一種抗腫瘤淋巴細(xì)胞的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗腫瘤淋巴細(xì)胞的鑒定方法。該鑒定方法是將取自癌癥病人的一小塊腫瘤組織，在特定的培養(yǎng)基中刺激腫瘤組織中的淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)5天，然后直接用酶聯(lián)免疫測定法檢測培養(yǎng)基中的γ干擾素水平，從而鑒定腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞。本發(fā)明直接測定培養(yǎng)基中γ干擾素水平，快速，耗時(shí)較短。
【專利說明】一種抗腫瘤淋巴細(xì)胞的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種抗腫瘤淋巴細(xì)胞的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境污染和遺傳因素會(huì)導(dǎo)致DNA和基因的突變，癌細(xì)胞起源于人體內(nèi)細(xì)胞由于DNA突變和損傷的無控制生長。通常，癌細(xì)胞生長形成腫瘤，癌細(xì)胞還會(huì)轉(zhuǎn)移到別處繼續(xù)生長，從而破壞正常的組織器官，導(dǎo)致病人的死亡。
[0003]癌癥已成為常見病、多發(fā)病。據(jù)2008年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球有新發(fā)癌癥病例1266萬，死亡800萬，估計(jì)至2015年新發(fā)癌癥病例將達(dá)到1500萬之多。《2012中國腫瘤登記年報(bào)》對(duì)外發(fā)布，報(bào)道全國每6分鐘就有一人被確診為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者，每七到八人中就有一人死于癌癥。全國癌癥發(fā)病形勢嚴(yán)峻，發(fā)病率與死亡率呈持續(xù)上升趨勢，每年新發(fā)癌癥病例約350萬，因癌癥死亡約250萬。伴隨著對(duì)空氣中彌漫的PM2.5的不安，這一連串灰色的數(shù)字令中國人對(duì)癌癥的認(rèn)知繃得更緊了。
[0004]目前癌癥是繼心血管之后的第二位導(dǎo)致人類死亡的因素，大約一半的男人和三分之一多的女人會(huì)產(chǎn)生癌癥。我國居民一生罹患癌癥的概率為22%，癌癥已成為人類第一殺手。目前，還沒有很有效的辦法來對(duì)付癌癥，特別是晚期癌癥病人的治療。20世紀(jì)以來，以手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療三大常規(guī)武器為治療和康復(fù)做出巨大的貢獻(xiàn)，但這些傳統(tǒng)治療手段均有其局限性，在癌癥治療中未能取得整體滿意效果。比如手術(shù)治療，只適合大約20%的較早期的癌患者，有一部分手術(shù)治療可以獲得滿意的根治效果，遺憾的是這樣的情況實(shí)在是少數(shù)，大部分病例不適合手術(shù)治療?；熓请p刃劍，全身化療，毒副作用大，少數(shù)病種可以獲得根治效果，但大部分化療只是姑息或輔助效果，盲目化療無益生活質(zhì)量提高，甚至因?yàn)榛煂?dǎo)致并發(fā)癥而增加身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了根治癌癥，迫切需要找到一種有效的治療癌癥的辦法。
[0005]腫瘤的免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免疫抗癌的新型生物技術(shù)治療方法。它是運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑對(duì)從病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法，來激發(fā)，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。腫瘤的免疫治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù)。
[0006]利用特異的殺傷性淋巴細(xì)胞進(jìn)行腫瘤免疫治療起源于八十年代，利用抗腫瘤的淋巴細(xì)胞進(jìn)行腫瘤免疫治療是一種特異、有效而先進(jìn)的癌癥治療手段。近年來，這一技術(shù)在皮膚癌晚期病人的治療上得到成功的應(yīng)用。臨床試驗(yàn)證明，四分之三的皮膚癌晚期病人經(jīng)過治療后癌癥腫塊明顯消退，一半的皮膚癌晚期病人完全康復(fù)。因此，利用抗腫瘤的淋巴細(xì)胞進(jìn)行腫瘤細(xì)胞免疫治療是一種非常有效的癌癥治療新技術(shù)，有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]利用特異的殺傷性淋巴細(xì)胞進(jìn)行腫瘤免疫治療的過程包括腫瘤組織樣品的取得，從腫瘤樣品中分離腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞，腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞的大量擴(kuò)增和活化，腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞輸入癌癥病人和臨床效果的觀察。腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞的分離是關(guān)鍵。對(duì)從皮膚癌癥病人分離腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞已進(jìn)行了大量的研究，并取得了很好的效果，可以從百分之八十以上的皮膚癌癥病人分離得到腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞。研究顯示，也可以從其他癌癥病人患者分離得到腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞。因此，腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞的腫瘤免疫治療也可以應(yīng)用于其他癌癥病人。
[0008]腫瘤免疫治療的關(guān)鍵是從癌癥病人體內(nèi)分離、鑒定腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞。通常，從癌癥病人中切除一小塊腫瘤組織，經(jīng)過7-10天的刺激和培養(yǎng)，得到幾百萬的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞。然后，進(jìn)行腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)。二十四小時(shí)后，利用酶聯(lián)免疫測定法檢測淋巴細(xì)胞是否釋放Y干擾素，從而確定淋巴細(xì)胞是否具有腫瘤殺傷性。這種經(jīng)典的鑒定腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞的方法，耗時(shí)較長，而且需要腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞。往往從癌癥病人腫瘤組織中誘導(dǎo)培養(yǎng)原代腫瘤細(xì)胞，非常困難。所以，迫切需要簡易快速的方法來鑒定來自癌癥病人的腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞，以便有效地用于腫瘤的免疫治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種抗腫瘤淋巴細(xì)胞的鑒定方法。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0011]一種抗腫瘤淋巴細(xì)胞的鑒定方法，包括以下步驟:
[0012](I)取0.5厘米大小的癌癥病人的腫瘤組織塊，在生物安全柜中用手術(shù)刀將其切成I毫米見方的腫瘤組織小塊；
[0013](2)將腫瘤組織放于24孔培養(yǎng)板，添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細(xì)胞介素_2，然后將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0014](3)培養(yǎng)兩天后，再添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細(xì)胞介素_2，將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0015](4)第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升培養(yǎng)基，置于_20°C冰箱保存；用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量；培養(yǎng)基中含有100皮克/毫升以上的伽馬干擾素所對(duì)應(yīng)的孔中的淋巴細(xì)胞，是具有抗腫瘤活性的淋巴細(xì)胞。
[0016]所述的鑒定方法，步驟(2)中，24孔培養(yǎng)板每孔放入一塊(I)所述腫瘤組織小塊；每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細(xì)胞介素_2。
[0017]所述的鑒定方法，步驟(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細(xì)胞介素_2。
[0018]本發(fā)明的特點(diǎn)是直接測定培養(yǎng)基中Y干擾素水平。所以，快速，耗時(shí)較短，不需要從癌癥病人腫瘤組織誘導(dǎo)培養(yǎng)原代腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞。本發(fā)明的原理是當(dāng)腫瘤組織中的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞受到特定培養(yǎng)基刺激時(shí)，腫瘤組織中的癌細(xì)胞本身也可以刺激淋巴細(xì)胞。也就是說，腫瘤組織中的癌細(xì)胞本身作為靶細(xì)胞，來刺激淋巴細(xì)胞釋放Y干擾素，以此來鑒定來自癌癥病人的抗腫瘤淋巴細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為乳腺癌病人LMC5130的淋巴細(xì)胞抗癌活性的測定。
[0020]圖2為肺癌病人LMC576的淋巴細(xì)胞抗癌活性的測定。
[0021]圖3為腎癌病人LMC584的淋巴細(xì)胞抗癌活性的測定。[0022]圖4為大腸癌病人LMC586的淋巴細(xì)胞抗癌活性的測定。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0024]實(shí)施例1
[0025]從乳腺癌病人(病人代碼為LMC5130)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常乳腺組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把乳腺正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和乳腺正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個(gè)孔中培養(yǎng)。乳腺正常組織標(biāo)記為5130Ν-1、5130Ν-2、5130Ν-3和5130N-4 ;乳腺腫瘤組織標(biāo)記為5130Tu_l、5130Tu-2、5130Tu-3 和 5130Tu_4。每一孔添加 I 毫升 RPM1-1640 培養(yǎng)基和 1000IU 白細(xì)胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細(xì)胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0026]測定結(jié)果如圖1所示，從圖1看出，從乳腺癌病人LMC5130腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細(xì)胞株-5130TU-1和抗腫瘤的淋巴細(xì)胞株-5130TU-3，在這兩株淋巴細(xì)胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0027]實(shí)施例2
[0028]從肺癌病人(病人代碼為LMC576)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常肺組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把肺正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和肺正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個(gè)孔中培養(yǎng)。肺正常組織標(biāo)記為 576Ν-1、576Ν-2、576Ν-3 和 576N-4 ;肺癌腫瘤組織標(biāo)記為 576Tu-l、576Tu-2、576Tu_3 和576TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細(xì)胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細(xì)胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0029]測定結(jié)果如圖2所述，從圖2可以看出，從肺癌病人LMC576腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細(xì)胞株-576Τ-1、576Τ-2、576Τ-3和576Τ-4。從肺正常組織中，也檢測出抗腫瘤的淋巴細(xì)胞株-576Ν-1和576Ν-2。在這些淋巴細(xì)胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0030]實(shí)施例3
[0031]從腎癌病人(病人代碼為LMC584)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常腎組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把腎正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和腎正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個(gè)孔中培養(yǎng)。腎正常組織標(biāo)記為 584Ν-1、584Ν-2、584Ν-3 和 584Ν-4 ;腎癌腫瘤組織標(biāo)記為 584Tu-l、584Tu-2、584Tu_3 和584TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和IOOOIU白細(xì)胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細(xì)胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0032]測定結(jié)果見圖3，從圖3可以看出，從腎癌病人LMC584腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細(xì)胞株-584TU-2和584TU-3，在這兩株淋巴細(xì)胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0033]實(shí)施例4
[0034]從大腸癌病人(病人代碼為LMC586)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常大腸組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把大腸正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和大腸正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個(gè)孔中培養(yǎng)。大腸正常組織標(biāo)記為586Ν-1、586Ν-2、586Ν-3和586N-4 ;大腸癌腫瘤組織標(biāo)記為586Tu_l、586Tu-2、586Tu-3和586Tu_4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細(xì)胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細(xì)胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0035]測定結(jié)果如圖4所示，從圖4可以看出，大腸癌病人LMC586腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細(xì)胞株-586TU-3，在這個(gè)淋巴細(xì)胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0036]應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗腫瘤淋巴細(xì)胞的鑒定方法，其特征是，包括以下步驟: (1)取0.5厘米大小的癌癥病人的腫瘤組織塊，在生物安全柜中用手術(shù)刀將其切成I毫米見方的腫瘤組織小塊； (2)將腫瘤組織放于24孔培養(yǎng)板，添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細(xì)胞介素_2，然后將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (3)培養(yǎng)兩天后，再添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細(xì)胞介素_2，將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； (4)第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升培養(yǎng)基，置于-20°C冰箱保存；用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量；培養(yǎng)基中含有100皮克/毫升以上的伽馬干擾素所對(duì)應(yīng)的孔中的淋巴細(xì)胞，是具有抗腫瘤活性的淋巴細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征是，步驟(2)中，24孔培養(yǎng)板每孔放入一塊(I)所述腫瘤組織小塊；每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細(xì)胞介素_2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征是，步驟(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細(xì)胞介素-2。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103823068SQ201310690699
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】周菊華 申請(qǐng)人:周菊華