專利名稱：奈瑟氏球菌乳鐵蛋白結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸、它們所編碼的多肽以及這類多肽和多核苷酸的用途，以及它們的生產(chǎn)方法。更具體地說，本發(fā)明的多肽和多核苷酸涉及奈瑟氏球菌外膜蛋白(OMP)家族，具體涉及乳鐵蛋白(lactoferrin)-結(jié)合蛋白B(LbpB)。另外，本發(fā)明還涉及LbpB的治療用途，例如用于制備抗奈瑟氏球菌疾病的疫苗。
背景技術(shù)：
腦膜炎是由細(xì)菌或病毒引起的，迄今為止由細(xì)菌引起的這類疾病最為嚴(yán)重。其中起主要作用的細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌和肺炎鏈球菌。由于抗乙型流感嗜血桿菌(Hib)疫苗研究成功并結(jié)合到常規(guī)嬰兒接種中，所以，腦炎奈瑟氏菌便成為全世界范圍內(nèi)的腦炎的主要病因，目前單美國每年就有約2600個病例。
根據(jù)莢膜多糖組成的不同，腦炎奈瑟氏菌可分為13個血清組。此外，根據(jù)該細(xì)菌的其他組分，每個血清組可以進(jìn)一步分為血清型、亞型以及免疫型。其中的3個血清組(甲、乙和丙)引發(fā)的腦炎占全部病例的90％，在發(fā)達(dá)的工業(yè)化國家中，血清組乙引發(fā)的腦炎占全部病例的50～80％。
現(xiàn)已有的用莢膜多糖制成的高效疫苗可以預(yù)防由腦炎奈瑟氏菌血清組甲和丙引發(fā)的腦炎。血清組丙多糖疫苗在年齡不足2歲(該年齡段是腦炎發(fā)病的高危期)的幼兒體內(nèi)不會產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，但是通過把這些多糖偶聯(lián)到載體蛋白上，可以克服這一缺陷。偶聯(lián)的另外一個優(yōu)點(diǎn)是可以引發(fā)針對該抗原的免疫記憶。
相反，奈瑟氏菌血清組乙的多糖無論是否以偶聯(lián)形式存在，都對人幾乎或根本不具有免疫原性。因此，特別希望在以多糖為基礎(chǔ)的疫苗之外，能得到抗由腦炎奈瑟氏菌(特別是血清組乙)引發(fā)的奈瑟氏球菌疾病的疫苗。
一類有希望的侯選疫苗是可以使用腦炎奈瑟氏菌外膜蛋白(OMPs)，因為它們可以提供具有免疫原性并能引發(fā)人體免疫應(yīng)答的抗原。特別是負(fù)責(zé)把鐵攝入細(xì)胞內(nèi)的OMPs前景十分看好。
鐵是大部分細(xì)菌的必需營養(yǎng)物。在人體的細(xì)胞外腔室中，鐵主要是與血清中的運(yùn)鐵蛋白以及粘膜表面上的乳鐵蛋白結(jié)合在一起，以復(fù)合態(tài)形式存在(Finkelstein et al.，1983)，而游離態(tài)的量極微。因此，獲得有效數(shù)量的鐵是病原菌的一個重要毒力因素。具體就腦炎奈瑟氏球菌(一種嚴(yán)格的人體致病菌)而言，它的鐵需求是通過利用針對運(yùn)鐵蛋白或乳鐵蛋白等人的鐵-螯合蛋白的受體來滿足的，這樣使得該菌體細(xì)胞能夠結(jié)合這些蛋白從而攝入其生長所需的鐵。當(dāng)該細(xì)菌感覺到鐵限制時，便會誘導(dǎo)合成這些受體蛋白。
這些參與從運(yùn)鐵蛋白TbpA和TbpB(Cornelissen et al.，1992；Legrain et al.，1993；Anderson et al.，1994)以及乳鐵蛋白結(jié)合蛋白A(LbpA)中(Pettersson et al.，1993；1994b；Biswas和Sparling，1995)攝取鐵的受體蛋白已被克隆并測序。這些結(jié)合運(yùn)鐵蛋白的受體蛋白在外膜中形成復(fù)合物。在腦炎奈瑟氏球菌中，TbpA和TbpB二者對于鐵轉(zhuǎn)運(yùn)來說都是必不可少的(Irwin et al.，1993)。TbpA是膜整合蛋白，而TbpB是一種脂蛋白，并且它僅以脂基元部分錨定在胞膜上。關(guān)于這些受體處理那些運(yùn)載了鐵的運(yùn)鐵蛋白的機(jī)制，目前的模式是結(jié)合形成受體復(fù)合物。在該復(fù)合物中，TbpB蛋白能夠識別結(jié)合鐵的-或脫鐵的運(yùn)鐵蛋白。與運(yùn)鐵蛋白的結(jié)合可以導(dǎo)致該受體構(gòu)象的改變，這使得鐵從運(yùn)鐵蛋白上釋放出來，并在TbpA上開放出一個閘門性的孔道，鐵得以轉(zhuǎn)運(yùn)通過上述外膜(Cornelissen和Sparling，1994；1996)。
乳鐵蛋白也被認(rèn)為是腦炎奈瑟氏球菌的一種重要毒力因子。進(jìn)入人體的主要位點(diǎn)是鼻咽部，這里乳鐵蛋白是主要的鐵來源。而且，初步報告顯示在急性炎癥中乳鐵蛋白能夠穿過血-腦屏障(Gschwentneret al.，1997)。在感染晚期，可能乳鐵蛋白也是腦膜炎球菌的重要鐵來源，這時該細(xì)菌已經(jīng)到達(dá)腦膜。用親和分離方法，最初鑒定出了單一的乳鐵蛋白結(jié)合蛋白(Schryvers和Morris，1988)。該受體的結(jié)構(gòu)基因定名為LbpA，其特征已清楚(Pettersson et al.，1993；1994b；Biswas和Sparling，1995)，已經(jīng)提出了該蛋白在外膜中的拓?fù)鋵W(xué)模型(Pettersson et al.，1994a)。該蛋白表現(xiàn)出與TbpA的同源性。此外，已經(jīng)鑒定出了lbpA基因上游的部分可能的開放閱讀框，并且推導(dǎo)的氨基酸序列與TbpB呈現(xiàn)出同源性(Pettersson etal.，1994a)。
TbpB和其他純化的腦炎球菌OMPs是此前專利申請的主要目標(biāo)，用它們來制備抗腦炎奈瑟氏球菌的疫苗(例如，TbpB，WO9307172；22kDa表面蛋白，WO9629412；血紅蛋白受體，WO9612020；膜孔蛋白，WO9503413；菌毛蛋白，WO9408013；64kDa OMP，EP474313-B1)。
需要對OMP家族另外成員進(jìn)行鑒定和并對其特征進(jìn)行，這些成員在預(yù)防、緩解或矯正功能異?；蚣膊≈邪l(fā)揮著作用，所述功能異常或疾病包括但不限于奈瑟氏球菌疾病(例如腦膜炎)。
抗LbpA的抗體似乎不能殺細(xì)菌，因而它在用作疫苗侯選蛋白方面受到限制(Pettersson et al.，1993)。
本發(fā)明鑒定并特征化了另一個結(jié)合乳鐵蛋白的受體蛋白，即乳鐵蛋白結(jié)合蛋白B(LbpB)，它在利用來自乳鐵蛋白的鐵方面發(fā)揮的作用，以及它的治療用途。
LbpB具有多種優(yōu)勢，超過了其他的OMP疫苗侯選蛋白。首先，在腦膜炎球菌疾病的血液階段，人乳鐵蛋白是該機(jī)制的主要來源，因為與人運(yùn)鐵蛋白相比它結(jié)合鐵的親和力要大300倍，因此用乳鐵蛋白作為鐵來源對于該機(jī)制來說是必不可少的。第二，乳鐵蛋白具有已知的抗細(xì)菌功效，感染時它在血液中的濃度會升高。因此，對于該機(jī)制來說，結(jié)合人乳鐵蛋白是獲得抗性的重要途徑。最后，在細(xì)菌進(jìn)入人體的部位(鼻咽部)，人乳鐵蛋白是腦炎奈瑟氏球菌獲得鐵的主要來源。
這些優(yōu)勢的重要性在于體內(nèi)的絕大多數(shù)腦炎球菌的細(xì)胞表面都可能表達(dá)有LbpB抗原；由于必須高效地結(jié)合乳鐵蛋白，所以LbpB的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域可能十分保守，抗LbpB抗原的免疫反應(yīng)不僅能阻止血液中腦炎球菌的感染，而且它還能阻止上述機(jī)制在鼻咽部的運(yùn)行。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及Lbp多肽以及用于生產(chǎn)這些多肽的重組材料和方法。本發(fā)明的另一方面涉及利用這類多肽或多核苷酸的方法。這些用途中包括對奈瑟氏球菌疾病的預(yù)防和治療。還有另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測與Lbp存在有關(guān)的疾病的診斷方法。
附圖簡述

圖1.對生長在鐵含量低于最低限的全細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行Western印跡分析。泳道1和5，BNCV菌株；泳道2和6，lbpA突變的CE1452菌株；泳道3和7，lbpB突變的CE1454菌株；泳道4和8，1bpAB突變的CE1402菌株。使用的抗血清針對以lbpB序列為基礎(chǔ)合成多肽。泳道1～4，血清17-3抗肽鏈C1。泳道5～8，血清19-1抗肽鏈E1。標(biāo)準(zhǔn)分子量的位置以千為單位標(biāo)示在右側(cè)。LbpB蛋白用箭頭在左側(cè)標(biāo)明。
圖2.BNCV菌株中l(wèi)bpB和lbpA基因DNA片段的限制酶譜。不同重組質(zhì)粒中的插入子和PCR產(chǎn)物(PCR)以開放框表示。包含lbpBA位點(diǎn)的質(zhì)粒pAM23和pAMII的特征前面已有描述(Pettersson et al.，1993，1994a)。開放閱讀框架用粗箭頭標(biāo)示。用于篩選文庫和Southern雜交的探針顯示在開放閱讀框架之上。用于PCR擴(kuò)增的引物顯示在開放閱讀框架之下。在pAM6K中卡那霉素抗性框的插入位點(diǎn)用開放的三角表示。在pAM23E中的紅霉素抗性框的插入位點(diǎn)用封閉的三角表示。
圖3.BNCV的LbpB蛋白和B16B6的TbpB蛋白序列比較。一致的氨基酸以破折號表示。右邊的數(shù)字表示氨基酸位置。為了得到最佳對齊方式，允許有間斷出現(xiàn)。用于免疫小鼠的肽顯示在LbpB序列之上。富含陰性電荷的氨基酸殘基的兩個節(jié)段以下畫線標(biāo)示?？赡艿男盘栯腎I切割位點(diǎn)在序列上以箭頭標(biāo)示。
圖4.LbpB上游啟動子序列。翻譯起始位點(diǎn)(ATG)以粗體標(biāo)示。核糖體結(jié)合位點(diǎn)、可能的-10和-35序列以下畫線標(biāo)記(分別以粗線和細(xì)線)；可能的Fur框用框標(biāo)示。
圖5.對來自培養(yǎng)在TSB培養(yǎng)基(泳道1、3、5和7)或加EDDA的TSB(泳道2、4、6和8)中全細(xì)胞抽提蛋白的Western分析。所用抗體為針對LbpA(組A)的單克隆抗體mn98K1和mn98K2及針對LbpB肽C1(組B)的抗血清17-3。泳道1和2，BNCV株；泳道3和4，lbpA突變的CE1452；泳道5和6，lbpB突變的CE1454；泳道7和8；lbpAB突變的CE1402。
圖6.A.在缺鐵狀態(tài)下培養(yǎng)的腦膜炎球菌BNCV株外膜蛋白的Western分析。外膜蛋白在非變性條件下電泳，LbpB蛋白用針對合成肽A1的血清來檢測。泳道1和2標(biāo)示電泳前分別用0℃和95℃處理。分子量標(biāo)準(zhǔn)在圖右以千計。B.在缺鐵狀態(tài)下培養(yǎng)的腦膜炎球菌BNCV株外膜蛋白在Western印跡中同乳鐵蛋白的結(jié)合分析。外膜復(fù)合物中蛋白在非變性條件下電泳，轉(zhuǎn)印膜同過氧化物酶偶連的人乳鐵蛋白孵育。泳道1和3標(biāo)示樣品在電泳前分別在0，37，95℃孵育。分子量標(biāo)準(zhǔn)以千計，標(biāo)示在右邊。
圖7.在全細(xì)胞ELISA中乳鐵蛋白同lbp突變體的結(jié)合分析。包被用菌株指示在右邊。乳鐵蛋白分別以200，100，50，25，12.5，6.25，3.125和0ng/ml濃度加入(1-8排)。乳鐵蛋白同細(xì)胞的結(jié)合用過氧化物酶偶連的乳鐵蛋白的特異抗血清來檢測。
圖8.對重組人乳鐵蛋白菌株的平板飼喂(plate feeding)分析。僅顯示相關(guān)的平板部分。右邊指示的細(xì)胞為鐵限制條件平板中所鋪細(xì)菌。滴加所指示濃度的乳鐵蛋白對生長刺激作用在過夜培養(yǎng)后監(jiān)測。箭頭所示組B中滴加的位置。在本實驗中，使用11％鐵飽和的乳鐵蛋白。
圖9.5個來自腦膜炎球菌的LbpB蛋白的序列對比。對比用CLUSTAL程序(PC Genes，IntelliGenetics)，手工優(yōu)化。右邊數(shù)字標(biāo)示氨基酸位置。為達(dá)到最佳對齊效果，允許右間隔出現(xiàn)。對于5個序列均一致的位置用*標(biāo)示。
圖10.A.pJP29(Bosch et al.，1986)、pAM31和pAM32相關(guān)部分的限制酶譜。僅顯示插入部分。載體為pACYC184。pJP29在其自身啟動子后面有phoE基因(淺灰色)。啟動子和側(cè)翼序列為白色。PstI位點(diǎn)相當(dāng)于信號序列和phoE蛋白成熟部分的序列邊緣。pAM31從左到右包含phoE啟動子(白色)、編碼PhoE信號序列(淺灰色)和成熟LbpB(黑色)的重組基因。相當(dāng)于LbpA(深灰色)N端部分、PhoE的C端部分(淺灰色)和側(cè)翼序列(白色)也包含在內(nèi)。pAM32是通過插入一編碼His標(biāo)簽和因子Xa切割位點(diǎn)的接頭插入pAM31的PstI位點(diǎn)來得到。pAM31和pAM32的詳細(xì)構(gòu)建參照實施例8。pAM32中的限制酶位點(diǎn)以括弧標(biāo)示，因為這些位點(diǎn)在克隆過程中丟失。
B.野生型和重組構(gòu)建體中LbpB氨基酸序列比較。僅顯示LbpB/PhoE信號序列和成熟LbpB中的第一和最后一位氨基酸。整個His標(biāo)簽和因子Xa切割位點(diǎn)都有顯示。導(dǎo)肽酶I和II(分別為LpaseI和II)和因子Xa切割位點(diǎn)以箭頭指示。
圖11.用PAGE對重組蛋白進(jìn)行純化。泳道1和2分別標(biāo)示樣品在電泳前在0℃和100℃孵育。分子量標(biāo)準(zhǔn)顯示在右邊，以KDa計。
圖12.用折疊形式(泳道1、3、5、7、9)和變性形式(泳道2、4、6、8、10)的重組LbpB對5個康復(fù)人血清的Western分析。泳道1和2，血清69；泳道3和4，血清262439；泳道5和6，血清262532；泳道7和8，血清263017；泳道9和10，血清330。分子量標(biāo)準(zhǔn)在右邊以千道爾頓計。左邊箭頭指示變性(dLbpB)和折疊蛋白(fLbpB)的位置。
圖13.按實施例10描述的抗人全細(xì)胞和抗LbpB的ELISA結(jié)果。A.用腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株全細(xì)胞免疫的抗LbpB應(yīng)答。用PBS免疫作為對照。B..用LbpB或腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株全細(xì)胞免疫的抗全細(xì)胞(BNCV生長在缺鐵狀態(tài)下)應(yīng)答。用PBS免疫作為對照。C.用LbpB或腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株全細(xì)胞免疫的抗全細(xì)胞(H44/76生長在缺鐵狀態(tài)下)應(yīng)答。用PBS免疫作為對照。
圖14.抗全細(xì)胞和抗BNCV株LbpB血清的殺菌活性(表8)結(jié)果，按實施例10完成。A.對腦膜炎奈瑟氏菌株H44/76的殺菌滴度(生長在富鐵環(huán)境下)。B.對腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76菌株的殺菌滴度(生長在缺鐵狀態(tài))。
發(fā)明詳述定義提供下列定義是為了有助于理解本發(fā)明中使用的某些術(shù)語。
“LbpB”通常是指多肽，優(yōu)選為一種脂蛋白，該多肽，具有SEQID NO2、4、6、8或10所示的氨基酸序列，或者其等位基因突變體。
“LbpB活性或LbpB多肽活性”或者“LbpB或LbpB多肽的生物學(xué)活性”是指所述LbpB的代謝或生理功能，包括類似活性。特別地，LbpB活性是指與人乳鐵蛋白結(jié)合的能力。LbpB的活性可以用實施例6中描述的方法來測試。該說明書中還包括了所述LbpB的抗原性和免疫原性。這種抗原性最好能用實施例9中描述的方法測試，優(yōu)選按照實施例10A中的描述使用抗腦炎球菌BNCV菌株的LbpB的多克隆血清。按照實施例10B的描述，可以通過使用腦炎球菌BNCV菌株的純化LbpB的ELISA實驗測量抗體反應(yīng)(使用突變株生產(chǎn)的抗體)。
“l(fā)bpB基因”是指具有SEQ ID NO1所示的100～2274位核苷酸序列的多核苷酸，或SEQ ID NO3、5、7或9所示的核苷酸全序列，或其等位突變體以及/或它們的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明中使用的“抗體”包括多克隆及單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體，以及Fab片段，包括Fab的產(chǎn)物或者其他免疫球蛋白表達(dá)文庫。
“分離的”是指從自然狀態(tài)利用人工操作改變后的狀態(tài)。如果“分離的”組合物或物質(zhì)是天然生成的，那么它已經(jīng)被改變或從原始的環(huán)境中移取出來了，或者兩者情況兼而有之。例如，本發(fā)明使用該術(shù)語時，動物活體中天然出現(xiàn)的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是當(dāng)同樣的多核苷酸或多肽與其天然狀態(tài)下的共存物隔離開后，這些物質(zhì)就是“分離的”。
“多核苷酸”通常是指任一寡聚核糖核苷酸或寡聚脫氧核糖核苷酸，它們可以是未被修飾的RNA或DNA或者經(jīng)過修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷卑ǖ幌抻趩捂満碗p鏈DNA、具有單鏈和雙鏈區(qū)域混合結(jié)構(gòu)的DNA、單鏈和雙鏈RNA、具有單鏈和雙鏈區(qū)域混合結(jié)構(gòu)的RNA、由單鏈或者更典型地由雙鏈或具有單鏈和雙鏈區(qū)域混合結(jié)構(gòu)的DNA和RNA組成的雜合分子。此外，“多核苷酸”還可以是包括RNA或DNA或者RNA和DNA都包括的三鏈區(qū)域。術(shù)語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾后的堿基的DNAs或RNAs以及具有為穩(wěn)定或其他目的而修飾過的骨架的DNAs或RNAs。“修飾后的”堿基包括，例如三苯甲基化堿基以及次黃嘌呤核苷等非常見堿基。已經(jīng)有多種修飾用于了DNA和RNA；因此，多核苷酸包括天然發(fā)現(xiàn)的典型多核苷酸的化學(xué)、酶學(xué)或代謝修飾形式，以及DNA和RNA的化學(xué)形式和作為病毒和細(xì)胞特征的RNA?！岸嗪塑账帷边€包括經(jīng)常被稱為寡核苷酸的較短的多核苷酸。
“多肽”是指任意一種包括2個或更多個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)，這些氨基酸彼此之間通過肽鍵或肽電子等排物等修飾后的肽鍵連接在一起?！岸嚯摹笔侵竿ǔ１怀蔀殡?、寡肽或寡聚體的短鏈以及通常被成為蛋白質(zhì)的長鏈。多肽可以包括除那20個基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄓ梅g后處理等天然方法或者本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾后的氨基酸序列。在基本教科書和更詳細(xì)的專著以及長篇研究文獻(xiàn)中都有這類修飾的詳細(xì)描述。修飾可以發(fā)生在多肽的任一位置，包括多肽骨架、氨基酸側(cè)鏈或羧基末端?？梢岳斫獾酵活愋偷男揎椏梢栽诮o定多肽的幾個位置上以同樣或不同的程度出現(xiàn)。另外，一種給定多肽可以包含多種類型的修飾。多肽可以因遍在蛋白化而具有分枝，它們可以是有或無分枝的環(huán)型。環(huán)型、分枝以及分枝環(huán)型多肽可以來自翻譯后的天然處理或者通過合成方法獲得。修飾包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、共價連接黃素、共價連接亞鐵血紅素基元、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂或脂類衍生物、共價連接磷酯酰肌醇、交連、環(huán)化、形成二硫鍵、去甲基化、形成共價交連、形成焦谷氨酰、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI固定結(jié)構(gòu)、羥基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硒?；?selenoylation)、硫酸化、精氨酸化等轉(zhuǎn)運(yùn)-RNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)添加氨基酸作用、遍在化作用。參見，例如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，紐約，1993以及蛋白質(zhì)翻譯后共價修飾，B.C.Johnson，Academic press，紐約，1983中的Wold，f.，蛋白質(zhì)翻譯后修飾展望和前景，pgs.1-12；Seifter et al.，“對蛋白修飾和非蛋白輔因子的分析”，Meth Enzymol(1990)182626-646以及Rattan et al.，“蛋白分析翻譯后修飾及老化”，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“突變體”是指那些分別與參照多核苷酸或多肽不同但保留了生物特性的多核苷酸或多肽。一種多核苷酸典型突變體在核苷酸序列上與另一個參照多核苷酸不同。突變體核苷酸序列的變化可能或者不會改變參照多核苷酸所編碼多肽的序列。正如下面討論的那樣，核苷酸的變化可能會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)序列所編碼多肽中發(fā)生氨基酸的取代、添加、缺失、融合及截短。一種多肽的典型突變體在氨基酸序列上不同于另一個參照多肽。通常，差別限制在參照多肽和突變體的序列總體上十分近似而且在許多區(qū)域中完全相同。一種突變體和參照多肽之間可能因下列情況在氨基酸序列上不同任一組合的1個或多個氨基酸的取代、添加、缺失。一個取代或插入的氨基酸可以是或不是由遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的突變體可以是天然生成的，例如等位突變體(例如，SEQ ID NO3、5、7或9是SEQ ID NO1所示的lbpB多核苷酸的突變體；SEQ ID NO4、6、8或10是SEQ ID NO2所示的LbpB多肽的突變體)，或者它可能是未知的天然生成突變體。多核苷酸或多肽的非-天然生成可以通過誘變技術(shù)或通過指導(dǎo)合成獲得。突變體應(yīng)該保留LbpB多肽的一種或多種生物活性。它們要么能結(jié)合人乳鐵蛋白(優(yōu)選按照實施例6中的描述測試該活性)，或者具有與LbpB近似的抗原性或免疫原性?？乖缘臏y試最好采用實施例9中描述的免疫印跡法，優(yōu)選使用實施例10A中描述的抗腦膜炎球菌BNCV株的LbpB的多克隆血清。免疫原性的測試最好按照實施例10B中描述的那樣，使用來自腦膜炎球菌BNCV株的純化LbpB通過ELISA測量抗體應(yīng)答(使用用突變體制備的多克隆血清)。優(yōu)選地，一種突變體應(yīng)該保留上述全部生物活性。
“同一性”是指對核苷酸序列或氨基酸序列同一性的度量。通常，序列要對齊以便獲得最高的序列匹配(order match)。就其本身而言，“同一性”具有技術(shù)識別意義，并且可以用公開的技術(shù)來計算。見，例如(計算分子生物學(xué)，Lesk，A.M.，編.，OxfordUniversity Press，New York，1988；BiocomputingInformaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，NewYork，1993；序列數(shù)據(jù)的計算機(jī)分析，第1部分，Griffin，a.M.，and Griffin，h.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；分子生物學(xué)中的序列分析，von Heijine，G.，Academic Press，1987；以及序列分析引物，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991)。有大量的方法可以用于測量兩個多核苷酸或多肽序列之間的同一性，術(shù)語“同一性”是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(Carillo，h.，and Lipton，D.，SIAM J AppliedMath(1988)481073)。通常用于測定兩個序列之間的同一性或相似性的方法包括，但不限于下述文獻(xiàn)公開的方法巨型計算機(jī)指南，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，andCarillo，H.，and Lipton，D.，AIAM J Appied Math(1988)481073。測定同一性和近似性的方法已被編制成電腦程序。優(yōu)選的測定兩個序列之間同一性及相似性的電腦程序方法包括，但不限于，GCS程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research(1984)12(1)387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，s.F.Et al.，JMolec Biol(1990)215403)。
舉例說明，如果一段多核苷酸與SEQ ID NO1所示的參照核苷酸序列具有至少例如95％的“同一性”，那么就可以認(rèn)為該多核苷酸的核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)序列之間是相同的，除去該多核苷酸序列可以在SEQ ID NO1所示標(biāo)準(zhǔn)序列每100個核苷酸中有平均5個點(diǎn)的突變。換句話說，為了獲得與標(biāo)準(zhǔn)序列之間具有至少95％同一性的多核苷酸，標(biāo)準(zhǔn)序列中至多可以有5％的核苷酸缺失或被另一個核苷酸取代，或者至多允許有占標(biāo)準(zhǔn)序列核苷酸總數(shù)5％的核苷酸插入到標(biāo)準(zhǔn)序列中。標(biāo)準(zhǔn)序列中這些突變可以發(fā)生在標(biāo)準(zhǔn)序列的5’末端或3’末端，或者這些末端之間的任一位置上，既可以單個地散布在標(biāo)準(zhǔn)序列中也可以連續(xù)成1或多個簇存在于標(biāo)準(zhǔn)序列中。
類似地，如果一段多肽與SEQ ID NO2所示的參照氨基酸序列具有至少例如95％的“同一性”，那么就可以認(rèn)為該多肽的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)序列之間是相同的，除去該多核苷酸序列可以在SEQ ID NO2所示標(biāo)準(zhǔn)序列每100個氨基酸中有平均5個點(diǎn)的突變。換句話說，為了獲得與標(biāo)準(zhǔn)序列之間具有至少95％同一性的多肽，標(biāo)準(zhǔn)序列中至多可以有5％的氨基酸缺失或被另一個氨基酸取代，或者至多允許有占標(biāo)準(zhǔn)序列氨基酸總數(shù)5％的氨基酸插入到標(biāo)準(zhǔn)序列中。標(biāo)準(zhǔn)序列中這些變化可以發(fā)生在該標(biāo)準(zhǔn)序列的氨基末端或羧基末端，或者這些末端之間的任一位置上，既可以單個地散布在標(biāo)準(zhǔn)序列殘基中也可以連續(xù)成1或多個簇存在于標(biāo)準(zhǔn)序列中。
本發(fā)明的多肽一方面，本發(fā)明涉及LbpB多肽(或LbpB蛋白)。所述的LbpB多肽包括SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的多肽(殘基1～18是每個蛋白的天然信號肽，殘基Cys19是天然成熟蛋白質(zhì)中被脂化的氨基酸)、包含SEQ ID NO2、4、6、8或10所示氨基酸序列的多肽、以及包含在其全長序列上與SEQ ID NO2、4、6、8或10所示序列具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽，以及還可以更優(yōu)選至少70％同一性，以及還可以更優(yōu)選至少80％同一性，以及甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO2、4、6、8或10所示序列具有至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度優(yōu)選的。LbpB多肽中還包括那些氨基酸序列與SEQ ID NO2、4、6、8或10所示氨基酸序列在全長上具有65％同一性的多肽，以及更優(yōu)選與SEQ ID NO2、4、6、8或10至少70％同一性，以及更優(yōu)選至少80％同一性，以及還有更優(yōu)選至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度優(yōu)選的。
SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的Lbp多肽分別來腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株、M981株、H44/76株、M990株以及881607株。
所述的Lbp多肽可以是“成熟”蛋白或者也可以是融合蛋白等更大蛋白的一部分。但所述多肽包括含有下列序列的附加氨基酸序列時會更有利分泌或前導(dǎo)序列(例如天然LpbB前導(dǎo)序列、SEQ ID NO2、4、6、8或10中的第1～18位殘基)、原序列、多個組氨酸等有助于純化的序列或者在重組生產(chǎn)過程中起穩(wěn)定作用的外加序列。
本發(fā)明還包括LpbB多肽的片段。一種片段是其序列僅與上述LpbB多肽氨基酸序列中的一部分而非全長相同。與LpbB多肽相同，片段可以是“自由鏈”，或者包括在一種較大多肽中形成該多肽的一部分，優(yōu)選形成該多肽中的單個連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明多肽片段的代表性實例包括LpbB多肽中的起止氨基酸大約為下列序數(shù)的區(qū)段1～20、21～40、61～80、81～100以及101～結(jié)尾。這種情況下的“大約”包括在一端或兩端都比具體列舉出范圍多或少幾個、5、4、3、2或1個氨基酸。
優(yōu)選片段包括，例如，具有刪減了下列殘基的LpbB多肽序列的截短多肽包括氨基末端在內(nèi)的一連串殘基，或者包括羧基末端和/或跨膜區(qū)在內(nèi)的一連串殘基，或者其中一串包括氨基端而另一串包括羧基端的兩連串殘基。另外還優(yōu)選具有以下結(jié)構(gòu)或功能特性的片段，例如包括α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)域、β-折疊和B-折疊形成區(qū)域、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)域、卷曲和卷曲形成區(qū)域、親水區(qū)、疏水區(qū)、α兩親性區(qū)域、β兩親性區(qū)域、柔性區(qū)、表面-形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)域以及高度抗原性標(biāo)示區(qū)的片段。其他優(yōu)選片段為生物活性片段。生物活性片段是指可以介導(dǎo)LpbB活性的片段，其中包括具有類似活性或改良活性或者消除了沒用活性的片段。另外還包括對動物，特別是對人具有抗原性或免疫原性的片段。
片段應(yīng)該保留LpbB多肽活性中的一種或多種。優(yōu)選地，該多肽應(yīng)該是從SEQ ID NO2、4、6、8或10氨基酸序列的繼續(xù)伸展(16個氨基酸以上)，具有全長LpbB多肽的抗原性和免疫原性，該多肽是從全長LpbB多肽衍生并經(jīng)處理得到的。
已定義序列和片段的突變體也是本發(fā)明的部分。優(yōu)選的突變體與標(biāo)準(zhǔn)物的區(qū)別在于保守的氨基酸取代-即，一個氨基酸被另一個具有相似特性的氨基酸取代。典型的這類取代是下列氨基酸間的取代Ala、Val、Leu和Ile，Ser和Thr、酸性殘基Asp和Glu；Asn和Gln；以及堿性殘基Lys和Arg；或者芳香族殘基Phe和Tyr。具體優(yōu)選有幾個、5～10個或1～2個氨基酸以任一組合被取代、缺失或添加。
最優(yōu)選的突變體與標(biāo)準(zhǔn)物之間的區(qū)別在于其他LpbB序列中結(jié)構(gòu)上等效的位置(同源性對照顯示)上的氨基酸取代(例如實施例9中所示的5個LpbB序列的同源性對比)。特別優(yōu)選的突變體包含全長上與標(biāo)準(zhǔn)序列(例如SEQ ID NO2、4、6、8或10)之間至少65％同源的氨基酸序列，以及還有更優(yōu)選至少70％同一性，以及還有更優(yōu)選至少80％同一性，以及甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO2、4、6、8或10所示序列具有至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度優(yōu)選的。例如，圖9中如果來自BNCV的LpbB是標(biāo)準(zhǔn)序列，一種突變體將包括第300～308位殘基被下列菌株LpbB序列中的等效位置上的氨基酸所取代H44/76株(分別為第305～313位殘基)、M990株(分別為第307～315位殘基)、M981株(分別為第302～310位殘基)或者881607株(分別為第303～311位殘基)。因此，氨基酸序列NPDLAKSHA取代了STDVATNLA[ST(來自M981第302～303位殘基)，D(來自BNCV第302位殘基)，V(來自881607的第306位殘基)、A(來自M990第311殘基)、T(來自H44/76第310位殘基)、NLA(來自M990的第313～315殘基)]，得到的蛋白質(zhì)可以歸類為突變體和本發(fā)明的多肽。
這類取代還可以包括缺失，例如如果M981株LbpB的第357～366位殘基缺失(這時來自BNCV的LbpB中沒有任何等效氨基酸位置)，這種蛋白質(zhì)可以成為本發(fā)明的突變體和多肽。
此外，腦膜炎奈瑟氏球菌和其他奈瑟氏菌株(例如淋病奈瑟氏球菌)的基因組彼此之間在基因組上的同源性很高。腦膜炎奈瑟氏球菌與粘膜炎莫拉氏菌(此前稱為粘膜炎奈瑟氏球菌)的基因組也具有足夠高的同源性，從而使得可以發(fā)生基因交換。如果奈瑟氏菌株與粘膜炎莫拉氏菌株之間的同源性百分比滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，那么它們的LbpB等效蛋白也是本發(fā)明所述的多肽。此外還有，如果在用BLAST程序(Altschul，S.F.et al.，(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402；Karlin，S.And Altschul，S.F.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68；Karlin，S.And Altschul，S.F.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)對蛋白全長進(jìn)行測量時，它與標(biāo)準(zhǔn)序列其中之一(SEQ ID NO2、4、6、8或10)具有至少65％序列相似性，那么這類等效蛋白也是本發(fā)明所述的多肽，以及還有更優(yōu)選至少70％同一性，以及還有更優(yōu)選至少80％同一性，以及甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO2、4、6、8或10所示序列具有至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度優(yōu)選的。這類蛋白應(yīng)該結(jié)合人乳鐵蛋白(根據(jù)定義)，而且還應(yīng)該能與抗腦膜炎球菌菌株的LbpB的多克隆血清交叉反應(yīng)。用來自SEQ ID NO1-10所示的腦膜炎球菌多核苷酸和多肽的信息，可以容易地測定出這類突變體的確切氨基酸序列。
本發(fā)明的LbpB多肽可以用任一方式制備。這類多肽包括經(jīng)分離的天然生成脂多肽，重組生產(chǎn)的多肽或脂多肽，合成制備的多肽，或這些方法組合制備的多肽。制備這類多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明的另一方面涉及LbpB多核苷酸。LbpB多核苷酸包括編碼LbpB多肽及其片段的分離多核苷酸以及與其緊密相關(guān)的多核苷酸。更特定地，本發(fā)明的LbpB多核苷酸包括含有包括在SEQ ID NO1、3、5、7或9中的核苷酸序列的多核苷酸以及具有SEQ ID NO1、3、5、7或9所示特定序列的多核苷酸，SEQ ID NO1、3、5、7或9分別對應(yīng)編碼SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的LbpB多肽。LbpB多核苷酸進(jìn)一步包括具有以下特征的多核苷酸其中包含的核苷酸序列全長上與編碼SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的LbpB多肽具有至少65％的同一性，以及其中包含的核苷酸序列與SEQ ID NO1中第100～2274位核苷酸核苷酸序列具有至少65％的同一性，以及其中包含的核苷酸序列與SEQ ID NO3、5、7或9所示序列具有至少65％同一性。在這種情況下，更優(yōu)選至少70％同一性的多核苷酸，特別優(yōu)選至少80％同一性的多核苷酸，尤其優(yōu)選至少90％同一性的多核苷酸。而且，至少95％同一性的多核苷酸是高度優(yōu)選的以及至少98～99％同一性的多核苷酸是最優(yōu)選的。LbpB多核苷酸還包括具有以下特征的核苷酸序列與包含在SEQ ID NO1、3、5、7或9中的核苷酸序列之間的同一性足以使得能在用于擴(kuò)增或用作探針或標(biāo)準(zhǔn)物的情況下能發(fā)生雜交。本發(fā)明還提供了與這類LbpB多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
SEQ ID NO1、3、5、7或9所示的Lbp多核苷酸分別來腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株、M981株、H44/76株、M990株以及881607株。
編碼SEQ ID NO2、4、6、8或10所示多肽的核苷酸序列可以與包含在SEQ ID NO1中第100～2274位中的多肽編碼序列具有同一性，或者分別與包含在SEQ ID NO3、5、7或9中的多肽編碼序列具有同一性，或者由于遺傳密碼的豐余性(簡并性)它可以是編碼SEQ ID NO2、4、6、8或10所示多肽。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸用于重組制備LbpB多肽時，所述多核苷酸包括編碼成熟多肽(從SEQ ID NO2、4、6、8或10第18位殘基直到C-末端)或其片段及其本身的序列；編碼位于閱讀框中的成熟多肽的序列，該序列帶有編碼下列序列其他編碼序列前導(dǎo)或分泌序列、前或原或前原蛋白序列、或者其他融合肽鏈部分(例如SEQ ID NO2中的第1～18位殘基、LbpB的天然信號序列)。例如，一種有助于融合蛋白純化的標(biāo)記序列也可以被編碼。在本發(fā)明這方面的特定優(yōu)選實施例中，標(biāo)記序列是組氨酸6聚體肽鏈或HA標(biāo)簽，或者可以是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，上述組氨酸6聚體肽鏈可由pQE載體(Qiagen，Inc)提供，其描述見Gentz et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1989)86821-824。另外還優(yōu)選把LbpB與其天然信號肽融合到一起(SEQ ID NO2中的第1～18位殘基)。所述多核苷酸還可以包括非編碼的5’和3’端序列，例如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列，剪接及聚腺苷酸化信號，核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及mRNA的穩(wěn)定序列。
另外的優(yōu)選實施方案是編碼此前描述的LbpB多肽突變體的多核苷酸。最優(yōu)選它們包括SEQ ID NO2、4、6、8或10所示LbpB多肽的氨基酸序列，其中有幾個、10～25個、5～10個、1～5個、1～3個1～2個或1個氨基酸殘基以任一組合被取代、缺失或添加，并且它們保留了至少一種LbpB多肽的生物學(xué)活性。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及能與本發(fā)明中上述序列雜交的多核苷酸。在這種情況下，本發(fā)明特別涉及能在嚴(yán)緊條件下與本發(fā)明上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本發(fā)明所述，術(shù)語“嚴(yán)緊條件”是指相互間具有至少80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，甚至更優(yōu)選97～99％同一性的序列才能發(fā)生雜交的條件。
本發(fā)明的多核苷酸與包含在SEQ ID NO1、3、5、7或9中的核苷酸序列或其片段相同或具有足夠同一性，它們可以作為cDNA及基因組DNA的雜交探針，用于分離編碼LbpB多肽的全長cDNAs和基因組克隆以及用于分離與LbpB基因具有高度相似性的其他基因(包括來自除腦膜炎奈瑟氏球菌之外菌種的編碼同源基因和直向同源基因)的cDNA及基因組克隆。這類雜交技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。典型地，這些核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)序列具有80％同一性，優(yōu)選90％同一性，更優(yōu)選95％同一性。通常，這種探針包括至少15個核苷酸。優(yōu)選地，這類探針有至少30個核苷酸以及可以有至少50個核苷酸。具體優(yōu)選探針的長度范圍為30～50個核苷酸。
在一個實施方案中，為了獲得編碼LbpB多肽的多核苷酸，其中包括來自除腦膜炎奈瑟氏球菌外菌種的同源基因或直向同源基因，進(jìn)行以下步驟在嚴(yán)緊條件下，用具有SEQ ID NO1、3、5、7或9或其片段的核苷酸序列的標(biāo)記探針對適當(dāng)文庫進(jìn)行篩選；分離包含所述多核苷酸序列的全長cDNA及基因組克隆。因此另一方面，本發(fā)明的LbpB多核苷酸進(jìn)一步包括核苷酸序列，該核苷酸序列能在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、3、5、7或9或其片段的核苷酸序列雜交。LbpB多肽還包括這樣的多肽，其氨基酸序列由上述雜交條件下獲得的核苷酸序列編碼。這類雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。嚴(yán)緊條件如上所述，或者替代地，在含有下列物質(zhì)的溶液中42℃過夜溫育50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’溶液、10％硫酰葡聚糖以及20mg/ml經(jīng)過變性的剪切后的鮭精DNA，然后在約65℃下用0.1×SSC洗滌濾膜。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以作為研究試劑和材料，來發(fā)現(xiàn)動物與人類疾病的治療和診斷方法。
載體、宿主細(xì)胞、表達(dá)本發(fā)明還涉及含有多核苷酸或本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體通過遺傳學(xué)手段構(gòu)建的宿主細(xì)胞，本發(fā)明還涉及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。也可以利用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，用來自本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA生產(chǎn)這類蛋白。
對于重組生產(chǎn)，可以用遺傳學(xué)手段構(gòu)建宿主細(xì)胞，引入用于本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或其部分。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以采用許多標(biāo)準(zhǔn)實驗手冊中描述的方法，例如，Davis et al.，BasicMethods In Molecular Biology(1986)以及Sambrook et al.，分子克隆實驗指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中的磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、微注射、陽離子脂類-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、刮擦裝載(scrape loading)、彈道(ballistic)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者感染等方法。
合適宿主的代表性實例包括腦膜炎球菌、鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌以及枯草芽孢桿菌等菌體細(xì)胞，酵母細(xì)胞以及曲霉屬細(xì)胞等真菌細(xì)胞，果蠅S2和粘蟲Sf9細(xì)胞等昆蟲細(xì)胞，CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293以及Bowes黑色素瘤細(xì)胞等動物細(xì)胞，以及植物細(xì)胞。
絕大多數(shù)的表達(dá)系統(tǒng)都可以使用。這類系統(tǒng)包括，尤其是，染色體、附加型以及病毒衍生系統(tǒng)，例如從細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入基元、酵母染色體基元、病毒中衍生而來的載體，以及從其組合衍生而來的載體，例如從粘粒和噬菌粒等質(zhì)粒及噬菌體遺傳因子中衍生而來的載體，上述病毒包括桿狀病毒、SV40等乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒以及反轉(zhuǎn)錄病毒等。所述表達(dá)系統(tǒng)可以包括調(diào)節(jié)并啟動表達(dá)的調(diào)控區(qū)。通常，適用于在所用宿主中保持、增殖或表達(dá)多核苷酸制備多肽的任一系統(tǒng)或載體都可以使用?？梢詮亩喾N熟知的常規(guī)技術(shù)中選用一種，將合適的核苷酸序列可以插入到表達(dá)系統(tǒng)中，例如下述文獻(xiàn)中記載的技術(shù)，Sambrook et al.，分子克隆實驗指南，第2版(見上述)。
為了將翻譯后的蛋白分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔、漿膜外周間隙或細(xì)胞外環(huán)境中，可以將合適的分泌信號引入到期望多肽中。這些信號對于所述多肽(SEQ ID NO2、4、6、8或10的第1～18位殘基)是內(nèi)源性的或者它們也可以是異源信號。
為了表達(dá)出脂化的重組LbpB，優(yōu)選上述內(nèi)源性信號用基因構(gòu)建體編碼，而且優(yōu)選宿主系統(tǒng)是細(xì)菌宿主。
如果表達(dá)的LbpB多肽用于篩選實驗，那么通常，優(yōu)選在細(xì)胞表面生產(chǎn)多肽。在這種情況下，可以在用于篩選實驗之前收獲細(xì)胞。如果LbpB多肽分泌到培養(yǎng)基中，那么就可以回收培養(yǎng)基從而回收并純化出多肽；如果在細(xì)胞內(nèi)制備，那么必須在回收多肽前首先裂解細(xì)胞。
可以采用熟知的方法，將LbpB多肽從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化出來，例如硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水層析、親和層析、羥磷灰石層析以及凝集素層析。最優(yōu)選地，使用高效液相色譜進(jìn)行純化。當(dāng)在分離和/或純化的過程中多肽發(fā)生變性時，可以采用熟知的重折疊蛋白技術(shù)來重新生成活性構(gòu)象。
診斷分析本發(fā)明還涉及LbpB的用途、抗LbpB抗體以及展示抗用作診斷試劑的LbpB的抗體的噬菌體。LbpB的檢測將會提供一種診斷方法，該方法尤其能夠增加或定義奈瑟氏球菌疾病的診斷。
診斷材料可以從目的細(xì)胞中獲得，例如血、尿、唾液、組織活檢。
因此另一方面，本發(fā)明涉及用于疾病或疑是疾病，具體為奈瑟氏球菌疾病的診斷試劑盒，該試劑盒中包括(a)LbpB多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO1、3、5、7或9所示的核苷酸序列或其片段；(b)與(a)中序列互補(bǔ)的序列；(c)LbpB多肽，優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的多肽序列或其片段；或者(d)抗LbpB多肽抗體，優(yōu)選抗SEQ ID NO2、4、6、8或10所示多肽(以及更優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8或10所示多肽第19位殘基至C-末端的區(qū)間)的抗體。
(e)展示抗LbpB多肽抗體的噬菌體，優(yōu)選抗SEQ ID NO2、4、6、8或10所示多肽(以及更優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8或10所示多肽第19位殘基至C-末端的區(qū)間)的抗體。
應(yīng)該理解的是在任一種這樣的試劑盒中，(a)、(b)、(c)、(d)或(e)可以包括一種基本成分。
抗體本發(fā)明的多肽或其片段或其類似物，或者表達(dá)它們的細(xì)胞都可以用作免疫原，制備對于LbpB多肽具有免疫特異性的抗體。術(shù)語“免疫特異性”是指所述抗體與本發(fā)明多肽之間的親和力基本上要比與現(xiàn)有技術(shù)中其他相關(guān)多肽之間的親和力大得多。
可以通過常規(guī)方法用多肽或帶有表位的片段、類似物或細(xì)胞對動物，優(yōu)選非人的動物進(jìn)行免疫，獲得抗LbpB多肽的抗體。對于制備單克隆抗體，任意一種能提供連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)的抗體的技術(shù)都可以使用。具體實例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.And Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，Immunology Today(1983)472)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，單克隆抗體和癌癥治療，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.1985)。
也可以采用生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(US4946778)來制備抗本發(fā)明多肽的抗體。另外，轉(zhuǎn)基因小鼠或包括其他哺乳動物的其他有機(jī)體可以用來表達(dá)人源抗體。
上述抗體可以用于分離或鑒定表達(dá)有多肽的克隆，或者用于親和層析純化抗體。
抗LbpB多肽的抗體尤其還可以用于治療奈瑟氏球菌疾病(例如腦膜炎)。它們還可以用于診斷疾病。
疫苗本發(fā)明另一方面涉及誘導(dǎo)哺乳動物(優(yōu)選人)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括用LbpB多肽或帶有表位的片段、類似物、外膜囊泡或細(xì)胞(減毒或其他)免疫動物，足以產(chǎn)生能夠保護(hù)所述動物不患奈瑟氏球菌病的抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明還有另一方面涉及誘導(dǎo)哺乳動物免疫應(yīng)答的方法，該方法包括通過指導(dǎo)LbpB多核苷酸表達(dá)的載體把LbpB多肽釋放到體內(nèi)，從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答產(chǎn)生保護(hù)所述動物的抗體。
本發(fā)明另一方面涉及免疫組合物或疫苗制劑，當(dāng)導(dǎo)入哺乳動物宿主時，所述免疫組合物或疫苗制劑能在該哺乳動物中誘導(dǎo)出針對LbpB多肽的免疫應(yīng)答，其中所述的組合物包括LbpB基因、或LbpB多肽或帶有表位的片段、類似物、外膜囊泡或細(xì)胞(減毒或其他)。所述疫苗制劑可以進(jìn)一步包括一種合適載體。LbpB疫苗組合物優(yōu)選口服或非消化道(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)等注射)免疫。適于非消化道免疫的制劑包括含水及不含水滅菌注射液，該注射液可以包括抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑以及能使制劑與受體血液等張力的溶質(zhì)；以及含水及不含水滅菌懸液，該懸液可以包括助懸劑或增稠劑。所述制劑可以采用單位劑量或多劑量包裝，例如密封安瓿和管瓶，可以凍干形式保存，只需要在使用前添加滅菌脂類載體。所述疫苗制劑也可以包括用于增強(qiáng)制劑免疫原性的佐劑系統(tǒng)，例如水包油系統(tǒng)及其他本領(lǐng)域已知系統(tǒng)。劑量取決于疫苗的特定活性，而且可以用常規(guī)實驗容易地測定出來。
還有另一方面涉及包括本發(fā)明多肽的免疫原性/疫苗制劑。這類技術(shù)為本領(lǐng)域已知，參見例如Wolff et al.，Science，(1990)2471465-8。
篩選實驗本發(fā)明的LbpB多肽可以用于篩選能拮抗(拮抗劑，或稱為抑制劑)本發(fā)明LbpB多肽的化合物的方法中。因此，本發(fā)明的多肽還可以包括用于從細(xì)胞、無細(xì)胞制劑、化學(xué)文庫以及天然產(chǎn)物混合物中鑒定拮抗劑。視情況而定，這些拮抗劑可以是本發(fā)明多肽的天然或修飾后的底物、配體、受體、酶等；或者可以本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)或功能模擬物。參見Coligan et al.，Current Protocols in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
LbpB多肽具有許多種生物活性，包括多種病原性。因此，希望發(fā)現(xiàn)能夠抑制LbpB多肽功能的化合物和藥物。通常，可以將拮抗劑用于奈瑟氏球菌病等病癥的多種治療和預(yù)防用途。
通常，這類篩選方法可以包括使用能表達(dá)LbpB多肽或本發(fā)明LbpB多肽對應(yīng)物的合適細(xì)胞。這類細(xì)胞包括來自哺乳動物、酵母、果蠅或大腸桿菌的細(xì)胞。然后，將表達(dá)有LbpB多肽(或含有表達(dá)多肽的細(xì)胞膜)或LbpB多肽對應(yīng)物的細(xì)胞與一種測試化合物接觸，觀察結(jié)合情況或?qū)δ苄詰?yīng)答的抑制。將上述細(xì)胞與侯選化合物接觸的能力同未表達(dá)LbpB活性的同一種細(xì)胞進(jìn)行比較。
該實驗可以簡單地測試侯選化合物的結(jié)合能力，其中與表達(dá)LbpB多肽細(xì)胞的結(jié)合是利用與侯選化合物直接或間接相連相連的標(biāo)記物來檢測的，或者用涉及與標(biāo)記競爭物競爭的實驗來檢測。
另外，簡單地說所述實驗包括以下步驟將侯選化合物與含有LbpB多肽的溶液混合形成混合物，測量混合物中的LbpB活性，以及將混合物的LbpB活性與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較。
LbpB cDNA、蛋白以及抗該蛋白的抗體也可以用于配套下述實驗，即用于檢測加入的化合物對細(xì)胞中LbpB mRNA及蛋白的產(chǎn)量的影響的實驗。例如，可以設(shè)計ELISA實驗，用單克隆或多克隆抗體通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測量LbpB蛋白的分泌水平或細(xì)胞結(jié)合水平，用該實驗可以發(fā)現(xiàn)能夠抑制穩(wěn)定操縱的細(xì)胞或組織中LbpB產(chǎn)量的藥物(也可以稱為拮抗劑)。
LbpB多肽強(qiáng)效拮抗劑的實例包括抗體，或者有時，與LbpB多肽的配體或底物緊密相關(guān)的寡核苷酸或蛋白，例如配體配體或底物的片段；或者能于本發(fā)明多肽結(jié)合但不激發(fā)應(yīng)答的小分子，通過結(jié)合可以阻斷所述多肽的活性。
因此另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定針對LbpB的拮抗劑、配體或底物，該試劑盒包括(a)LbpB多肽，優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的多肽；(b)表達(dá)LbpB多肽的重組細(xì)胞，優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的多肽；(c)表達(dá)LbpB多肽的細(xì)胞膜，優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的多肽；或者(d)抗LbpB多肽的抗體，優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的多肽。
應(yīng)該理解的是，在任一這樣的試劑盒中(a)、(b)、(c)、(d)或(e)可以包括一種基本成分。
制劑及給藥多肽，例如LbpB多肽的可溶形式，以及拮抗肽鏈或小分子可以與一種合適的藥用載體結(jié)合配制。這類制劑包括治療有效量的多肽或化合物，以及藥用可接受載體或賦形劑。所述載體包括但不限于，鹽、緩沖性能的鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其任一組合。制劑應(yīng)該適合于給藥方式，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。本發(fā)明進(jìn)一步涉及其中包括1個或多個容器的藥物包裝和試劑盒，所述容器中盛滿了上述的本發(fā)明組合物中的一種或多種成分。
本發(fā)明的多肽或其他化合物可以單獨(dú)使用或與治療用化合物等其他化合物配合使用。
上述藥用組合物的優(yōu)選系統(tǒng)給藥方式包括注射，典型的為靜脈內(nèi)注射。也可以使用其他的注射途徑，例如皮下注射、肌內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射。系統(tǒng)給藥的替代方式包括用膽汁鹽或梭鏈孢酸或其他去污劑等滲透劑經(jīng)黏膜或經(jīng)皮給藥。此外，如果配制成腸溶或膠囊制劑，也可以采用口服給藥。這些化合物的給藥也可以采用以油膏、糊狀、凝膠等形式局部和/或定位給藥。
所需劑量范圍視下列因素的選擇而定肽、給藥途徑、制劑的實質(zhì)、患者的病情以及主治醫(yī)師的判斷。然而，合適的劑量范圍為0.1～100μg/kg(患者體重)。然而，還需要根據(jù)所獲得化合物的不同以及各種給藥途徑效率的不同，在必需的劑量范圍內(nèi)做大幅度的調(diào)整。例如，口服所需的劑量就應(yīng)該比靜脈注射要高。也可以根據(jù)經(jīng)驗調(diào)整劑量水平使之達(dá)到最佳，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
實施例除非有詳細(xì)的描述，下述實施例按照標(biāo)準(zhǔn)的實驗方法進(jìn)行，這些標(biāo)準(zhǔn)方法對熟悉本領(lǐng)域的人來說是眾所周知或常規(guī)的方法。實施例是用以說明而非限制本發(fā)明。
實施例1菌株和培養(yǎng)條件所使用的菌株列于表1。腦膜炎球菌培養(yǎng)在含Vitox(Oxiod)的GC瓊脂平板(Difco)上，在含5％CO2的37℃潮濕環(huán)境中培養(yǎng)過夜。鐵調(diào)控蛋白的優(yōu)化表達(dá)是通過加入5μg/ml的鐵螯合劑乙二胺二氧羥基苯乙酸(EDDA，Sigma)來實現(xiàn)。對制備用于SDS-PAGE、免疫印跡以及分離染色體DNA的樣品，細(xì)胞培養(yǎng)條件如上所述(Pettersson etal.，1993)。
用于擴(kuò)增λgtl1噬菌體的E.coli菌株Y1090(Young and Davis，1983)培養(yǎng)在含氨芐青霉素(100μl/ml)、0.2％麥芽糖和10mM MgCl2的Luria-Bertoldi(LB)培養(yǎng)基中。用于克隆的菌株DH5α培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，當(dāng)用于重組子篩選時，補(bǔ)加100μl/ml氨芐青霉素、25μg/ml卡那霉素或100μg/ml紅霉素。在轉(zhuǎn)化pEMBL19衍生菌后，將細(xì)菌鋪在含合適抗生素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(40μg/ml)和0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，用于篩選含插入子的質(zhì)粒。用于制備單鏈DNA的PC2494菌株培養(yǎng)在極限培養(yǎng)基板上，含有5μg/ml硫胺和0.2％葡萄糖。
實施例22A肽的鼠抗血清的制備肽(圖3)的合成使用自動肽合成儀并參照所述方法(van der Leyet al.，1991)偶連到破傷風(fēng)類毒素上。BALB/c小鼠用50μg肽和20μg QuilA佐劑免疫。加強(qiáng)兩次。在第一次注射后54天收集血清。
2BlhpB基因產(chǎn)物的鑒定為了檢測可能的lbpB基因是否編碼一蛋白，根據(jù)部分開放閱讀框架推斷的氨基酸序列合成肽(如圖3所示的Al-E1)制備抗血清。用生長在鐵限制條件下的BNCV菌株的全細(xì)胞做Western來檢測抗血清。抗肽B1的血清沒表現(xiàn)出任何反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)?？蛊渌牡目寡鍎t同一大小為大約95KDa(圖1)的條帶有反應(yīng)。因為lbpB突變體(其構(gòu)建如下所述)缺乏該條帶(圖1，泳道3和7)，可以得出lbpB是在野生型菌株表達(dá)、編碼一表觀分子量(Mr)為95000的蛋白的結(jié)論?？闺腄1和E1的一些血清還呈現(xiàn)出對一分子量為60000(圖1)的條帶有反應(yīng)。這兩種肽包含VVFGAK序列，TbpB也含該序列(圖3)。因此，68K帶可能是TbpB。為了檢驗這種可能性，用Western印跡對TbpB的突變體N91及其父系株B16B6進(jìn)行了檢測。血清19-1(抗肽E1)同B16B6菌株的95K和68K兩條帶均有反應(yīng)，但僅同N91菌株的95K帶有反應(yīng)。該結(jié)果表明68K帶實際上就是TbpB(結(jié)果未顯示)。
實施例3SDS-PAGE和免疫印跡全細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE參照以前所描述的方法進(jìn)行(Pettersson et al.，1990，1993)。對于防止LbpB變性的實驗，則需要進(jìn)行以下改動。樣品緩沖液不能包含β-巰基乙醇。在電泳前，含外膜蛋白復(fù)合物的樣品緩沖液要在冰上或37℃孵育10分鐘，而不是在95℃加熱。在乳鐵蛋白結(jié)合實驗中，聚丙烯酰胺膠是由含0.05％(w/v)SDS的5％(w/v)濃縮膠和8％(w/v)分離膠組成。電極緩沖液僅含0.05％(w/v)SDS，而不是0.1％(w/v)SDS。在100V恒壓及4℃條件下電泳2小時。標(biāo)準(zhǔn)樣品緩沖液則使用含2％SDS。
用以檢測LbpB折疊形式的外膜蛋白電泳用PhastSystem(Pharmacia)電泳系統(tǒng)，按照生產(chǎn)廠家的使用說明進(jìn)行，使用7.5％(w/v)的均一聚丙烯酰胺和SDS緩沖液。
免疫印跡參照以前的描述進(jìn)行(Pettersson et al.，1990)。在使用PhastSystem膠時，轉(zhuǎn)印緩沖液含0.05％(w/v)SDS，過氧化物酶活性的檢測使用ECL系統(tǒng)，按照生產(chǎn)廠家(Amersham)的說明進(jìn)行。鼠的抗血清以1∶500稀釋使用。LbpA特異的單克隆抗體mn98K1和mn98K2(Pettersson et al，1993)分別做1∶2000稀釋后混合使用。
實施例44A克隆和測序策略來自BNCV菌株的λgt11基因文庫最初由E.C.Gotschlich(洛克菲勒大學(xué)，紐約，美國)提供。文庫在E.coli菌株Y1090中擴(kuò)增，然后用DNA探針BE1和AP6(圖2)篩選。BE1的制備是用質(zhì)粒pAM1(Pettersson et al.，1993)的BstEII-EcoRI的355bp酶解片段。AP6的制備是用質(zhì)粒pAM6的EcoRI-EcoRV的417bp酶解片段。探針標(biāo)記、噬斑轉(zhuǎn)印和檢測參照所述方法(Pettersson et al.，1993)來進(jìn)行，使用地高辛DNA標(biāo)記和檢測試劑盒(BoheringerMannheim)。分離λDNA(Sambrook et al.，1989)，將插入片段亞克隆入嗜菌粒pEMBL 19。使用Jetstar微型柱(Genomed)按照使用說明抽提質(zhì)粒DNA。單鏈DNA用輔助噬菌體VCSM13(Stratagene)進(jìn)行擴(kuò)增。
染色體DNA的分離參照文獻(xiàn)(Ausubel et al.，1989)。DNA用AccI和DraI消化，在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離。Southern轉(zhuǎn)印按文獻(xiàn)(Pettersson et al.，1993)進(jìn)行。探針ES1(圖2)是pAM13的EcoRI-SalI的320bp酶解片段，標(biāo)記方法同上。探針同AccI/DraI酶解的1.5kb的轉(zhuǎn)印片段有反應(yīng)。從膠上分離該片段并連入pEMBL19。連接混合物用M13通用引物(Pharmacia)和LB11引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增使用一種Taq聚合酶的衍生物(Eurogentec)Goldstar聚合酶，根據(jù)使用說明進(jìn)行。PCR擴(kuò)增的1.3kb片段用瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化。
測序用deaza G/A T7測序混合物(Pharmacia)手工進(jìn)行，或使用ABI Prism 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer)進(jìn)行自動測序。對于自動測序，用Dye Terminator Cycle測序試劑盒(PerkinElmer)進(jìn)行標(biāo)記。內(nèi)部引物(由Pharmacia或Gibco BRL合成)和M13通用引物及反向引物(Pharmacia)用于單鏈DNA、雙鏈質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)物的測序。
相同的測序策略用于來自腦膜炎奈瑟氏的H44/76和M981菌株lbpB基因的測序。
4BlbpB基因的克隆和測序為了克隆lbpB基因的缺失部分，用DNA探針對BNCV的λgt11基因文庫進(jìn)行了篩選。獲得了兩個不同的克隆。將插入片段亞克隆入pEMBL19，獲得了質(zhì)粒pAM6和pAM13(圖2)，進(jìn)行測序。用這種方法沒有獲得lbpB基因的啟動子和起始序列。另外幾種試圖克隆基因5’端的方法也沒成功，說明其表達(dá)對E.coli有毒性作用。為了獲得其余的序列，制備了用AccI和DraI消化的染色體DNA富集庫。將大小大約為1.5kb的片段連接入pEMBL19，用PCR對連接混合物直接進(jìn)行擴(kuò)增，引物分別是M13和基于lbpB已知序列的引物(LB11，見圖2)。得到的PCR產(chǎn)物(圖2)直接用于測序。該策略避免了克隆基因?qū).coli的可能毒性。
對lbpB的不同片段進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)一2175bp的開放閱讀框架。它編碼一分子量為79.4KDa的蛋白，含725個氨基酸殘基。對N末端序列的分析發(fā)現(xiàn)一被信號肽酶II(yon Heijne，1989)識別的信號序列特征。這類信號序列出現(xiàn)在脂蛋白的前體，成熟蛋白的N末端半胱氨酸殘基被乙酰化。在TbpB蛋白中也發(fā)現(xiàn)了類似的信號序列，該蛋白已被證明是脂修飾的(Anderson et al.，1994)。估算的成熟LbpB蛋白分子量為77.5KDa，明顯低于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)(圖1)所觀察到的表觀分子量95KDa。對Swiss Prot數(shù)據(jù)庫同其它蛋白的相似性搜索發(fā)現(xiàn)同Neisseriae和大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的TbpB蛋白同源。同腦膜炎奈瑟氏球菌的B16B6菌株(Legrain et al.，1993)(圖3)的TbpB具有最高的同源性，為33％(使用PALIGN程序)。在TbpB蛋白內(nèi)部發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列，因此提出該分子有一雙葉(bi-lobed)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是由內(nèi)部復(fù)制進(jìn)化而來(Fuller et al.，1996，Renauld-Mongenie et al.，1996)。當(dāng)將成熟LbpB蛋白的氨基端的354個氨基酸同C端的353個氨基酸相比較時，發(fā)現(xiàn)30％的一致性和10％的相似性(結(jié)果未顯示)。該結(jié)果表明LbpB也存在一bi-lobed結(jié)構(gòu)。蛋白等電點(diǎn)為4.5。在序列中還可發(fā)現(xiàn)兩個富含酸性殘基的節(jié)段(圖3)。因為TbpB缺乏這些節(jié)段，它們可能在結(jié)合乳鐵蛋白方面很重要，乳鐵蛋白同轉(zhuǎn)鐵蛋白相反，帶有正電荷。
在啟動子區(qū)域，有一典型的Shine-Dalgarno序列。此外，也發(fā)現(xiàn)了可能的-10和-35框(圖4)。一可能的Fur結(jié)合位點(diǎn)序列同-10框重疊。Fur連同F(xiàn)e2+通過和啟動子區(qū)域(Bagg and Neilands，1987)的19bp序列結(jié)合，來作為鐵調(diào)控基因的阻遏子。Fur框的一致序列為GATAATGATAATCATTATC，在lbpB啟動子中，這19bp序列中的16bp是保守的。在啟動子的更上游序列中發(fā)現(xiàn)一131bp的直接重復(fù)(結(jié)果未顯示)。該序列在此位置至少出現(xiàn)兩次。相同的直接重復(fù)序列在lbpA基因的下游也有發(fā)現(xiàn)(Prinz et al.，未發(fā)表)。FASTA同源性檢索顯示該重復(fù)序列同很多奈瑟氏菌屬序列同源，大部分在開放閱讀框架的側(cè)翼(結(jié)果未顯示)。
腦膜炎奈瑟氏球菌的BNCV菌株和M981菌株LbpB蛋白的同源性為72.7％，而BNCV和H44/7的同源性僅為78.5％。
實施例55A同基因突變體的構(gòu)建質(zhì)粒pAM23和pAM6分別用于lbpA和lbpB的插入失活。用ClaI和HindIII從pER2(Jennings et al.，1993)上切下紅霉素抗性(Ermr)匣子。用T4 DNA聚合酶處理，連接到EcoRV消化的pAM23，得到質(zhì)粒pAM23E。用HincII從pUC4K(Pharmacia)上切下卡那霉素抗性(Kmr)匣子。質(zhì)粒pAM6用BglII線性化，用T4 DNA聚合酶處理。將卡那霉素抗性(Kmr)匣子連接到該位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pAM6K。由寡核苷酸nus1和nus2組成的接頭克隆入pAM6K的KpnI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pAM6K-nus，其中nus1和nus2含奈瑟氏菌屬攝入序列(GCCGTCTGAA)和同KpnI匹配的單鏈末端?？股乜剐曰虻牟迦敕较蛲寺bpA和lbpB基因的質(zhì)粒pAM23E和pAM6K(-nus)中的方向一致。質(zhì)粒pAM23E用KpnI線性化后，轉(zhuǎn)化H44/76菌株，方法同以前所描述(Vander Ley and Poolman，1992)。在含5μg/ml紅霉素的GC平板上篩選轉(zhuǎn)化子，其中一個轉(zhuǎn)化子CE1449中正確的基因置換被PCR和Southern雜交所證實，PCR所用引物為FW5和DVAS2(表2)，Southern雜交探針為AP23(圖2，pAM23中SspI和HindIII的184bp酶解片段)。對于Southern雜交，染色體DNA用ClaI和SalI消化。BCNV的同基因突變體用電穿孔(Genco et al.，1991)方法制備，因為該菌株似乎不可轉(zhuǎn)化。lbpA突變菌株CE1449的染色體DNA用于制備lbpA突變體，轉(zhuǎn)化子在含紅霉素GC平板上的篩選和鑒定如上所述。質(zhì)粒pAM6K-nus用于制備lbpB突變體。轉(zhuǎn)化子篩選在含100μg/ml卡那霉素的GC平板上進(jìn)行。正確的置換用PCR和Southern方法來證實，PCR引物為SDA1和PR1(表2)，Southern雜交的探針為AP23。
5B同基因突變體的構(gòu)建為了證實94KDa蛋白及單個乳鐵蛋白結(jié)合蛋白在乳鐵蛋白結(jié)合和利用中的功能，構(gòu)建了一系列缺乏lbpA或lbpB的BNCV的同基因衍生物突變，按實施例5A所述方法進(jìn)行構(gòu)建。正確的基因置換用PCR和Southern雜交來證實。lbpA和lbpB在突變體CE1452不表達(dá)LbpA(圖5A，泳道4)，而lbpB突變體CE1454不表達(dá)94KDa(圖5B，泳道6)。該結(jié)果證實了lbpB基因在野生型菌株中表達(dá)，編碼一分子量為94000的蛋白，顯著高于估算的分子量77.5KDa。此外，圖4的結(jié)果表明lbpB基因的失活對lbpA基因的表達(dá)沒有極性影響。因為插入到lbpB基因中的卡那霉素抗性匣子不含轉(zhuǎn)錄終止子，所以該結(jié)果是可以預(yù)期的。以前描述的lbpA自發(fā)突變體CE1452(Pettersson et al.，1994b)似乎也不表達(dá)LbpB(圖5B，泳道8)。既然這兩個突變體和BNCV為菌株M986的衍生物，它們的遺傳背景應(yīng)該同其它突變體一致。LbpA和LbpB的表達(dá)似乎是鐵調(diào)控的(圖5)。即使細(xì)胞生長在無鐵螯合劑存在的條件下，菌株CE1454中也有很弱的LbpA表達(dá)(圖5A，泳道5)。該表達(dá)可能是從lbpB中卡那霉素抗性基因的啟動子開始轉(zhuǎn)錄。但是，在同樣條件之下，當(dāng)有鐵螯合劑存在情況下，LbpA的表達(dá)可增高幾倍(圖5A，泳道6)。
實施例66A乳鐵蛋白結(jié)合實驗乳鐵蛋白同全細(xì)胞的結(jié)合用ELISA方法來評估。來自泡盛曲霉的重組人乳鐵蛋白由得克薩斯休斯頓的Agennix公司惠贈。乳鐵蛋白按照文獻(xiàn)方法(Van Berkel et al.，1995)用鐵飽和，做以下改動。用FeCl3代替Fe(NO3)3，用5mM pH7.7的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液透析4小時。將平板中菌落懸浮于pH7.5的Tris緩沖鹽溶液(TBS)中，56℃熱滅活30分鐘。將620nm處OD值為0.05的樣品100μl加入微量滴定板孔中，37℃干燥過夜。實驗在37℃進(jìn)行。用100μl封閉液封閉1小時防止非特異結(jié)合，該封閉液為含0.5％Protifa(Nutricia)和0.1％土溫20的TBS溶液。封閉后，每孔封閉液中加不同濃度的乳鐵蛋白，其濃度變化范圍為3.125-20ng/ml。孵育1小時后，用自來水洗3次，加入偶連有過氧化物酶的抗人乳鐵蛋白的兔多克隆血清(ICN，Biomedicals)?？贵w在封閉液中稀釋5000倍使用。孵育1小時后，用自來水洗3次。檢測過氧化物酶量(Abdillahiand Poolman，1987).
乳鐵蛋白的點(diǎn)結(jié)合實驗按如下方法進(jìn)行。將膜在含0.5％Protifa(Nutricia)和0.1％土溫20的pH5.7的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液中封閉非特異結(jié)合，孵育2小時。然后同含1.2μg/ml過氧化物酶偶連的人乳鐵蛋白(Pettersson et al.，1993)的封閉液孵育1小時，用封閉液洗3次。過氧化物酶活性檢測用ECL系統(tǒng)按照使用說明進(jìn)行(Amersham)。
6B平板飼喂(plate feeding)分析腦膜炎球菌在含Vitox的TSB中培養(yǎng)過夜，如實施例1所述。將300μl過夜培養(yǎng)物加入3ml頂層瓊脂(1％GC瓊脂和20μg/ml EDDA，冷至42℃)立即在含Vitox和20μg/ml EDDA的GC瓊脂平板上鋪板。將人重組乳鐵蛋白(用11％鐵飽和，或按上述方法飽和)滴在平板上。乳鐵蛋白的濃度分別為10和20μg/ml，平板培養(yǎng)過夜。
6C乳鐵蛋白同折疊LbpB的結(jié)合斑點(diǎn)分析為了檢測乳鐵蛋白能否同LbpB斑點(diǎn)結(jié)合，對LbpB在非變性條件下進(jìn)行SDS-PAGE(參見實施例6A)。當(dāng)電泳前樣品在樣品緩沖液中不加熱時，可以檢測到LbpB的快速遷移形式，該形式可能是天然折疊形式的蛋白(圖6A)。該形式的分子量大約為80KDa。在加熱10分鐘后，LbpB完全變性，遷移在94KDa位置(圖6A，泳道2)。令人感興趣的是，僅有抗肽A1(圖2)的血清與蛋白遷移形式有反應(yīng)。該肽含有兩段富含陰性電荷氨基酸的區(qū)域，可能參與乳鐵蛋白的結(jié)合?？贵w同折疊蛋白的結(jié)合說明該部分是暴露的，而其余肽則掩蓋在折疊結(jié)構(gòu)LbpB的內(nèi)部。
隨后對乳鐵蛋白同折疊LbpB蛋白的結(jié)合進(jìn)行了評估。將BNCV菌株的外膜蛋白點(diǎn)在硝酸纖維素膜，同過氧化物酶偶連的人乳鐵蛋白孵育。乳鐵蛋白結(jié)合的特異性似乎對孵育條件非常敏感，最重要的是pH。在優(yōu)化條件下，乳鐵蛋白特異地同分子量80KDa(圖6B，泳道1和2)的蛋白結(jié)合。而在SDS-PAGE電泳前樣品經(jīng)95℃處理10分鐘的樣品則觀察不到結(jié)合(圖6B，泳道3)。在LbpB突變體CE1454樣品中沒檢測到。因此可以斷定LbpB的快速遷移形式是蛋白得折疊形式，可以結(jié)合乳鐵蛋白。
6D乳鐵蛋白對全細(xì)胞的結(jié)合和利用乳鐵蛋白同全細(xì)胞的結(jié)合用ELISA方法進(jìn)行。ELISA板用BNCV的同基因突變體菌株全細(xì)胞包被，將不同濃度的乳鐵蛋白加入孔中。乳鐵蛋白同細(xì)胞的結(jié)合用偶連過氧化物酶的抗人乳鐵蛋白的抗體來檢測(圖7)。LbpB突變體對乳鐵蛋白的結(jié)合力有輕微的減弱，LbpA突變體結(jié)合的有效性要低于LbpB突變體，而雙突變體則無任何結(jié)合活性。
用乳鐵蛋白作為唯一鐵源的能力用平板飼喂實驗進(jìn)行。腦膜炎球菌在鐵限制條件下培養(yǎng)，將人重組乳鐵蛋白滴在平板上，監(jiān)測生長刺激作用。LbpB突變體可在乳鐵蛋白上生長，而LbpA突變體則不能(圖8)。乳鐵蛋白用11％鐵飽和，相同實驗在有鐵乳鐵蛋白上進(jìn)行，結(jié)果基本一致(結(jié)果未顯示)。這些結(jié)果表明，LbpA蛋白對經(jīng)乳鐵蛋白的鐵吸收是必需的，而LbpB則不是必需的。
實施例7為了檢測腦膜炎球菌LbpB蛋白的變異性，對來自4個另外的lbpB基因進(jìn)行了測序。這4個菌株分別為H44/76、M990、M981和881607(見表1)。
7A另4個腦膜炎球菌菌株lbpB的測序-方法細(xì)菌培養(yǎng)同實施例1。染色體DNA從培養(yǎng)在平板上的細(xì)菌抽提。在過夜培養(yǎng)后，從板上刮下細(xì)菌，懸浮在1.5ml 10mM Tris-HCl，10mMEDTA，pH8.0的溶液中，加入10μl溶菌酶(10mg/ml)。懸浮物在室溫孵育15分鐘，然后加入1.5ml 2％Triton X-100，150mMTris-HCl，100mM EDTA，pH8.0。孵育15分鐘后，加入10μl蛋白酶K(10mg/ml)。室溫孵育30分鐘?；旌衔镉梅?、氯仿和異戊醇(混合比例24∶24∶1)抽提一次，然后用水飽和氯仿再抽一次。染色體DNA用乙醇沉淀。
染色體DNA用于PCR擴(kuò)增lbpB基因。引物L(fēng)B20和REV2(表3)用于H44/76、M990和881607菌株的擴(kuò)增。引物L(fēng)B20和LB23用于M981菌株的擴(kuò)增。引物的序列基于BNCV中l(wèi)bpB的序列。LB20結(jié)合在lbpB基因的上游，LB23和REV2在lbpA的基因開始。LB23在5’端有一額外的BamHI位點(diǎn)。Taq聚合酶的一種衍生物Goldstar聚合酶(Eurogentec)用于PCR擴(kuò)增，按照使用說明進(jìn)行。退火溫度均為50℃，共30個循環(huán)。用β-agarase(New England Biolabs)從瓊脂糖凝膠上純化PCR產(chǎn)物。
DNA序列測定根據(jù)lbpB基因設(shè)計引物進(jìn)行基因步進(jìn)測序，引物由Gibco BRL合成，測序用ABI Prism 310 Genetic Analyzer(PerkinElmer)自動測序。標(biāo)記用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin Elmer)。
軟件包PC Gene 6.70(IntelliGenetic)中的TRANSL，PALIGN和CLUSTAL程序分別用于將核苷酸序列翻譯成蛋白序列、成對和多對序列對比。
7B另4個腦膜炎球菌菌株lbpB的測序-結(jié)果4個菌株lbpB基因的核苷酸序列見SEQ ID NO3、5、7和9。核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)序列以及5個已知LbpB蛋白的序列對比見表9。在氨基酸水平，LbpB蛋白在不同菌株的一致性為70-80％，一致性對比總結(jié)于表4。
實施例8LbpB在腦膜炎奈瑟氏球菌中表達(dá)水平非常低，當(dāng)用外膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE時檢測不到蛋白。為了對LbpB蛋白進(jìn)行免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)/功能進(jìn)行研究，構(gòu)建了在E.coli中表達(dá)的構(gòu)建體。為了有利于重組蛋白的純化，構(gòu)建體編碼的蛋白含有一His標(biāo)簽，通過替換原始信號和成熟蛋白的頭兩個氨基酸來防止N末端的脂修飾。
8A重組LbpB的表達(dá)-菌株和培養(yǎng)條件腦膜炎球菌菌株BNCV(-2ap1.2)在含Vitox(Oxoid)的GC瓊脂板(Difco)上培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)條件為含5％ CO2的37℃潮濕環(huán)境。編碼重組蛋白的構(gòu)建體在E.coli菌株CE1448(C.Jansen惠贈)中表達(dá)，該菌株為CE1224(Tommassen et al.，1983)的htrA ompT衍生菌株。菌株于37℃在Hepes緩沖合成培養(yǎng)基(Tommassen andLugtenberg.，1980)上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)加有因營養(yǎng)缺陷突變所需的營養(yǎng)和1.32mM KH2PO4(磷酸鹽充足環(huán)境)。過夜培養(yǎng)后，培養(yǎng)物用相同的無KH2PO4(磷酸鹽缺乏環(huán)境)培養(yǎng)基稀釋13.5倍，37℃培養(yǎng)6小時。
8B重組LbpB的表達(dá)-在E.coli中的克隆染色體DNA從培養(yǎng)在平板上的腦膜炎細(xì)菌抽提。在過夜培養(yǎng)后，從板上刮下細(xì)菌，懸浮在1.5ml 10mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0溶液中，加入10μl溶菌酶(10mg/ml)。懸浮物在室溫孵育15分鐘，然后加入1.5ml 2％Triton X-100，150mMTris-HCl，100mM EDTA，pH8.0。孵育15分鐘后，加入10μl蛋白酶K(10mg/ml)。室溫孵育30分鐘。混合物用酚、氯仿和異戊醇(混合比例24∶24∶1)抽提一次，然后用水飽和氯仿再抽一次。染色體DNA用乙醇沉淀。
染色體DNA用作模板擴(kuò)增相當(dāng)于成熟LbpB的部分lbpB基因，PCR引物為LB22和LB23(表5)。LB22引物位點(diǎn)相當(dāng)于LbpB氨基端部分，引物末端加一PstI位點(diǎn)。LB23引物在lbpB的下游，在lbpA的起始，并引入一BamHI位點(diǎn)。有校正功能的聚合酶Pwo(BoehringerMannheim)用于擴(kuò)增，按照使用說明進(jìn)行。退火溫度60℃，共30個循環(huán)。用β-agarase(New England Biolabs)根據(jù)使用說明從膠上分離PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用PstI和BamHI消化后連入經(jīng)同樣酶消化的pJP29(圖10A)。得到的pAM31丟失了BamHI和BglII位點(diǎn)。構(gòu)建體中LbpB蛋白從phoE啟動子表達(dá)，并用PhoE信號序列取代了原來的信號序列。此外，N端的起始兩個氨基酸分別由Cys和Ile換成了Ala和Val。為了有利純化，在信號序列和成熟蛋白之間插入了一His標(biāo)簽。pAM31用PstI消化后，同一由寡聚核苷酸VGO12a和VGO13a(表5)組成的接頭連接，得到質(zhì)粒pAM32(圖10A)。PstI位點(diǎn)在連接后丟失。接頭編碼6個His殘疾和因子Xa的切割位點(diǎn)。
8C重組LbpB蛋白的純化重組LbpB在含pAM32的CE1448菌株中生產(chǎn)。在磷酸鹽限制的條件下，在5升經(jīng)6小時培養(yǎng)物中收集細(xì)菌。用500ml生理鹽水洗滌細(xì)胞兩次，懸浮在150ml 10mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH8.0，溶液中，懸浮物在-20℃冷凍過夜，融解細(xì)胞并加入三種蛋白酶抑制劑的混合物(CompleteTM，Boehringer Mannheim)。用一French press以8000psi的壓力擠壓細(xì)胞兩次。未破裂的細(xì)胞在Sorvall GSA轉(zhuǎn)子中5000rpm離心20分鐘去處。上清在Beckman Ti60轉(zhuǎn)子40000rpm離心90分鐘，細(xì)胞膜溶解在5mM pH7.6的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液中。
細(xì)胞層用2％正辛基-寡-氧乙烯(Octyl-POE)在37℃抽提兩次。第一次1小時，第二次3小時。在抽提中及抽提后，不溶性蛋白通過在Beckman TLA 100.2轉(zhuǎn)子在100000rpm離心1小時來沉淀。含有LbpB蛋白的上清混合加入Ni-NTA瓊脂糖。蛋白的純化在天然條件下成批處理，按生產(chǎn)使用說明進(jìn)行(Qiagen)。在結(jié)合和洗滌中，咪唑和NaCL的濃度分別為200和300mM?？偣?ml的Ni-NTA瓊脂糖被使用，共分成10管。洗脫分別用100、200和250mM咪唑。洗脫后，蛋白用Spectra/Por2透析袋(Spectrum)對2.5l磷酸鹽緩沖液透析。用Fugisept Maxi Centrifugal Concentrator(Intersept)富集大于10KDa的蛋白。在Sorvall GSA轉(zhuǎn)子5000rpm離心，至總體積為1-1.5ml。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)按Lugtenberg等(1975)所述方法進(jìn)行，略作改動。聚丙烯酰胺膠是由5％(w/v)濃縮膠和8％(w/v)分離膠組成，無SDS。為了防止LbpB變性，樣品緩沖液(Lugtenberg等，1975)不能包含β-巰基乙醇，且電泳前樣品一直保存在0℃。為了變性LbpB，樣品緩沖液中加β-巰基乙醇。樣品煮沸5分鐘。在20mA恒流及4℃條件下電泳。用考馬斯亮蘭染色。
8D重組LbpB的表達(dá)和純化-結(jié)果腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV菌株的重組LbpB表達(dá)在E.coli菌株CE1448。構(gòu)建體pAM32編碼-重組蛋白，該蛋白由PhoE信號序列、His標(biāo)簽和成熟的LbpB蛋白組成(圖10A)。蛋白表達(dá)由phoE啟動子在磷酸鹽限制條件下啟動。LbpB的II型信號序列由I型信號序列代替，帶有因子Xa切割位點(diǎn)的His標(biāo)簽位于信號序列和成熟LbpB蛋白之間。此外，成熟LbpB的頭兩個氨基酸Cys和Ile改變成Ala和Vla(圖10B)。因此，重組蛋白的N端Cys不能被脂化。重組蛋白與脂膜形成一體，無可溶性蛋白部分(結(jié)果未顯示)。因此，必需用去污劑從膜上抽提蛋白。用Octyl-POE可以從膜上溶解50％的總量重組蛋白。此外，當(dāng)抽提蛋白沒經(jīng)在樣品緩沖液中煮沸變性時，它在PAGE中的遷移比變性蛋白快(結(jié)果未顯示)。說明蛋白是正確折疊的。抽提后，具有His標(biāo)簽的蛋白用Ni層析柱純化。大部分的蛋白可在100和200mM的咪唑洗脫。無論如何，在透析前要合并所有含重組蛋白的部分。蛋白的純度用考馬斯亮蘭染膠(圖11)，大部分以折疊形式出現(xiàn)，其在PAGE中遷移比在變性膠中快。折疊形式的LbpB，而不是變性形式，在圖6顯示同乳鐵蛋白有結(jié)合斑點(diǎn)。
實施例9為了研究LbpB蛋白對人的免疫原性，用免疫印跡檢測了識別康復(fù)病人血清中BNCV株LbpB蛋白的抗體。
9ALbpB對人的免疫原性-方法10個病人的康復(fù)血清來自SmithKline Beecham，BiologicalsSA，Belgium，7個從荷蘭國立衛(wèi)生和環(huán)境研究所獲得(表6)。每個血清均被不同血清型和亞型的菌株感染過。
重組LbpB的分離按照實施例8所述程序進(jìn)行。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)按Lugtenberg等(1975)所述方法進(jìn)行，略作改動。聚丙烯酰胺膠是由5％(w/v)濃縮膠和8％(w/v)分離膠組成，無SDS。為了防止LbpB變性，樣品緩沖液(Lugtenberg等，1975)不能包含β-巰基乙醇，且電泳前樣品一直保存在0℃。為了變性LbpB，樣品緩沖液中加β-巰基乙醇。樣品煮沸5分鐘。在20mA恒流及4℃條件下電泳。
免疫印跡參照Pettersson等(1993)的方法進(jìn)行。人血清以1∶500稀釋。過氧化物酶偶連的兔抗人IgG(Dako A/S)用作二抗，其工作濃度為1∶5000。過氧化物酶活性檢測用ECL系統(tǒng)，按照使用說明來進(jìn)行(Amersham)。
9BLbpB對人的免疫原性-結(jié)果人血清中LbpB特異抗體的出現(xiàn)用純化的BNCV(-2ap1.2)株Lb
pB蛋白來進(jìn)行免疫印跡檢測。同時對折疊和變性形式的反應(yīng)性進(jìn)行檢測(見圖2例)。結(jié)果總結(jié)于表6。有4種血清對變性和折疊形式的LbpB均反應(yīng)強(qiáng)烈，5種血清與二者反應(yīng)微弱，2種僅與折疊形式反應(yīng)，2種與變性形式有微弱反應(yīng)，4種血清根本不與任何菌株的LbpB反應(yīng)。這些結(jié)果表明腦膜炎球菌的LbpB對人有免疫原性，說明不同株LbpB之間存在很大程度的交叉免疫原性。
實施例10ELISA及用腦膜炎球菌細(xì)胞或LbpB免疫小鼠的血清殺菌實驗10A免疫程序用腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株免疫以10只小鼠為一組(6周齡Balb/c)，用在SBAS2佐劑中含5×108菌落形成單位熱滅活的BNCV全細(xì)胞免疫3次(100μl皮內(nèi)或皮下)。三次免疫之間間隔21天。在第56天心臟穿刺采血。按組分離血清。
用腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV的LbpB免疫該免疫程序同上，不同的是前兩次用10μg粗LbpB免疫(含重組LbpB的E.coli細(xì)菌外膜)，第3次用2.5μg的純LbpB免疫(用實施例8所述方法制備)。
10B全細(xì)胞ELISA(WCE)和純化LbpB ELISA測定免疫應(yīng)答使用平底96孔板。100μl熱滅活的腦膜炎奈瑟氏B菌株[在缺鐵狀態(tài)(Fe-)下培養(yǎng)，用實施例1中的EDDA法](20μg/ml總蛋白)在PBS中的懸浮液分別加入每孔中，在37℃揮發(fā)過夜。包被板用0.9％NaCl，0.05％土溫20洗滌4次，用含0.3％Casein(Merch)的PBS在室溫?fù)u動飽和30分鐘，洗滌同上。100μl血清用含0.05％土溫20，Casein 0.1％的PBS稀釋100倍，加入第一孔，然后依次倍比稀釋至12孔，37℃搖動孵育30分鐘。洗滌后，加入100μl含0.05％土溫20，0.3％ Casein的PBS的兔抗鼠免疫球蛋白生物素，按照上述方法孵育。洗滌后加100μl用含0.05％土溫20的PBS稀釋4000倍的鏈霉親和素-生物素化辣根過氧化物酶，孵育同上。洗滌后，加100μl新鮮配制的4mg鄰苯二胺(OPDA)染料(Sigma P8787)，該染料溶在pH4.5的0.1M檸檬酸緩沖液。在黑暗的室溫條件下孵育15分鐘。用50μl 1N HCl終止反應(yīng)。測定在490nm處的吸光度。
抗LbpB的ELISA操作方法基本同WCE，不同之處在于包被。每孔用100μl含0.5μg/ml純LbpB的0.05M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)包被，37℃孵育過夜(防止蒸發(fā))。
10C殺菌實驗乙型腦膜炎球菌(H44/76株)培養(yǎng)(在缺鐵狀態(tài)(Fe-)如實施例1或在去處EDDA的有鐵狀態(tài))至對數(shù)生長期(OD～0.3)，用含0.3％BSA的無菌Hanks培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至200000CFU/ml。
制備基礎(chǔ)反應(yīng)混合物(75μl)，其中每孔含50μl 2倍稀釋的測試血清(實施例10A)樣品(已在56℃熱滅活30分鐘)和25μl20000CFU/ml對數(shù)生長期的乙型腦膜炎球菌。反應(yīng)管在37℃孵育15分鐘，并用210rpm搖蕩。最終反應(yīng)混合物(100μl)還需加入25％預(yù)試的小兔血清作為補(bǔ)體來源，在同樣條件下孵育60分鐘。滅菌的聚苯乙烯U形96孔板用于此分析。
用多道移液器從每孔取10μl混合物，滴在含1％Isovitalex和1％熱滅活馬血清的Mueller-Hinton平板；在含5％ CO2的37℃條件下孵育18小時。每份可計數(shù)至80CFU。
以下面3個檢測樣作為對照緩沖液+細(xì)菌+補(bǔ)體；緩沖液+細(xì)菌+滅活補(bǔ)體；血清+細(xì)菌+滅活補(bǔ)體。
按照程序用Excel軟件(Microsoft)計算滴度，該程序用回歸算法可精確測出50％細(xì)胞被殺死的稀釋度。
實施例10D結(jié)果表7和圖13表明用LbpB免疫可誘發(fā)對LbpB(圖13A)良好的免疫應(yīng)答，對來自BNCV(重組LbpB來源)和H44/76(其LbpB同BNCV僅有78.5％的一致性)的全細(xì)胞同樣有良好反應(yīng)(圖13B和C)。用適用于重組LbpB免疫程序獲得的血清也有同樣的結(jié)果(結(jié)果未顯示)。很明顯，同用BNCV和H44/76全細(xì)胞ELISA檢測相比(圖13B和C)，對BNCV的全細(xì)胞免疫可導(dǎo)致更高的應(yīng)答。
此外，用腦膜炎奈瑟氏菌株BNCV的重組LbpB免疫誘發(fā)產(chǎn)生的抗體可以同粘膜炎莫拉氏菌全細(xì)胞樣品中相似分子量的蛋白結(jié)合，免疫印跡按照實施例9中所述方法進(jìn)行(結(jié)果未顯示)。
表8和圖14表明在重組LbpB(來自BNCV)免疫產(chǎn)生血清中的抗體對異源菌株(H44/76)有殺菌作用，該菌株中LbpB同BNCV的LbpB僅有78.5％的序列一致性。對僅用重組LbpB免疫程序獲得的血清也有同樣的結(jié)果(結(jié)果未顯示)。在H44/76生長在含鐵(圖14A)和缺鐵狀態(tài)下(圖14B)結(jié)果均如此。
正如預(yù)期，鐵缺乏環(huán)境，如果細(xì)菌在缺鐵狀態(tài)下有更高量的表達(dá)，則缺鐵似乎可能正如所預(yù)期的那樣有重要作用。
因此，LbpB為一免疫保護(hù)抗原，此外，證據(jù)表明它對異源腦膜炎奈瑟氏菌株有交叉保護(hù)作用。表1.所用的菌株和質(zhì)粒。菌株 描述a參考文獻(xiàn)/來源腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76B15P1.7，16 E.HoltenCE1449H44/76 lbpA∷Ermr本申請BNCV M986的-2aP1.2的 E.C.Gotschlich未包囊衍生物CE1452BNCV lbpA∷Ermr本申請CE1452BNCV lbpB∷Kmr本申請CE1402M986 lbpA，lbpB Pettersson et al.1994aM990 B6P1.6881607BntP1.12B16B6 B2aP1.2 A.SchryversN91 B16B6 tbpB A.SchryversM981 B4nt大腸桿菌DH5α Laboratory stockY1090 AmprYoung and Davis，1983PC2494JM101的hsdR衍生物Phabagen Collection質(zhì)粒pEMBL19 AmprLaboratory stockpUC4K Kmr-box，AmprPharmacia BiotechpER2 pBluescript的Ermr盒子，AmprJennings et al.，1993pAM6 攜帶部分lbpA和lbpB 本申請的pEMBL19pAM6K 帶有插入到lbpB的BglII位點(diǎn)的 本申請來自pUC4K的Kmr盒子的pAM6pAM6K-nus 帶有插入在載體的多克隆位點(diǎn) 本申請的KpnI位點(diǎn)的奈瑟氏球菌吸收序列的pAM6KpAM13 攜帶部分lbpA和lbpB 本申請的pEMBL19pAM1 攜帶部分lbpA和lbpB的pUC19Pettersson et al.1993pAM23 攜帶lbpA和部分lbpB的pUC19Pettersson et al.1994bpAM23E帶有插入到lbpA的EcoRV位點(diǎn)本申請的Ermr盒子a血清組、血清型及亞型被標(biāo)明。nt無法分型。
表2.用于PCR或接頭克隆的引物名稱 序列 注釋DVAS2 AGACCGACCCTTCGACGACTTCGGFW5GAAGAAGAAGCGATGGTGCGGSDA1 CCTCTTTAGTATCTTTCTTCGCACLB11 CTTAATTTCATCTTTTCCCPR1GAGCGAGTCCGCGTTAGTGCT結(jié)合到Kmr匣子中nus1 TTCAGACGGCTGTAC 奈瑟氏菌攝入互補(bǔ)于nus1nus2 AGCCGTCTGAAGTAC表3.用于PCR擴(kuò)增另外4個lbpB基因的引物名稱 序列LB20GGAGGAAAAGTAGGGATGLB23CGGGATCCAGCCAAGGCAGTCAGGGTAAGCREV2GCACGGACGGTAACCTCTTTCAGG表4.LbpB序列的配對同一性，以％計H44/76 M990 M981 881607BNCV 78.5 73.8 72.7 71.4H44/76 72.5 74.1 78.5M990 70.5 71.3M981 80.6
表5.用于表達(dá)重組LbpB的引物名稱 序列LB22 AACTGCAGTCGGCGGCAATTTCGGCGTGCALB23 CGGGATCCAGCCAAGGCAGTCAGGGTAAGCVGO12aCACCACCACCACCACCACGTGATCGAGGGGCGTGCAVGO13aCGCCCCTCGATCACGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCA表6.抗純化LbpB人血清的免疫印跡實驗結(jié)果。血清 特征a天然b變性b來源c262439BNTP1.4 + +SKB262532B15P1.7，16 + +SKB262658BNTP1.15 - -SKB262716B15P1.7，16 - +SKB262892B2bP1.10 ++ ++ SKB262917B4NT ++ ++ SKB262941B1P1.15 + +SKB262987B2aP1.15 + +SKB263017B4NT - -SKB263021B4P1.4 - -SKB69B15P1.16 + -RIVM322 B15P1.5 + -RIVM329 B1P1.4 - -RIVM330 B1P1.4 ++ ++ RIVM187 -- +RIVM195 -++ ++ RIVM118 -+ +RIVMa當(dāng)已知時，標(biāo)明的是患者所感染菌株的血清型及亞型。NT無法分型。
b與所述蛋白的天然或變性形式之間的反應(yīng)程度，++代表強(qiáng)反應(yīng)，+代表弱反應(yīng)以及-代表無反應(yīng)。
CSKBSmithKline Beecham Biologicals，RIVMNationalInstitute of Public Health and the Environment。
表7.按照實施例10描述進(jìn)行的抗全細(xì)胞和抗-LbpB ELISA的實驗結(jié)果
a血清稀釋度。b490nm處的光密度。
表8.按照實施例10中描述進(jìn)行的抗全細(xì)胞和抗-LbpB血清的殺菌活性的結(jié)果
a血清稀釋度本發(fā)明中列出的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請在此引入作為參考，就如同所有單個的出版物都被特別并單個地指出在此引入作為參考。
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序列表(1)一般資料(i)申請人University of Utrecht，Technology Foundation(ii)發(fā)明題目疫苗(iii)序列數(shù)10(iv)通信地址(A)收信人Smithkline Beecham，Corporate IPDepartment(B)街道Two，New Horizons Court，(C)城市Brentford(D)州 Middlesex(E)國家英國(F)郵政編碼TW8 9EP(V)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM Compatible(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)目前的申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名DALTON，Marcus Jonathan William(B)注冊號XXXXXX(C)資料/文檔號5106(ix)通訊信息(A)電話(0181)975 6348(B)傳真(908)975 6177(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度2277個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(B)菌株腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置100...2274(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO1TCCTGATTTT TGTTAATTCA CTATAAAAAC GGGTTGATAT TATCTGTACA TATTAATATA 60ATGATAATTA TTATTAATCA AATAGGAGGA AAAGTAGGG ATG TGT AAA CCG AAT 114Met Cys Lys Pro Asn1 5TAT GGC GGC ATT GTC TTG TTG CCC TTA CTT TTG GCA TCT TGT ATC GGC 162Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ser Cys Ile Gly10 15 20GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA ACG CCG ACC GCG TAC 210Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser Thr Pro Thr Ala Tyr25 30 35CCC GTC ACT TTC AAG TCT AAG GAC GTT CCC ACT CCG CCC CCT GCC AAA 258Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr Pro Pro Pro Ala Lys40 45 50CCT TCT ATA GAA ATC ACG CCG GTC AAC CGG CCC GCC GTC GGT GCG GCA 306Pro Ser Ile Glu Ile Thr Pro Val Asn Arg Pro Ala Val Gly Ala Ala55 60 65ATG CGG CTG CCA AGG CGG AAT ACT GCT TTT CAT CGT GAA GAT GGC ACG 354Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn Thr Ala Phe His Arg Glu Asp Gly Thr70 75 80 85GAA ATT CCA AAT AGC AAA CAA GCA GAA GAA AAG CTG TCG TTT CAA GAA 402Glu Ile Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Ser Phe Gln Glu90 95 100GGT GAT GTT CTG TTT TTA TAC GGT TCA AAA GGA AAT AAA CTT CAA CAA 450Gly Asp Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Gly Asn Lys Leu Gln Gln105 110 115CTT AAA AGC GAA ATT CAT AAA CGT GAT TCC GAT GTA GAA ATT AGG ACA 498Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asp Ser Asp Val Glu Ile Arg Thr120 125 130TCA GAA AAG GAA AAT AAA AAA TAT GAT TAT AAA TTT GTA GAT GCA GGT 546Ser Glu Lys Glu Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys Phe Val Asp Ala Gly135 140 145TAT GTA TAT GTA AAG GGA AAA GAT GAA ATT AAG TGG ACT TCA GAT TAC 594Tyr Val Tyr Val Lys Gly Lys Asp Glu Ile Lys Trp Thr Ser Asp Tyr150 155 160 165AAG CAG TTT TCC AAC CGC TTA GGT TAT GAC GGT TTT GTA TAT TAT TCC 642Lys Gln Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser170 175 180GGA GAA CGT CCT TCC CAA TCT TTA CCG AGT GCG GGA ACG GTG GAA TAT 690Gly Glu Arg Pro Ser Gln Ser Leu Pro 5er Ala Gly Thr Val Glu Tyr185 190 195TCT GGT AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC AAA CGT CAT CGA GCA GGT 738Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala Lys Arg His Arg Ala Gly200 205 210AAG GCG GTT GGC ATT GAC AAT TTG GGT TAT TAC ACA TTT TAT GGT AAC 786Lys Ala Val Gly Ile Asp Asn Leu Gly Tyr Tyr Thr Phe Tyr Gly Asn215 220 225GAT GTT GGT GCA ACT TCT TAT GCG GCT AAG GAT GTC GAC GAA AGG GAA 834Asp Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Lys Asp Val Asp Glu Arg Glu230 235 240 245AAA CAT CCT GCT AAA TAT ACG GTA GAT TTC GGT AAC AAA ACC CTG ACG 882Lys His Pro Ala Lys Tyr Thr Val Asp Phe Gly Asn Lys Thr Leu Thr250 255 260GGC GAG CTG ATT AAA AAC CAA TAT GTC AAA CCC AGT GAG AAG CAA AAA 930Gly Glu Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val Lys Pro Ser Glu Lys Gln Lys265 270 275CCG CTG ACC ATT TAC AAC ATC ACT GCC GAT TTA AAC GGC AAC CGC TTT 978Pro Leu Thr Ile Tyr Asn Ile Thr Ala Asp Leu Asn Gly Asn Arg Phe280 285 290ACC GGC AGT GCC AAG GTC AAT CCT GAT TTA GCG AAA AGC CAT GCC AAT 1026Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Ser His Ala Asn295 300 305AAG GAG CAT TTG TTT TTC CAT GCC GAT GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC 1074Lys Glu His Leu Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly310 315 320 325GGT TTT TTC GGC GAT AAG GGG GAA GAG CTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC 1122Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser330 335 340AAC GAC AAC AGC GTA TTC GGT GTA TTC GCA GGC AAA CAA AAT AGC CCC 1170Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe Ala Gly Lys Gln Asn Ser Pro345 350 355GTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTG AAA ATT TCC 1218Val Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys Ile Ser360 365 370GTT GAT GAG GCA AGT GGT GAA AAT CCC CGA CCG TTT GCC ATT TCT CCT 1266Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Ala Ile Ser Pro375 380 385ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG CAT GAA 1314Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly His Glu390 395 400 405ATT CCT TTG GTT AGC CAA GAG AAA ACC ATC GAG CTT GCC GAC GGC AGG1362Ile Pro Leu Val Ser Gln Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala Asp Gly Arg410 415 420AAA ATG ACC GTC AGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG ACC TAT GTG AAA CTC1410Lys Met Thr Val Ser Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val Lys Leu425 430 435GGA CGG ATA AAA ACC GAA CGC CCC GCC GCC AAA CCG AAG GCG CAG GAC1458Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Ala Lys Pro Lys Ala Gln Asp440 445 450GAA GAG GAT TCG GAC ATT GAT AAT GGC GAA GAA AGC GAA GAC GAA ATC1506Glu Glu Asp 5er Asp Ile Asp Asn Gly Glu Glu Ser Glu Asp Glu Ile455 460 465GGC GAT GAA GAA GAA GGC ACC GAA GAT GCA GCC GCA GGA GAT GAA GGC1554Gly Asp Glu Glu Glu Gly Thr Glu Asp Ala Ala Ala Gly Asp Glu Gly470 475 480 485AGC GAA GAA GAC GAA GCC ACA GAA AAC GAA GAC GGC GAA GAA GAC GAA1602Ser Glu Glu Asp Glu Ala Thr Glu Asn Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu490 495 500GCT GAA GAA CCT GAA GAA GAA TCG TCG GCA GAA GGC AAC GGC AGT TCA1650Ala Glu Glu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ala Glu Gly Asn Gly Ser Ser505 510 515AAC GCC ATC CTG CCT GTC CCG GAA GCC TCT AAA GGC AGG GAT ATC GAC1698Asn Ala Ile Leu Pro Val Pro Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp520 525 530CTT TTC CTG AAA GGT ATC CGC ACG GCA GAA ACG AAT ATT CCG CAA ACT1746Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr Asn Ile Pro Gln Thr535 540 545GGA GAA GCA CGC TAT ACC GGC ACT TGG GAA GCG CGT ATC GGC AAA CCC1794Gly Glu Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Lys Pro550 555 560 565ATT CAA TGG GAC AAT CAT GCG GAT AAA GAA GCG GCA AAA GCA GTA TTT1842Ile Gln Trp Asp Asn His Ala Asp Lys Glu Ala Ala Lys Ala Val Phe570 575 580ACC GTT GAT TTC GGC AAG AAA TCG ATT TCC GGA ACG CTG ACG GAG AAA1890Thr Val Asp Phe Gly Lys Lys Ser Ile Ser Gly Thr Leu Thr Glu Lys585 590 595AAC GGT GTA GAA CCT GCT TTC CGT ATT GAA AAC GGC GTG ATT GAG GGC1938Asn Gly Val Glu Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asn Gly Val Ile Glu Gly600 605 610AAC GGT TTC CAT GCG ACA GCG CGC ACT CGG GAT GAC GGC ATC GAC CTT1986Asn Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp Asp Gly Ile Asp Leu615 620 625TCC GGG CAG GGT TCG ACC AAA CCG CAG ATC TTC AAA GCT AAT GAT CTT2034Ser Gly Gln Gly Ser Thr Lys Pro Gln Ile Phe Lys Ala Asn Asp Leu630 635 640 645CGT GTA GAA GGA GGA TTT TAC GGC CCG AAG GCG GAG GAA TTG GGC GGT2082Arg Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly650 655 660ATT ATT TTC AAT AAT GAT GGG AAA TCT CTT GGT ATA ACT GAA GGT ACT2130Ile Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr Glu Gly Thr665 670 675GAA AAT AAA GTT GAA GCT GAT GTT GAT GTT GAT GTT GAT GTT GAT GTT2178Glu Asn Lys Val Glu Ala Asp Val Asp Val Asp Val Asp Val Asp Val680 685 690GAT GCT GAT GCT GAT GTT GAA CAG TTA AAA CCT GAA GTT AAA CCC CAA2226Asp Ala Asp Ala Asp Val Glu Gln Leu Lys Pro Glu Val Lys Pro Gln695 700 705TTC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT AAT AAA GAG GTG GAA AAA T 2275Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Ly5 Asp Asn Lys Glu Val Glu Lys710 715 720 725GA 2277(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度725個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型內(nèi)在(vi)來源(B)菌株腦膜炎奈瑟氏球菌BNCV株(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser20 25 30Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr35 40 45Pro Pro Pro Ala Lys Pro Ser Ile Glu Ile Thr Pro Val Asn Arg Pro50 55 60Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn Thr Ala Phe His65 70 75 80Arg Glu Asp Gly Thr Glu Ile Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys85 90 95Leu Ser Phe Gln Glu Gly Asp Val Leu Pne Leu Tyr Gly Ser Lys Gly100 105 110Asn Lys Leu Gln Gln Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asp Ser Asp115 120125Val Glu Ile Arg Thr Ser Glu Lys Glu Asn 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AAA 432Ala Ser Ile Thr Thr Ser Glu Lys Lys Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys130 135 140TTT GTA GAT GCA GGT TAT GTA TAT ACT AAA GAC GGA AAA GAT GAA ATT 480Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Gly Lys Asp Glu Ile145 150 155 160GAG TGG ACT TCA AAT TAC AAG CAG TCT ACC AAC CGG TTT GGT TAT GAC 528Glu Trp Thr Ser Asn Tyr Lys Gln Ser Thr Asn Arg Phe Gly Tyr Asp165 170 175GGT TTT GTA TAT TAT TCC GGA GAA CAT CCT TCG CAA TCT TTA CCG AGC 576Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser180 185 190GCG GGA ACG GTG AAA TAT TCC GGC AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC 624Ala Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala195 200 205ATA CGT CAT CGA ACA GGA AAA GCA GGA GAT CCT AGC GAA GAT TTG GGT 672Ile Arg His Arg Thr Gly Lys Ala Gly Asp Pro Ser Glu Asp Leu Gly210 215 220TAT ATC GTT TAT TAC GGT CAA AAT GTC GGA GCA ACT TCT TAT GCT GCG 720Tyr Ile Val Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala225 230 235 240ACT GCC GAC GAC CGG GAG GGA AAA CAT CCT GCC GAA TAT ACG GTT AAT 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Ala Gly Lys Gln Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn355 360 365CCT GCC CTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTA AAA 1152Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys370 375 380ATT TCC GTT GAC GAG GCA AGT GGT GAA AAT CCC CGA CCG TTT GAG GTT 1200Ile Ser Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Glu Val385 390 395 400TCC ACT ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG 1248Ser Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly405 410 415CGT GAA ATT CCT TTG GTA AAC AAA GAA CAA ACC ATC GAT CTT GCC GAC 1296Arg Glu Ile Pro Leu Val Asn Lys Glu Gln Thr Ile Asp Leu Ala Asp420 425 430GGC AGG AAA ATG ACC GTC CGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG ACC TAT GTG 1344Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val435 440 445AAA CTC GGA CGG ATA AAA ACC GAA CGC CCC GCC GTC CAA CCG AAG GCG 1392Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Val Gln Pro Lys Ala450 455 460CAG GAT GAA GAG GGG GAC GAA GAG GGT GTA GGC GTT GAT AAC GGT AAA 1440Gln Asp Glu Glu Gly Asp Glu Glu Gly Val Gly Val Asp Asn Gly Lys465 470 475 480GAA AGC GAA GAC GAA ATC GGC GAT GAA GAA AGC ACC GGA GAC GAA GTC 1488Glu Ser Glu Asp Glu Ile Gly Asp Glu Glu Ser Thr Gly Asp Glu Val485 490 495GTA GAA GAT GAA GAC GAA GAT GAA GAC GAA GAA GAA ATC GAA GAA GAA 1536Val Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ile Glu Glu Glu500 505 510CCT GAA GAA GAA GCT GAA GAG GAA GAA CCC GAA GAA GAA TTG CCG GCA 1584Pro Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Leu Pro Ala515 520 525GAA GAA GGC AAC GGC GGT TCA GGC AGC ATC CTG CCC ACT CCG GAA GCC1632Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala530 535 540TCT AAA GGC AGG GAC ATC GAC CTT TTC CTG AAA GGT ATC CGC ACG GCG1680Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala545 550 555 560GAA GCC GAC ATT CCA AAA AAC GGA ACG GCG CAT TAT ACC GGC ACT TGG1728Glu Ala Asp Ile Pro Lys Asn Gly Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp565 570 575GAA GCG CGT ATC GGC GTA TCG GAT AGT GGT ACG TCC ATT CAA AAG GAT1776Glu Ala Arg Ile Gly Val Ser Asp Ser Gly Thr Ser Ile Gln Lys Asp580 585 590AGC TAT GCG AAT CAA GGG GCA AAA GCA GAA TTT ACC GTT GAT TTC GAA1824Ser Tyr Ala Asn Gln Gly Ala Lys Ala Glu Phe Thr Val Asp Phe Glu595 600 605GCG AAG ACG GTG TCC GGA ATG CTG ACA GAA AAA AAT GAT ACA ACC CCC1872Ala Lys Thr Val Ser Gly Met Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr Thr Pro610 615 620GCT TTT TAT ATT GAA AAA GGT GTG ATT GAC GGT AAC GGT TTC CAC GCT1920Ala Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala625 630 635 640TTG GCG CAT ACT CGG GAG AAC GGT ATT GAC CTT TCT GGG CAG GGT TCG1968Leu Ala His Thr Arg Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser645 650 655ACT AAC CCG AAG AAC TTC AAA GCC GAC AAT CTT CTT GTA ACA GGC GGC2016Thr Asn Pro Lys Asn Phe Lys Ala Asp Asn Leu Leu Val Thr Gly Gly660 665 670TTT TAT GGC CCG CAG GCG GCA GAA TTG GGC GGT AAT ATT ATC GAC AGC2064Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser675 680 685GAC CGG AAA TTC GGT GCG GTA TTT GGG GCG AAA AAA GAT GAC AAG GAG2112Asp Arg Lys Phe Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asp Lys Glu690 695 700GCA ACA CGA TGA2124Ala Thr Arg705(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度707個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型內(nèi)在(vi)來源(B)菌株腦膜炎奈瑟氏球菌881607株(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser20 25 30Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr35 40 45Ser Pro Pro Ala Gly Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Val Asn Arg Pro50 55 60Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Ile Ala Thr Ser65 70 75 80Asp Lys Asp Gly Asn Asp Phe Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys85 90 95Leu Ser Phe Lys Glu Glu Asp Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Lys100 105 110Asp Gln Arg Gln Gln Leu Lys Asp Lys Ile Arg Gln Pro Asn Pro Thr115 120 125Ala Ser Ile Thr Thr Ser Glu Lys Lys Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys130 135 140Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Gly Lys Asp Glu Ile145 150 155 160Glu Trp Thr Ser Asn Tyr Lys Gln Ser Thr Asn Arg Phe Gly Tyr Asp165 170 175Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser180 185 190Ala Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala195 200 205Ile Arg His Arg Thr Gly Lys Ala Gly Asp Pro Ser Glu Asp Leu Gly210 215 220Tyr Ile Val Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala225 230 235 240Thr Ala Asp Asp Arg Glu Gly Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn245 250 255Phe Asp Gln Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val260 265 270Gln Lys Arg Asp Asp Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asp Ile Thr275 280 285Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Thr290 295 300Glu Val Lys Thr Asn His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr305 310 315 320Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu325 330 335Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val340 345 350Phe Ala Gly Lys Gln Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn355 360 365Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys370 375 380Ile Ser Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Glu Val385 390 395 400Ser Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly405 410 415Arg Glu Ile Pro Leu Val Asn Lys Glu Gln Thr Ile Asp Leu Ala Asp420 425 430Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val435 440 445Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Val Gln Pro Lys Ala450 455 460Gln Asp Glu Glu Gly Asp Glu Glu Gly Val Gly Val Asp Asn Gly Lys465 470 475 480Glu Ser Glu Asp Glu Ile Gly Asp Glu Glu Ser Thr Gly Asp Glu Val485 490 495Val Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ile Glu Glu Glu500 505 510Pro Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Leu Pro Ala515 520 525Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala530 535 540Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala545 550 555 560Glu Ala Asp Ile Pro Lys Asn Gly Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp565 570 575Glu Ala Arg Ile Gly Val Ser Asp Ser Gly Thr Ser Ile Gln Lys Asp580 585 590Ser Tyr Ala Asn Gln Gly Ala Lys Ala Glu Phe Thr Val Asp Phe Glu595 600 605Ala Lys Thr Val Ser Gly Met Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr Thr Pro610 615 620Ala Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala625 630 635 640Leu Ala His Thr Arg Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser645 650 655Thr Asn Pro Lys Asn Phe Lys Ala Asp Asn Leu Leu Val Thr Gly Gly660 665 670Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser675 680 685Asp Arg Lys Phe Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asp Lys Glu690 695 700Ala Thr Arg70權(quán)利要求
1.一種編碼腦膜炎奈瑟氏球菌LbpB的分離多核苷酸。
2.權(quán)利要求1中的多核苷酸，它是SEQ ID NO1(第100～2274位核苷酸)、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7或SEQ IDNO9所示的多核苷酸。
3.一種分離的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列與SEQ ID NO1中第100～2274位核苷酸之間具有至少65％的同一性。
4.一種分離的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列與SEQ ID NO3所示序列之間具有至少65％的同一性。
5.一種分離的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列與SEQ ID NO5所示序列之間具有至少65％的同一性。
6.一種分離的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列與SEQ ID NO7所示序列之間具有至少65％的同一性。
7.一種分離的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列與SEQ ID NO9所示序列之間具有至少65％的同一性。
8.權(quán)利要求3～7中的多核苷酸，其中包含一種重組表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)系統(tǒng)能在相容性宿主細(xì)胞中制備出LbpB多肽。
9.一種含有權(quán)利要求8中的表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。
10.一種用于生產(chǎn)LbpB多肽的方法，其中包括在足以生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9中所述的宿主細(xì)胞以及從培養(yǎng)物中回收宿主細(xì)胞。
11.一種用于制備用來生產(chǎn)LbpB多肽細(xì)胞的方法，其中包括用權(quán)利要求8中的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，從而宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下生產(chǎn)出LbpB多肽。
12.來自腦膜炎奈瑟氏球菌的LbpB多肽。
13.權(quán)利要求12中的多肽，它是SEQ ID NO2、4、6、8或10所示多肽。
14.一種分離的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示序列之間在序列全長上具有至少65％的同一性。
15.一種分離的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列與SEQ ID NO4所示序列之間在序列全長上具有至少65％的同一性。
16.一種分離的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列與SEQ ID NO6所示序列之間在序列全長上具有至少65％的同一性。
17.一種分離的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列與SEQ ID NO8所示序列之間在序列全長上具有至少65％的同一性。
18.一種分離的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列與SEQ ID NO10所示序列之間在序列全長上具有至少65％的同一性。
19.權(quán)利要求14、15、16、17或18中的多肽，其中分別包含SEQID NO2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中19位～C末端的氨基酸。
20.一種針對權(quán)利要求14-19中的LbpB多肽具有免疫特異性的抗體。
21.一種用于鑒定能抑制權(quán)利要求14-19中LbpB多肽的化合物的方法，其中包括(a)讓侯選化合物與表達(dá)有LbpB多肽的細(xì)胞接觸；以及(b)觀察結(jié)合情況或?qū)δ苄詰?yīng)答的抑制，或者將上述細(xì)胞與侯選化合物接觸的能力同未表達(dá)LbpB活性的同一種細(xì)胞進(jìn)行比較。
22.一種疫苗，其中包括有效劑量的權(quán)利要求14-19所述多肽以及一種藥用載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22中的疫苗，其中所述的組合物包括至少一種其他腦膜炎奈瑟氏球菌抗原。
24.一種用于對人進(jìn)行接種抵抗奈瑟氏球菌病的方法，其中包括向所述人施用含有有效劑量權(quán)利要求14-19所述多肽的組合物。
25.一種用于對人進(jìn)行接種抵抗奈瑟氏球菌病的方法，其中包括向所述人施用含有有效劑量權(quán)利要求3-7所述多核苷酸的組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24中所述的方法，其中所述多肽采用口服、皮下、直腸、氣管內(nèi)、肌內(nèi)、或鼻腔內(nèi)給藥。
27.根據(jù)權(quán)利要求25中所述的方法，其中所述多核苷酸采用皮下、氣管內(nèi)、肌內(nèi)、或鼻腔內(nèi)給藥。
28.一種用于診斷人奈瑟氏球菌病的方法，其中包括下述步驟用來自待診斷人的生物體液樣品與一種抗體溫育，該抗體是通過用權(quán)利要求14-19所述多肽免疫合適的人或動物制備而成的，其中如有奈瑟氏細(xì)菌存在則形成抗原-抗體復(fù)合物，然后分析所述體液樣品中是否有所述復(fù)合物存在。
29.一種用于治療奈瑟氏球菌病人的治療性組合物，其中包括至少一種抗權(quán)利要求14-19所述多肽的抗體以及一種合適藥用載體。
30.一種用于診斷人體中奈瑟氏菌感染的試劑盒，其中包括一種權(quán)利要求3-7所述多核苷酸或一種權(quán)利要求14-19所述多肽或者一種權(quán)利要求20所述抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了Lbp多肽和多核苷酸以及用重組技術(shù)生產(chǎn)這類多肽的方法。本發(fā)明還公開了利用Lbp多肽和多核苷酸設(shè)計奈瑟氏球菌病治療方案的方法,特別是設(shè)計這類疾病診斷實驗的方法。
文檔編號A61K48/00GK1275164SQ98810097
公開日2000年11月29日 申請日期1998年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月15日
發(fā)明者A·M·彼德森－費(fèi)恩霍姆, J·P·M·托馬森 申請人:烏得勒支大學(xué), 技術(shù)基金會