專利名稱：重組雞痘病毒疫苗rFPV－1218AIH5/N1及其構(gòu)建方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組雞痘病毒疫苗，特別是一種用雞痘病毒新鑒定的復(fù)制非必需區(qū)構(gòu)建同時(shí)表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒疫苗。
背景技術(shù)：
雞痘病毒(Fowlpox Virus，簡稱FPV)為痘病毒科、禽痘病毒屬的成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物病毒中最大的一種病毒。最獨(dú)特的性質(zhì)是它們在感染細(xì)胞的胞漿復(fù)制，而不在細(xì)胞核內(nèi)。成熟的病毒粒子為磚型，大小為250×350nm，F(xiàn)PV的基因組為雙股線性DNA，大小約300kb，分子量約為2～4×105KD，G+C含量達(dá)35％，且其DNA不具有感染性。通過重組DNA技術(shù)，以FPV為載體研制禽類基因工程重組活病毒疫苗，或哺乳動(dòng)物非復(fù)制型重組活病毒載體疫苗受到越來越多研究者的重視。FPV基因組寵大，可插入較長外源基因，構(gòu)建多價(jià)或多聯(lián)重組病毒活疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。FPV載體與已報(bào)道的病毒載體如痘苗病毒、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、細(xì)小病毒、馬立克氏病病毒、煙草花葉病毒等相比具有明顯的優(yōu)勢。FPV自然條件下只感染禽類，但能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生頓挫性感染，雖不產(chǎn)生有感染性的子代病毒粒子，卻能自動(dòng)合成加工外源抗原并提呈到細(xì)胞表面，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。
已有多種類型的具有生物活性的蛋白質(zhì)在重組雞痘病毒(recombinantfowlpox virus，rFPV)中得到表達(dá)。如禽流感病毒(即AIV)的血凝素基因(HA)、新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因、馬立克氏病病毒(MDV)的gB基因、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因、狂犬病病毒糖蛋白和麻疹病毒融合蛋白基因等，以表達(dá)外源基因的rFPV進(jìn)行免疫，在SPF雞或無母源抗體的商品雞均可提供特異性的免疫保護(hù)，因此，F(xiàn)PV載體不僅可以用作家禽的疫苗，而且可以用作哺乳動(dòng)物的疫苗。
現(xiàn)有技術(shù)中，F(xiàn)PV疫苗在商品禽中已使用了70多年，此疫苗可引起輕微的、自限性局部感染。同時(shí)，F(xiàn)PV宿主范圍較窄，僅感染禽，因此是相對比較安全的疫苗病毒。
雞痘病毒載體已經(jīng)研究了近二十年，但能應(yīng)用于臨床的重組病毒寥寥無幾，原因何在？一個(gè)主要原因就是母源抗體的干擾。就拿我國的現(xiàn)狀來說，為控制疫情的發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失，種雞一般需要反復(fù)接種針對MDV、NDV、AIV、IBDV、FPV等的多種疫苗，導(dǎo)致我國的商品雞普遍帶有高母源抗體。其中針對H9N2亞型AIV的母源抗體高達(dá)27-28，H5N1亞型AIV的母源抗體也達(dá)到了25-26，這就給商品雞疫苗的使用和疫情的監(jiān)測帶來不便。
Taylor等發(fā)現(xiàn)，在有較高ND母源抗體的試驗(yàn)雞上，共表達(dá)NDV F和HN基因的重組FPV的抵抗NDV強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)率較在SPF雞上有所下降。因此，針對外源基因的抗體干擾了重組FPV的免疫(Taylor J，Christensen L，Gettig R，et al.Efficacy of a recombinant fowlpox-basedNewcastle disease virus vaccine candidate against velogenic and respiratorychallenge.Avian Dis，1996，40(1)173-80.)。本室共構(gòu)建的9個(gè)表達(dá)HPAIV基因的rFPVs無論是否能夠誘導(dǎo)HI抗體，在SPF雞上均能抵抗強(qiáng)毒AIV的攻擊，免疫保護(hù)率均為100％，構(gòu)建的3個(gè)共表達(dá)HPAIV和MPAIV HA基因的重組苗在SPF雞上均能抑制MPAIV的排出，免疫效力與油苗相當(dāng)。而在帶有高水平AIV母源抗體的商品雞上，保護(hù)率均有不同程度的下降。表明針對外源蛋白的母源抗體對重組FPV的免疫效力確實(shí)存在一定的影響。另有構(gòu)建的NDV的主要保護(hù)性抗原的重組病毒疫苗進(jìn)行的商品雞試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果也表明，重組FPV的免疫效力因存在針對NDV或AIV的母源抗體而受到很大的影響(丁煒東，曹麗萍，張?bào)w銀等.表達(dá)新城疫病毒F和HN基因重組雞痘病毒疫苗的遺傳穩(wěn)定性和免疫效力試驗(yàn).中國獸醫(yī)雜志，2005，4110-14.韋棟平，劉玉良，邵衛(wèi)星等.共表達(dá)新城疫F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒.微生物學(xué)報(bào)，2004，4414-18.)。
為了獲得理想的重組病毒首先得進(jìn)行病毒復(fù)制非必需區(qū)的克隆與篩選，外源基因只有插入到病毒基因的復(fù)制非必需區(qū)才有可能實(shí)現(xiàn)蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，而且載體表達(dá)外源基因直接受其在載體中插入位點(diǎn)的制約，因此非必需區(qū)的獲得是構(gòu)建重組病毒的先決條件。病毒復(fù)制非必需區(qū)又有嚴(yán)格的非必需區(qū)及一般非必需區(qū)之分，在構(gòu)建重組病毒時(shí)必須選擇嚴(yán)格的復(fù)制非必需區(qū)，才能維持親本株的復(fù)制能力及保證重組病毒的免疫效力。
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，本室以前構(gòu)建的插入載體p11S的復(fù)制非必需區(qū)FPV7S正好處于開放性閱讀框架上，可能破壞了IL-18結(jié)合蛋白基因。目前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)細(xì)胞表達(dá)的IL-18結(jié)合蛋白能夠抑制機(jī)體IL-18依賴性IFN-γ的產(chǎn)生(Xiang Y，Moss B.IL-18 binding and inhibition ofinterferon induction by human poxvirus encoded proteins.Proc Natl Acad Sci，1999，961537-11542.和Aizawa Y，Akita K，Taniai M，et al.Cloning andexpression of interleukin-18 binding protein.FEBS Lett，1999，445338-342.)。據(jù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-18是IL-1家族中具有多種功能的致炎癥細(xì)胞因子，其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ、Th-1型免疫應(yīng)答并激活NK細(xì)胞的活性，這對小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生有效抗VV感染的免疫應(yīng)答起到重要的作用。而IL-18結(jié)合蛋白可能具有對抗機(jī)體炎癥反應(yīng)的功能，對病毒在宿主體內(nèi)的繁殖與擴(kuò)散是有利的。
為了解決這一缺陷，孫蕾，劉武杰，陳素娟等重新篩選了雞痘病毒嚴(yán)格的復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18，構(gòu)建了雞痘病毒表達(dá)載體p12-18，載體于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO1385，其長度為10450bp。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于為了克服現(xiàn)有載體的不足，發(fā)明一種能增加重組雞痘病毒基因工程疫苗在商品雞群使用的實(shí)用性，同時(shí)保持和增強(qiáng)重組雞痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性，可使用新的雞痘病毒表達(dá)載體表達(dá)外源基因，使得重組雞痘病毒活疫苗早日商品化的重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1。
本發(fā)明疫苗為含同時(shí)表達(dá)H5亞型AIV HA基因和NA基因的重組雞痘病毒疫苗，保藏號CGMCC NO1915。
本發(fā)明是一種含共表達(dá)H5亞型禽流感血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因的重組雞痘病毒(rFPV)疫苗，同時(shí)表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA和NA基因，不受母源抗體干擾，能增加重組雞痘病毒基因工程疫苗在商品雞群使用的實(shí)用性，同時(shí)保持和增強(qiáng)重組雞痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性，使得重組雞痘病毒活疫苗早日應(yīng)用于臨床。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法。
包括以下步驟(1)獲得含H5亞型AIV HA基因整個(gè)閱讀框架的基因片段；(2)獲得含H5亞型AIV NA基因整個(gè)閱讀框架的基因片段；(3)將上述基因片段置于各自的合適啟動(dòng)子下游，插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必需片段FPV12-18和報(bào)告基因LacZ的雞痘病毒表達(dá)載體p12-18中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1；(4)用轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1轉(zhuǎn)染已感染wt-FPV的雞胚成纖維細(xì)胞CEF，通過同源重組獲得共表達(dá)H5亞型AIV HA和NA基因的rFPV；(5)增殖和收獲共表達(dá)H5亞型AIV HA和NA基因的rFPV，即重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1。
重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1于2007年1月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO1915。
通過以上方法能得到不受母源抗體干擾的重組雞痘病毒活疫苗，其方法科學(xué)、可靠性強(qiáng)，獲得的疫苗穩(wěn)定性好，純度高。
上述步驟(1)中，H5亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴(kuò)增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，根據(jù)已發(fā)表的H5亞型AIV HA基因序列，設(shè)計(jì)以下引物PH5A1 5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTTTTCTT-3’PH5A2 5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增出H5亞型AIV HA基因整個(gè)閱讀框架。
上述步驟(2)中，通過RT-PCR擴(kuò)增出H5亞型AIV NA基因整個(gè)閱讀框架。
H5亞型AIV NA基因可以通過以下具體方法獲得，根據(jù)發(fā)表的H5亞型AIV NA基因的序列，分別設(shè)計(jì)H5N1亞型AIV NA基因的反轉(zhuǎn)錄引物及NA基因根據(jù)已發(fā)表的H5亞型AIV NA基因序列設(shè)計(jì)引物，PNA1 5’-CCCGGGGCCACCATGAATCCAAATCAGAAGATAA-3’PNA2 5’-TCTAGAAAGCTTAAAAAAATTACTTGTCAATGGTGAATGG-3’
經(jīng)94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，5個(gè)循環(huán)后；繼續(xù)94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10min，4℃保存。取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。進(jìn)行回收和純化，并與pGEM-T easyvector進(jìn)行連接。用SmaI+HindIII雙酶切法篩選，以切出1.4Kb大小條帶的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒為pTNA。
將H5亞型AIV HA和NA基因分別連接到T-載體，測序證明所得的基因序列的正確性。
為了表達(dá)H5亞型AIV HA和NA基因，需要足夠長度和功能活性的啟動(dòng)子連接到上述基因上。在步驟(3)中，啟動(dòng)子可以是任何能夠在重組雞痘病毒(rFPV)感染細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的FPV啟動(dòng)子、痘苗病毒啟動(dòng)子或人工合成啟動(dòng)子。
步驟(3)中，啟動(dòng)子和上述步驟(1)、(2)基因可以通過酶切加接的方法或用PCR設(shè)計(jì)引物加接的方法連接在一起，按常規(guī)方法將其插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必須片段和報(bào)告基因LacZ的FPV插入載體p12-18中，在將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，按常規(guī)方法純化并分析重組體，以確保得到正確的轉(zhuǎn)移載體。堿裂解方法制備轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA并以PEG純化質(zhì)粒DNA。構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1，長度為13700bp。
在步驟(4)中，用GeneJammerTM轉(zhuǎn)染試劑將轉(zhuǎn)移載體分別與wt-FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現(xiàn)單個(gè)典型蝕斑后，用含有X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，藍(lán)斑篩選純化得重組病毒rFPV-12LSH5NA。
rFPV中外源基因的插入和表達(dá)，可通過核酸雜交、PCR擴(kuò)增外源基因、重組病毒與特異性抗體結(jié)合的反應(yīng)性及所表達(dá)外源基因產(chǎn)物的生物學(xué)特性等方法予以鑒定。
在步驟(5)中，將表達(dá)H5亞型AIV HA基因的rFPV在CEF單層上增殖，使病毒在CEF中大量擴(kuò)增。長成完全病變后收獲，分別吸取0.1ml病毒液，以細(xì)胞培養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋，取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度的病毒液接種生長于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的形成致密單層的CEF，每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔接種0.1ml病毒液。37℃培養(yǎng)72h，然后觀察病變，計(jì)算接種每一稀釋度病毒液的CEF上形成的蝕斑數(shù)目，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算病毒原液中含有的病毒蝕斑形成單位(PFU)。接種實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的用途。
用于防治H5亞型禽流感病毒。特別是雞皮下使用本發(fā)明所述的疫苗，使用量為104-106PFU/羽?？蓪5亞型禽流感病毒具有良好的防治效果。


圖1為H5亞型AIV HA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。
圖中，M200bp DNA ladder maker；1G5株HA基因PCR產(chǎn)物。
圖2為H5亞型AIV NA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。
圖中，M200bp DNA ladder maker；1RT-PCR product of NA gene。
圖3為重組質(zhì)粒p1218AIH5的酶切鑒定電泳圖譜。
圖中，1p1218AIH5(EcoRI)；2p12-18(BamHI+SmaI)；3pTH5A(HindIII+BamHI)；MDL2000+15000。
圖4為重組質(zhì)粒p1218AIH5/N1的酶切鑒定電泳圖譜。
圖中，1pPELNA(HindIII)；2p1218AIH5HindIII)；3p1218AIH5/N1(PstI)；MMarkIII(λDNA/HindIII+EcoRI)。
圖5-1、5-2、5-3為含H5亞型AIV HA和NA基因的轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1的構(gòu)建圖。
圖6為純化重組病毒感染CEF后形成的蘭色空斑。
圖7為重組病毒感染CEF后表達(dá)外源蛋白質(zhì)的熒光圖。
圖8為H5亞型AIV HA基因的序列。
圖9為H5亞型AIV NA基因的序列。
具體實(shí)施例方式
以下將結(jié)合實(shí)施例子與附圖具體說明，但是下例實(shí)施例子是在進(jìn)一步解釋而不是限制本發(fā)明。
以下涉及的雞痘病毒表達(dá)載體p12-18，載體于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO1385，其長度為10450bp。
步驟一H5亞型AIV HA基因的擴(kuò)增、克隆及序列分析根據(jù)測定的H5亞型AIV HA基因的序列，設(shè)計(jì)H5A基因的PCR擴(kuò)增引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
H5A基因的擴(kuò)增引物上游引物PH5A1的5’端引入BamHI位點(diǎn)和Kozak序列，下游引物PH5A2的5’端引入BamHI、HindIII位點(diǎn)外，還引入了痘病毒基因組早期基因的轉(zhuǎn)錄終止信號。上、下游引物跨幅約為1.7kb，覆蓋整個(gè)H5A基因編碼框。
PH5A1 5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTTTTCTT-3’PH5A2 5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’取以上的質(zhì)粒pTH5A，用Expand High Fidelity PCR system擴(kuò)增H5A基因。輕輕混勻后，按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，一共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保存。循環(huán)結(jié)束后，取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。進(jìn)行回收和純化，并與pGEM-T easy vector進(jìn)行連接。用BamHI+HindIII雙酶切法篩選，以切出1.7Kb大小條帶的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒，命名為pTH5A。陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序確證。
步驟二H5亞型AIV HA基因的擴(kuò)增、克隆及序列分析根據(jù)已發(fā)表的H5亞型AIV NA基因的序列，分別設(shè)計(jì)H5N1亞型AIVNA基因的反轉(zhuǎn)錄引物及NA基因。
NA基因的擴(kuò)增引物上游引物PNA1的5’端引入SmaI位點(diǎn)和Kozak序列；下游引物PNA2的5’端引入XbaI、HindIII位點(diǎn)外，還引入了痘病毒基因組早期基因的轉(zhuǎn)錄終止信號。上、下游引物跨幅約為1.4kb，覆蓋整個(gè)NA基因編碼框。
PNA1 5’-CCCGGGGCCACCATGAATCCAAATCAGAAGATAA-3’PNA2 5’-TCTAGAAAGCTTAAAAAAATTACTTGTCAATGGTGAATGG-3’94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，5個(gè)循環(huán)后；繼續(xù)94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10min，4℃保存。取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。進(jìn)行回收和純化，并與pGEM-T easyvector進(jìn)行連接。用SmaI+HindIII雙酶切法篩選，以切出1.4Kb大小條帶的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒，命名為pTNA。陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序確證。
步驟三轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1的構(gòu)建如圖3，將質(zhì)粒pTH5A用HindIII酶切經(jīng)klenow酶補(bǔ)平，酚∶氯仿抽提回收線型質(zhì)粒DNA，再用BamHI酶切電泳回收1.7kb片段，分別與用SmaI和BamHI酶切的雞痘病毒表達(dá)載體p12-18連接，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5。將質(zhì)粒pTNA用XbaI和SmaI雙酶切，反應(yīng)組成為質(zhì)粒2μg、10×buffer A 4μl、1μl限制性內(nèi)切酶，補(bǔ)加超純水至40μl，37℃消化1.5h。用XbaI和SmaI按同樣方法雙酶切質(zhì)粒pSKIFN，得中間載體pSKPELNA；再將質(zhì)粒pSKPELNA用SacI部分酶切后用SalI完全酶切，與用SacI和SalI完全酶切的PUC18連接得含NA基因表達(dá)盒的中間質(zhì)粒pPPELNA。用HindIII酶切質(zhì)粒pPPELNA，回收1.5kb左右的NA表達(dá)盒PE/L-NA與經(jīng)Hind III酶切的線性質(zhì)粒p1218AIH5連接，篩選陽性重組質(zhì)粒并命名為p1218AIH5/N1，長度為13700bp。
步驟四轉(zhuǎn)染與純化轉(zhuǎn)染按GeneJammerTM6轉(zhuǎn)染試劑的說明進(jìn)行。在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)SPF成纖維細(xì)胞至形成單層，以0.1MOI的wt-FPV疫苗株感染CEF，37℃培養(yǎng)3～4h，倒去上清用DMEM基礎(chǔ)基洗滌兩次后加4ml備用。將1-2μgp1218AIH5/N1分別溶于30μl的TE，按1∶6將GeneJammerTM6稀釋到100μlDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置室溫作用15min，將p1218AIH5/N1的上述混合物緩慢滴加至已感染wt-FPV CEF的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混勻；37℃培養(yǎng)6h后換維持液，待細(xì)胞完全病變后收獲病毒，-70℃～37℃反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選。
將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現(xiàn)單個(gè)典型蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，37℃培養(yǎng)72h，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑進(jìn)一步克隆純化，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色。
表達(dá)H5亞型AIV HA和NA基因的不同重組雞痘病毒的鑒定用rFPV-1218AIH5/N1感染已形成致密單層的CEF，并分別設(shè)rFPV-11SH5A和wt-FPV為陽性和陰性對照。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)直至出現(xiàn)典型蝕斑后，傾去培養(yǎng)液，以PBS(0.01M，pH7.4)輕輕洗滌一次，然后用冷甲醇固定10min；加入稀釋度為1∶1000的鼠抗H5亞型AIV G5株的單克隆抗體，37℃孵育1h；以含0.05％吐溫-80的0.01M PBS(簡稱PBST，pH7.2)洗5min×3次，再加入稀釋度為1∶200的羊抗鼠IgG-FITC熒光抗體，37℃孵育1h；用PBST洗滌5min×3次后置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄結(jié)果。
重組病毒的免疫效力實(shí)驗(yàn)1、rFPVs在SPF雞抵抗H5亞型AIV的免疫效力(以保護(hù)臨床不發(fā)病不死亡為指標(biāo))7日齡白來航SPF雛雞隨機(jī)分組，分別于頸部皮下免疫rFPV-11SH5A、rFPV-12LSH5A、rFPV-11SH5NA、rFPV-1218AIH5/N1、wt-FPV、PBS和H5亞型AI油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞。于免疫后7，10，14，18，21天采血，分離血清檢測HI抗體效價(jià)。免疫后21天，用劑量為105ELD50/只的A/Goose/Huadong/G5/1996株進(jìn)行滴鼻攻毒。所有試驗(yàn)雞于攻毒后持續(xù)觀察18天，記錄試驗(yàn)雞的發(fā)病和死亡情況。
在SPF雞的免疫保護(hù)試驗(yàn)中，無論重組疫苗能否誘生HI抗體的產(chǎn)生，其PI均為100，不同的載體、不同的外源基因組合、不同的親本病毒的重組病毒免疫效力均沒差異。
表1.SPF雞接種rFPVs后抵抗H5亞型AIV強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)作用

2、rFPVs在商品雞的免疫效力(以保護(hù)臨床不發(fā)病不死亡為指標(biāo))10日齡商品代伊莎蛋雞隨機(jī)分組，每組26只雞，分別于頸部皮下免疫rFPV-11SH5A、rFPV-12LSH5A、rFPV-11SH5NA、rFPV-1218AIH5/N1、wt-FPV、PBS和H5亞型AI油乳劑滅活疫苗免疫商品雞。于免疫后7，10，14，18，21，24，28天采血分離血清檢測HI抗體效價(jià)。
免疫后28天，為用劑量為105ELD50/只的A/Goose/Huadong/G5/1996株進(jìn)行滴鼻攻毒。所有試驗(yàn)雞于攻毒后持續(xù)觀察18天，記錄試驗(yàn)雞的發(fā)病和死亡情況。
在商品雞的免疫保護(hù)試驗(yàn)中，雙價(jià)苗rFPV-11SH5NA和rFPV-1218AIH5/N1的PI分別為45.4和81.8，差異顯著。可見，由p12-18載體構(gòu)建的疫苗比相應(yīng)的由p11S載體構(gòu)建的疫苗免疫效力高。
表2.商品蛋雞接種rFPVs后抵抗H5亞型AIV強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)試驗(yàn)

ggatccgcca ccatggagaa aatagtgctt tttcttgtcgacaaaa aaatctcgta ttagtagaaa caagggtgcccggggcca ccatgaatcc aaatcagaag ataatctagaaagc ttaaaaaaat tacttgtcaa tggtgaatgg
權(quán)利要求
1.重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1，其特征在于該疫苗為含同時(shí)表達(dá)H5亞型AIV HA基因和NA基因的重組雞痘病毒疫苗，保藏號CGMCCNO1915。
2.如權(quán)利要求1所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)獲得含H5亞型AIV HA基因整個(gè)閱讀框架的基因片段；(2)獲得含H5亞型AIV NA基因整個(gè)閱讀框架的基因片段；(3)將上述基因片段置于各自的合適啟動(dòng)子下游，插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必需片段FPV12-18和報(bào)告基因LacZ的雞痘病毒表達(dá)載體p12-18中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1；(4)用轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1轉(zhuǎn)染已感染wt-FPV的雞胚成纖維細(xì)胞CEF，通過同源重組獲得共表達(dá)H5亞型AIV HA和NA基因的rFPV；(5)增殖和收獲共表達(dá)H5亞型AIV HA和NA基因的rFPV，即重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(1)中，H5亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴(kuò)增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，通過以下引物PH5A1 5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTTTTCTT-3’PH5A2 5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增出H5亞型AIV HA基因整個(gè)閱讀框架。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)中，H5亞型AIVNA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴(kuò)增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，通過以下引物PNA1 5’-CCCGGGGCCACCATGAATCCAAATCAGAAGATAA-3’PNA2 5’-TCTAGAAAGCTTAAAAAAATTACTTGTCAATGGTGAATGG-3’RT-PCR擴(kuò)增出H5亞型AIVNA基因整個(gè)閱讀框架。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中，啟動(dòng)子可以是任何能夠在重組雞痘病毒感染細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的FPV啟動(dòng)子、痘苗病毒啟動(dòng)子或人工合成啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中，啟動(dòng)子和步驟(1)、(2)獲得基因通過酶切加接的方法或用PCR設(shè)計(jì)引物加接的方法連接在一起，按常規(guī)方法將其插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必須片段FPV12-18和報(bào)告基因LacZ的FPV插入載體中，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p1218AIH5/N1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(4)中，用GeneJammerTM轉(zhuǎn)染試劑將轉(zhuǎn)移載體分別與wt-FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞CEF，將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現(xiàn)單個(gè)典型蝕斑后，用含有X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，藍(lán)斑篩選純化得重組病毒rFPV-1218AIH5/N1。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的構(gòu)建方法，其特征在于在雞胚成纖維細(xì)胞CEF單層上增殖，使病毒在雞胚成纖維細(xì)胞CEF中擴(kuò)增。
9.重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的用途，用于防治H5亞型禽流感。
全文摘要
重組雞痘病毒疫苗rFPV－1218AIH5/N1及其構(gòu)建方法、用途，涉及一種重組雞痘病毒疫苗的構(gòu)建技術(shù)。先分別將含H5亞型AIV HA基因片段和含H5亞型AIV NA基因片段置于各自啟動(dòng)子下游，插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必需片段FPV12－18和報(bào)告基因的雞痘病毒表達(dá)載體p12－18中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體；再用轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染已感染wt－FPV的雞胚成纖維細(xì)胞，通過同源重組獲得共表達(dá)H5亞型AIV HA和NA基因的rFPV；最后增殖和收獲rFPV，即重組雞痘病毒疫苗。本發(fā)明產(chǎn)品不受母源抗體干擾，能增加重組雞痘病毒基因工程疫苗在商品雞群使用的實(shí)用性，可使重組雞痘病毒活疫苗早日應(yīng)用于臨床。
文檔編號C12N15/85GK101066449SQ20071002268
公開日2007年11月7日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者劉秀梵, 陳素娟, 孫蕾, 劉武杰 申請人:揚(yáng)州大學(xué)