樣品，與本發(fā)明的肽或本發(fā)明的肽-MHC復合物接觸，這樣就可鑒別與肽或復合物反應的T細胞，必要時將它們與其它T細胞分離。在此情形下，還可能在T細胞與肽或復合物接觸前或/和后，選擇預活化的T細胞，即帶有IL-2受體的T細胞。
在此方法中，還可使用在載體上呈固定化形式存在的肽或肽-MHC復合物，這就簡化了陽性反應T細胞群與其它T細胞分離的方法。通過再刺激，可從用此方法分離的T細胞亞群中建立T細胞系。然后，這些自身反應性T細胞系可用于免疫病人。
Ⅰ型糖尿病的特異免疫治療包括首先分離抗自身抗原的特異性T細胞系自身抗原如IDDM病人的GAD65。然后確定T細胞系的最佳(fine)特異性，即鑒別自身反應性肽。選擇那些識別優(yōu)勢肽的T細胞系用于隨后接種病人，優(yōu)勢肽即數(shù)種分離到的T細胞系均可與之反應的肽。上述的T細胞系中特別要提到的是能識別氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)的肽的T細胞。
如果在病人中沒有明確的優(yōu)勢肽，必須將數(shù)種T細胞系混合用于隨后接種。在孵育前，所選擇T細胞系再用抗原提呈細胞及用適當?shù)碾拇碳?，以確保活化分子的良好表達，特別是T細胞受體的表達。然后將T細胞系滅活，例如通過熱處理或/和放射活性照射，優(yōu)選劑量為4000-10000拉德，特別優(yōu)選ca.8000拉德，并皮下注射到作為該細胞供體的病人的體內(nèi)，細胞數(shù)量優(yōu)選為107到5×107。一般持續(xù)6-12個月的時間內(nèi)至少注射三次。
然后檢測病人對接種物的T細胞反應。為此，例如用Ficoll密度梯度離心分離病人的外周血淋巴細胞(PBLs)并用標準增殖試驗來測定由接種物引起的增殖。成功免疫后，作為對接種物的反應，應該能檢測到病人的PBLs的大量增殖。對免疫成功的進一步控制是確定免疫過程中病人的GAD-反應性T細胞的發(fā)生率。這例如可用標準有限稀釋法進行，即用自體細胞與GAD共同孵育后再用4000拉德射線照射，以這種細胞作為刺激細胞。如果免疫進行得成功，自身反應性T細胞發(fā)生率明顯減少。
被起調(diào)節(jié)作用的T細胞所識別的接種物T細胞的表面結(jié)構(gòu)被進一步窄化后，還可能用起調(diào)節(jié)作用的T細胞的部分結(jié)構(gòu)，如T細胞受體片段來免疫。
另外，在抗腫瘤免疫的情形下，可以再注射有分裂能力的T細胞，這可導致病人對腫瘤細胞的主動免疫。
在鑒別或活化/抑制特異性T細胞亞群的診斷和治療方法中，還可以用能激活MHC-肽復合物活性的抗個體基團型(antiidiotypic)抗體代替本發(fā)明的肽或肽-MHC分子。這種抗體易于得到，可用抗特異肽的特異性T細胞亞群作為免疫原以產(chǎn)生抗體(如在鼠中)，或首先產(chǎn)生抗MHC-肽復合物的第一種抗體，然后再產(chǎn)生抗第一種抗體的抗個體基因型抗體。
因此，本發(fā)明的另一主題是抗本發(fā)明肽或肽衍生物或抗本發(fā)明復合物的抗體(第一抗體)，它可以通過用此肽、肽衍生物或復合物免疫，并分離免疫產(chǎn)生的抗體而得到，優(yōu)選為Kohler和Milstein的方法或進一步改進的方法產(chǎn)生的單克隆抗體。
最后，本發(fā)明還涉及抗第一抗體的抗個體因基型抗體，第一抗體是抗本發(fā)明肽或肽衍生物或復合物的抗體，用第一抗體免疫并進行分離即得到由免疫產(chǎn)生的抗個體基團型抗體。
本發(fā)明的又一主題物是能與本發(fā)明的自身反應性肽、肽衍生物或肽模擬物或此肽與MHC分子的復合物反應的T細胞。T細胞優(yōu)選的實例是來自T細胞系6/7(DSMACC2172)或6/10(DSMACC2173)的T細胞，或具有基本相當?shù)腡細胞受體結(jié)合特異性的T細胞，即可識別MHC分子提呈的肽或具有氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)或/和這些氨基酸序列部分區(qū)域的肽的T細胞。
下列實施例結(jié)合圖1-4，用于進一步闡明本發(fā)明。
圖1表示本發(fā)明的自身反應性氨基酸序列圖2表示本發(fā)明的另一些自身反應性氨基酸序列圖3表示T細胞系6/7與肽庫增殖試驗的結(jié)果圖4表示T細胞系6/10與肽庫增殖試驗的結(jié)果圖5表示T細胞系6/7與來自肽庫7和11的單一肽的增殖試驗的結(jié)果圖6表示T細胞系6/10與來自肽庫7和11的單一肽的增殖試驗的結(jié)果。
實施例1建立GAD特異性T細胞系1.初級刺激用Ficoll密度梯度離心法從Ⅰ型糖尿病人的EDTA抗凝血中分離外周血液淋巴細胞(PBLs)。這些細胞用RPM1培養(yǎng)液洗滌兩次，并懸浮在由RPMI 1640、5%人血清、2mM谷氨酰胺和100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素組成的培養(yǎng)基中。將相當于100000個細胞的100μl細胞懸浮液置于96孔圓底培養(yǎng)板的每個孔中。然后加入終濃度為2.5μg/ml的豬GAD(SW-GAD)。在37℃/7%CO2孵箱中將細胞孵育3-4天。這段時間后，加入100μl IL-2(30u/ml)。再過3-4天后，從所有培養(yǎng)混合物中每孔吸出100μl，再加入100μlIL-2(30u/ml)。每3-4天重復一次。
2.再刺激初級刺激開始后第14天進行第一次再刺激。為此，用Ficoll方法分離初級刺激中的兩倍數(shù)目的自體PBLs，調(diào)節(jié)在培養(yǎng)基中的細胞濃度為2×106/ml。這些刺激物細胞的一半與抗原SW-GAD(終濃度5μg/ml)孵育2小時/37℃/7%CO2(抗原脈沖性刺激)。另一半在相同條件下不接觸抗原，僅與培養(yǎng)基孵育。然后，所有刺激物細胞用4000拉德照射。再將刺激物細胞分布在96孔圓底板中(100000個細胞/孔)，其排布方式使含抗原的刺激物細胞孔總與無抗原的刺激物細胞孔相鄰。
然后從初級刺激制備物中制備T細胞。為此，從初級刺激制備物中吸出上清液，盤中的細胞用DMEM液洗兩次，每次用100μl(Dulbeccos Modified Fagk Medium＝DMEM)。每次沖洗后細胞在盤中以400g離心沉淀。然后將每孔細胞懸浮在100μl培養(yǎng)基中，將各50μl細胞懸液分配在再刺激盤的兩個相鄰的孔中。以此方式，在一有抗原的孔中和相鄰的無抗原的孔中孵育T細胞，這可以監(jiān)視再刺激的抗原特異性。
再刺激開始后第2天或第3天，可以通過顯微鏡評估其增殖。在此過程中，只有那些反在有抗原的孔中發(fā)生增殖的微培養(yǎng)對被視為有意義。從第4天，向每個培養(yǎng)孔中依次加入100μlIL-2(30u/ml)。直到第14天，每3-4天將ca.50%的培養(yǎng)基用IL-2(30u/ml)交換。
當生長良好時，將培養(yǎng)物分裝于幾個96孔盤中。在以后的再刺激中，還可以將它們分布在較大的孔中。用上述方法每兩周進行一次新的再刺激。從第3次再刺激起，用增殖試驗測定微培養(yǎng)物的特異性。
3.與SW-GAD的增殖試驗所有試驗在至少兩份制備物中進行。
a)刺激物細胞以HLAⅡ型抗原相同的自體PBLs或血常供體的PBLs作為刺激物細胞。如2中所述，PBLs與抗原一起預培養(yǎng)，用4000拉德照射，分布在96孔盤中(100000細胞/孔)。
b)T細胞所用T細胞總來自再刺激階段的最后一步。這些細胞用DMEM洗三次，除去抗原和IL-2，然后分成6000個細胞/96孔。如此分離的T細胞系6/7和6/10，按照Budapest條約的規(guī)定，已在DSM保藏，保藏號為DSMACC2172和DSMACC2173。
除與SW-GAD孵育外，對照孵育無GAD。
37℃/7%CO2下3-4天后，加入1μCiH-胸苷，再孵育16-20小時。然后用細胞收集儀將細胞轉(zhuǎn)移到一玻璃纖維濾器上，用β計數(shù)器測定摻入的放射活性。
表1表示與SW-GAD的增殖試驗的典型結(jié)果。
表1T細胞系6/7和6/10與SW-GAD的增殖試驗結(jié)果細胞系對照cpm
無抗原SW-GAD6/712993736/1011752224.與衍生自H-GAD序列的肽的增殖試驗已通過至少4個再刺激循環(huán)而擴增，并在增殖試驗中與SW-GAD反應的T細胞系，再與H-GAD的重疊肽進行試驗。這些試驗的目的是確定被T細胞識別的H-GAD的表位。為此，首先合成H-GAD的重疊的20mer肽(重疊區(qū)10個氨基酸，總共有59種不同的肽)。
每4-5個這種肽合并成一個庫，并以終濃度18μg/ml加入到刺激物細胞中(刺激物細胞按3a部分所述方法制備)。這些刺激物細胞的進一步處理如3a部分所述。
然后，每個微培養(yǎng)孔中加入6000-20000個T細胞。以下步驟類似于3b部分所述。
圖3和4表示T細胞系6/7和6/10用人GAD 65kd的肽庫進行增殖試驗的結(jié)果。兩個T細胞系都與庫11的肽旺盛增殖。與庫7的增殖反應也被觀察到，反應雖稍弱但卻很明顯。
圖5和6表示T細胞系6/7和6/10與庫7和11的10μg/ml單一肽的增殖試驗結(jié)果。兩個細胞系都與肽5G1(相當于人GAD65的氨基酸266-285)有明顯增殖，與肽5F3(相當于人GAD65的氨基酸306-325)的增殖較差但也明顯。
實施例2分離和測定抗原特異性T細胞亞群的方法因為抗原特異性T淋巴細胞，特別是抗自身抗原的特異性T淋巴細胞在外周血液中的數(shù)量很小(預計頻率為10-5-10-6)，很明顯，需要通過選擇步驟首先濃縮在體內(nèi)預活化的T細胞。這可通過兩種方法達到1.與IL-2孵育擴增體內(nèi)預化T細胞為此，用Ficoll密度梯度離心方法分離PBLs，并調(diào)節(jié)使其在含IL-2的細胞培養(yǎng)基(RPMI 1640/5%人血清/30u/ml IL-2)中濃度為2×106細胞/ml。將每等份200μl的細胞分配在幾個48孔盤中，并培養(yǎng)7天。4天后，再一次加入IL-2。因為預活化T細胞表現(xiàn)高親合力IL-2受體，在此刺激階段，體內(nèi)預活化T細胞選擇性地繁殖，并在初級培養(yǎng)中積累。刺激階段結(jié)束后，洗滌每個孔中的細胞，計數(shù)并用于增殖試驗。
2.通過免疫磁分離濃縮體內(nèi)預活化T細胞為此，將Ficoll分離的PBLs與抗高親合力IL-2受體的單克隆抗體一起孵育(7×106PBLs/ml;10μl/ml抗IL-2受體抗體(Boehringer Mannheim);30分鐘，4℃。然后，細胞懸浮液用冰冷卻的RPMI/10%人血清(HS)(400g/10分鐘)洗滌兩次，再將懸浮液調(diào)節(jié)至細胞密度為1-3×107/ml。將偶聯(lián)上綿羊抗-鼠抗體的Dynal公司的DynabeadsM-280加入此中(Dynabeads與靶細胞的比例為ca.10-15)。將懸浮液4℃下在搖床上非常緩慢地振動。然后，懸浮液用RPMI/10%HS稀釋10倍，并在事先預冷的磁顆粒濃縮器(MPC)中放置1-2分鐘。帶有IL-2受體的玫瑰花環(huán)T細胞被磁體固定后，吸出上清液，從MPC中去除孵育容器，保留下來的細胞重新懸浮在RPMI/10%HS中。在MPC中再進行一次靶細胞的分離。再重復一次洗滌步驟。然后分離的細胞再懸浮在培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細胞數(shù)目為1×107/ml。通過脫離(detacher)抗體用已知方法去除磁珠。
通過2.1或2.2的方法濃縮的預活化細胞然后被用于測試其抗自身抗原肽或抗肽/MHC復合物的反應活性。
這有幾種方法3.用照射的刺激細胞和肽作為抗原的增殖試驗首先，從Ficoll-分離的PBLs制備自身刺激細胞。將刺激細胞在細胞培養(yǎng)基中的濃度調(diào)至106細胞/ml，并與肽(終濃度10μg/ml)孵育2小時/37℃/7%CO2。然后用4000拉德照射刺激細胞，再份配在一96孔圓底培養(yǎng)板中，細胞數(shù)為100000細胞/孔。
向每孔中加入用2.1或2.2方法所得體內(nèi)預活化T細胞100000個，并在37℃/7%CO2下孵育4天。然后該制備物體積的一半用IL-2(30u/ml)置換。再過4天后，重復一次。
在微培養(yǎng)開始后第12天，進行實際的繁殖試驗。為此，微培養(yǎng)物首先用DMEM洗兩次，以去除抗原和IL-2。將每個培養(yǎng)物分成4等份，在100000照射的自體PBLs存在下雙份孵育(37℃/7%CO2)3天，每例中分有肽或無肽的脈沖性刺激兩種。然后加入3H-胸苷，再過16-20小時后測定摻入的放射活性。
4.用標記的寡聚肽/HLA復合物直接檢測自身反應性T細胞。
此處使用經(jīng)2.2的方法濃縮的體內(nèi)預活化T細胞。調(diào)節(jié)細胞在RPMI/10%HS中的濃度為106/ml，并在40℃下與帶有熒光標記的寡聚的HLA-肽復合物孵育30分鐘。然后用冰冷的細胞培養(yǎng)基洗滌細胞兩次。在流式細胞計中對熒光標記的細胞群進行分析。
實施例3提呈特定的自身反應性肽的MHC分子的鑒別首先將肽按Bolton和Hunter的方法用125I標記(Bolton，A.E.和Hunter，W，M.，Biochem.J.133(1993)，529-531)。然后將MHC型待測的供體的2-5×106PBLs在37℃下在含125I-標記肽(2-10μM)的細胞培養(yǎng)基中孵育4個小時。細胞洗滌后，在由0.5%NP40;0.5%Mega 9;150mMNaCl;5mMEDTA;50mMTris pH7.5;2mM苯甲磺酰氟組成的溶解緩沖液中溶解。用連于蛋白A-Sepharose的構(gòu)架(framework)特異性單克隆抗體(如針對HLA-DR的單克隆抗體L243(ATCC HB55))從混合物中將MHC分子免疫沉淀，并用γ計數(shù)器測定結(jié)合在蛋白A-Sepharose上的放射活性。
實施例4
能提呈自身反應性肽給T細胞系6/7(DSM ACC2172)和6/10(DSMACC2173)的MHC分子亞型的測定實驗步驟類似于實施例1.3。但不用自體PBLs作為抗原提呈細胞，而用異源供體的PBLs，它與從自身中分離出T細胞系的供體的MHC分子不完全相應，而只是所限定的MHC等位基因相應。用自身抗原性肽5G1(相當于人GAD65的氨基酸266-285)和5F3(相當于GAD65的氨基酸306-325)進行增殖試驗。
表3表示該試驗的結(jié)果。在DR B1等位基因0401存在下，T細胞系6/7和6/10與兩種肽作用后都可以增殖。DQ A1或DQ B1等位基因的變異對T細胞系的刺激反應性無影響。T細胞系6/7識別肽5G1還與等位基因B1 0101或/和1601有關(guān)。

實施例5使用T細胞系6/10測定肽5G1的變異體的增殖試驗為了闡明刺激肽5G1的核心結(jié)構(gòu)，使用T細胞系6/10來測定此肽的各種變異體的刺激增殖試驗(見表4)。
對第一系列20mer變異體的試驗，目的在于確定是否5G1結(jié)構(gòu)上C-或N-末端的邊緣氨基酸在被T細胞系6/10的識別中起作用。刺激指數(shù)表明向C-末端移動20mer肽不增加增殖活性。向N-末端移動6個氨基酸引起刺激能力減低。
用第二系列肽變異體所作的試驗，目的是檢查C-末端縮短后對其刺激能力的影響。該系列實驗表明C-末端的氨基酸殘基組氨酸(H)和苯丙氨酸(F)對刺激能力有重要影響。
用第三系列肽變異體的試驗，目的是確定最小刺激活性肽的N-末端。如果從18mer去掉亮氨酸(L)和脯氨酸(P)而C-末端不變，這引起刺激指數(shù)大大下降。因此N-末端確定為L和P。如果因去掉H和F而進一步縮短C-末端，也導致刺激活性下降。因眥，對T細胞系6/10，可產(chǎn)生刺激作用的最小肽為序列LPRLIAFTSEHSHF的14mer。
表4為了鑒定具有刺激活性的最小肽結(jié)構(gòu)，TCL6/10與肽5G1的變異體的反應。
5G1的肽變異體刺激指數(shù)5G1GMAALPRLIAFTSEHSHFSL5.4ALPRLIAFTSEHSHFSLKKG3.0RLIAFTSEHSHFSLKKGAAA3.2PEVKEKGMAALPRLIAFTSE0.6AALPRLIAFTSEHSHFSL4.5AALPRLIAFTSEHSHF2.9AALPRLIAFTSEHS0.7AALPRLIAFTSE0.6GMAALPRLIAFTSE0.8GMAALPRLIAFT1.0LPRLIAFTSEHSHFSLKK3.2RLIAFTSEHSHFSL1.4LPRLIAFTSEHSHF4.6LPRLIAFTSEHS0.權(quán)利要求
1.包括下列氨基酸序列的肽或肽衍生物(a)氨基酸序列(Ⅰ)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A(b)氨基酸序列(Ⅱ)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K(c)下列氨基酸序列中的一種I-L-I-K-C-D-E-R-G-K-M-I-P-SL-G-I-G-T-D-S-V-I-L-I-K-C-DL-A-F-L-Q-D-V-M-N-I-L-L-Q-YY-D-L-S-Y-D-T-G-D-K-A-L-Q-CV-S-Y-Q-P-L-G-D-K-V-N-F-F-RL-A-A-D-W-L-T-S-T-A-N-T-N-ML-L-Y-G-D-A-E-K-P-A-E-S-G-GV-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-AL-L-Q-Y-V-V-K-S-F-D-R-S-T-KF-T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-YL-E-Y-V-T-L-K-K-M-R-E-I-I-GN-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-PK-I-W-M-H-V-D-A-A-W-G-G-G-LW-G-G-G-L-L-M-S-R-K-H-K-W-KE-G-Y-E-M-V-F-D-G-K-P-Q-H-TR-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-GW-L-T-S-T-A-N-T-N-M-F-T-Y-ET-A-N-T-N-M-F-T-Y-E-I-A-P-VL-V-S-A-T-A-G-T-T-V-Y-G-A-FY-I-P-P-S-L-R-T-L-E-D-N-E-EV-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F(d)長度為至少6個氨基酸的(a)、(b)或/和(c)中所示氨基酸序列的部分區(qū)域，或/和(e)具有與(a)、(b)、(c)或/和(d)中所示氨基酸序列基本相當?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的肽或肽衍生物，包括(a)氨基酸序列(Ⅰ)，(b)氨基酸序列(Ⅱ)，(c)氨基酸序列(Ⅰ)或/和(Ⅱ)的部分區(qū)域，或/和(d)具有與(a)、(b)或/和(c)的氨基酸序列基本相當?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2的肽或肽衍生物，其中其長度為至少8個氨基酸。
4.權(quán)利要求1-3之一的肽或肽衍生物，其中其長度為至少10個氨基酸。
5.權(quán)利要求1-3之一的肽或肽衍生物，其中其長度達25個氨基酸。
6.權(quán)利要求1-5之一的肽或肽衍生物，其中它帶有標記基團。
7.肽模擬物，其中它與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力與權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物的基本相當。
8.含有至少一種能與MHC分子或MHC分子的肽結(jié)合衍生物結(jié)合的、在權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物或權(quán)利要求7的肽模擬物的復合物。
9.權(quán)利要求8的復合物，其中它含有MHCⅡ型分子或其肽結(jié)合衍生物。
10.權(quán)利要求9的復合物，其中MHCⅡ型分子為DR1、DR2、DR3或DR4型。
11.權(quán)利要求10的復合物，其中MHCⅡ型分子為DR B1 0101、DR B1 0301、DR B1 0401、DR B1 0402、DR B1 0404或DR B1 1601亞型。
12.權(quán)利要求11的復合物，其中MHCⅡ型分子為DR B1 0101或DR B1 0401亞型。
13.權(quán)利要求8-12之一的復合物，其中它含有重組MHC分子或其肽結(jié)合衍生物。
14.權(quán)利要求13的復合物，其中它包括MHC分子的可溶性肽結(jié)合衍生物。
15.權(quán)利要求8-14之一的復合物，其中它帶有標記基團。
16.寡聚的肽-MHC分子復合物，它含有通過共價或非共價相互作用而連結(jié)的至少2個MHC分子或MHC分子衍生物。
17.權(quán)利要求16的寡聚復合物，其中它含有通過化學偶聯(lián)試劑交聯(lián)的肽-MHC分子復合物。
18.權(quán)利要求16的寡聚復合物，其中它含有數(shù)個MHC結(jié)合區(qū)并被寡聚肽組分所交聯(lián)的MHC分子或MHC分子衍生物。
19.權(quán)利要求16的寡聚復合物，其中它含有被抗體交聯(lián)的肽-MHC分子復合物。
20.權(quán)利要求16-19之一的寡聚復合物，其中它含有權(quán)利要求9-14之一所定義的MHC分子。
21.權(quán)利要求16-20之一的寡聚復合物，其中它含有至少一種權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物或權(quán)利要求7的肽模擬物。
22.藥物組合物，其中它含有權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物、權(quán)利要求7的肽模擬物或/和權(quán)利要求8-21之一的復合物作為活性成分，必要時與一般藥物添加劑結(jié)合。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中它另外包括輔助刺激組分。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中輔助刺激組分選自細胞因子或/和表面抗原B7。
25.權(quán)利要求22-24之一的藥物組合物用于制備診斷影響免疫系統(tǒng)的疾病或疾病素質(zhì)、或診斷腫瘤疾病或腫瘤疾病素質(zhì)的試劑。
26.權(quán)利要求25的用途，即用于制備診斷自身免疫疾病或自身免疫疾病素質(zhì)的試劑。
27.權(quán)利要求25或26的用途，即用于制備診斷糖尿病或糖尿病素質(zhì)的試劑。
28.測定特異性T細胞亞群的方法，其中將含T細胞的樣品與權(quán)利要求1-6的肽或肽衍生物、權(quán)利要求7的肽模擬物或/和權(quán)利要求8-21的復合物接觸，并測定樣品中的T細胞與肽或復合物的反應。
29.權(quán)利要求28的方法，其中使用熒光標記的肽或復合物通過FACS分析測定T細胞的反應。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中T細胞與肽或復合物接觸前或/和后，對預活化T細胞進行選擇。
31.權(quán)利要求22-24之一的藥物組合物用于制備治療或預防影響免疫系統(tǒng)的疾病的試劑。
32.權(quán)利要求31的用途，它是用于制備治療或預防自身免疫疾病的試劑。
33.權(quán)利要求31或32的用途，它是用于制備治療或預防糖尿病的試劑。
34.權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物，權(quán)利要求7的肽模擬物或權(quán)利要求8-21之一的復合物用于制備抗原，特別是免疫原或耐受原。
35.特異性T細胞亞群的分離方法，其中將含T細胞的樣品與權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物、與權(quán)利要求7的肽模擬物或與權(quán)利要求8-21之一的復合物接觸，從而鑒別與肽或復合物反應的T細胞，必要時將其與其它T細胞分離。
36.權(quán)利要求35的方法，其中T細胞與肽或復合物接觸前或/和后，對預活化T細胞進行選擇。
37.按權(quán)利要求35的方法分離的T細胞或其部分結(jié)構(gòu)用于產(chǎn)生抗體。
38.權(quán)利要求37的用途，其中將T細胞或其部分結(jié)構(gòu)注射到作為T細胞的原供體的病人中。
39.權(quán)利要求38的用途，其中再注射滅活的T細胞。
40.權(quán)利要求39的用途，其中再注射的T細胞是能夠分裂的T細胞。
41.抗權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物，權(quán)利要求7的肽模擬物或權(quán)利要求8-21之一的復合物的抗體，其可以通過用此肽、肽衍生物、肽模擬物或復合物免疫，并分離免疫產(chǎn)生的抗體得到。
42.抗權(quán)利要求41的抗體的抗個體基團型抗體，其可用抗肽、肽衍生物或肽模擬物或復合物的抗體免疫，并分離免疫產(chǎn)生的抗個體基團型抗體而得到。
43.與權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物、與權(quán)利要求7的肽模擬物或與權(quán)利要求8-15之一或權(quán)利要求21的復合物反應的T細胞。
44.權(quán)利要求43的T細胞，它來自T細胞系6/7(DSM ACC 2172)或具有相當?shù)腡細胞受體結(jié)合特異性。
45.權(quán)利要求43的T細胞，它來自T細胞系6/10(DSM ACC 2173)或具有相當?shù)腡細胞受體結(jié)合特異性。
全文摘要
本發(fā)明涉及自身反應性肽、肽-MHC復合物、與其反應的T細胞亞群，以及這些化合物的診斷和治療應用。
文檔編號C07K14/00GK1112933SQ9510132
公開日1995年12月6日 申請日期1995年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月20日
發(fā)明者J·恩德爾, P·斯塔爾, W·阿爾博特, G-G·瓊, D·J·辛德爾, E·曼爾, K·道馬爾 申請人:伯倫格·曼海姆有限公司