專利名稱：重組雞痘病毒疫苗rFPV－12LSH5H9及其構(gòu)建方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組雞痘病毒疫苗，特別是一種用雞痘病毒新的復(fù)制非必需區(qū)構(gòu)建共表達H5和H9亞型禽流感病毒主要保護性抗原基因的重組雞痘病毒聯(lián)合疫苗。
背景技術(shù)：
雞痘病毒(Fowlpox Virus，簡稱FPV)為痘病毒科、禽痘病毒屬的成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的動物病毒中最大的一種病毒。最獨特的性質(zhì)是它們在感染細(xì)胞的胞漿復(fù)制，而不在細(xì)胞核內(nèi)。成熟的病毒粒子為磚型，大小為250×350nm，F(xiàn)PV的基因組為雙股線性DNA，大小約300kb，分子量約為2～4×105KD，G+C含量達35％，且其DNA不具有感染性。通過重組DNA技術(shù)，以FPV為載體研制禽類基因工程重組活病毒疫苗，或哺乳動物非復(fù)制型重組活病毒載體疫苗受到越來越多研究者的重視。FPV基因組寵大，可插入較長外源基因，構(gòu)建多價或多聯(lián)重組病毒活疫苗，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。FPV載體與已報道的病毒載體如痘苗病毒、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、細(xì)小病毒、馬立克氏病病毒、煙草花葉病毒等相比具有明顯的優(yōu)勢。FPV自然條件下只感染禽類，但能在哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生頓挫性感染，雖不產(chǎn)生有感染性的子代病毒粒子，卻能自動合成加工外源抗原并提呈到細(xì)胞表面，刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。
已有多種類型的具有生物活性的蛋白質(zhì)在重組雞痘病毒(recombinantfowlpox virus，rFPV)中得到表達。如禽流感病毒(即AIV)的血凝素基因(HA)、新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因、馬立克氏病病毒(MDV)的gB基因、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因、狂犬病病毒糖蛋白和麻疹病毒融合蛋白基因等，以表達外源基因的rFPV進行免疫，在SPF雞或無母源抗體的商品雞均可提供特異性的免疫保護，因此，F(xiàn)PV載體不僅可以用作家禽的疫苗，而且可以用作哺乳動物的疫苗。
現(xiàn)有技術(shù)中，F(xiàn)PV疫苗在商品禽中已使用了70多年，此疫苗可引起輕微的、自限性局部感染。同時，F(xiàn)PV宿主范圍較窄，僅感染禽，因此是相對比較安全的疫苗病毒。
雞痘病毒載體已經(jīng)研究了近二十年，但能應(yīng)用于臨床的重組病毒寥寥無幾，原因何在？一個主要原因就是母源抗體的干擾。就拿我國的現(xiàn)狀來說，為控制疫情的發(fā)生，減少經(jīng)濟損失，種雞一般需要反復(fù)接種針對MDV、NDV、AIV、IBDV、FPV等的多種疫苗，導(dǎo)致我國的商品雞普遍帶有高母源抗體。其中針對H9N2亞型AIV的母源抗體高達27-28，H5N1亞型AIV的母源抗體也達到了25-26，這就給商品雞疫苗的使用和疫情的監(jiān)測帶來不便。
Taylor等發(fā)現(xiàn)，在有較高ND母源抗體的試驗雞上，共表達NDV F和HN基因的重組FPV的抵抗NDV強毒攻擊的免疫保護率較在SPF雞上有所下降。因此，針對外源基因的抗體干擾了重組FPV的免疫(Taylor J，ChristensenL，Gettig R，et al.Efficacy of a recombinant fowlpox-based Newcastle diseasevirus vaccine candidate against velogenic and respiratory challenge.AvianDis，1996，40(1)173-80.)。本室共構(gòu)建的9個表達HPAIV基因的rFPVs無論是否能夠誘導(dǎo)HI抗體，在SPF雞上均能抵抗強毒AIV的攻擊，免疫保護率均為100％，構(gòu)建的3個共表達HPAIV和MPAIV HA基因的重組苗在SPF雞上均能抑制MPAIV的排出，免疫效力與油苗相當(dāng)。而在帶有高水平AIV母源抗體的商品雞上，保護率均有不同程度的下降。表明針對外源蛋白的母源抗體對重組FPV的免疫效力確實存在一定的影響。另有構(gòu)建的NDV的主要保護性抗原的重組病毒疫苗進行的商品雞試驗試驗結(jié)果也表明，重組FPV的免疫效力因存在針對NDV或AIV的母源抗體而受到很大的影響(丁煒東，曹麗萍，張體銀等.表達新城疫病毒F和HN基因重組雞痘病毒疫苗的遺傳穩(wěn)定性和免疫效力試驗.中國獸醫(yī)雜志，2005，4110-14.韋棟平，劉玉良，邵衛(wèi)星等.共表達新城疫F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒.微生物學(xué)報，2004，4414-18.)。
為了獲得理想的重組病毒首先得進行病毒復(fù)制非必需區(qū)的克隆與篩選，外源基因只有插入到病毒基因的復(fù)制非必需區(qū)才有可能實現(xiàn)蛋白產(chǎn)物的表達，而且載體表達外源基因直接受其在載體中插入位點的制約，因此非必需區(qū)的獲得是構(gòu)建重組病毒的先決條件。病毒復(fù)制非必需區(qū)又有嚴(yán)格的非必需區(qū)及一般非必需區(qū)之分，在構(gòu)建重組病毒時必須選擇嚴(yán)格的復(fù)制非必需區(qū)，才能維持親本株的復(fù)制能力及保證重組病毒的免疫效力。
根據(jù)本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，本室以前構(gòu)建的插入載體p11S的復(fù)制非必需區(qū)FPV7S正好處于開放性閱讀框架上，可能破壞了IL-18結(jié)合蛋白基因。目前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)細(xì)胞表達的IL-18結(jié)合蛋白能夠抑制機體IL-18依賴性IFN-γ的產(chǎn)生(Xiang Y，Moss B.IL-18 binding and inhibition ofinterferon induction by human poxvirus encoded proteins.Proc Natl Acad Sci，1999，961537-11542.和Aizawa Y，Akita K，Taniai M，et al.Cloning andexpression of interleukin-18 binding protein.FEBS Lett，1999，445338-342.)。據(jù)實驗證實，IL-18是IL-1家族中具有多種功能的致炎癥細(xì)胞因子，其能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IFN-γ、Th-1型免疫應(yīng)答并激活NK細(xì)胞的活性，這對小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生有效抗VV感染的免疫應(yīng)答起到重要的作用。而IL-18結(jié)合蛋白可能具有對抗機體炎癥反應(yīng)的功能，對病毒在宿主體內(nèi)的繁殖與擴散是有利的。
為了解決這一缺陷，孫蕾，劉武杰，陳素娟等重新篩選了雞痘病毒嚴(yán)格的復(fù)制非必需區(qū)FPV1-2，構(gòu)建了雞痘病毒表達載體p12-18，載體于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO1385，其長度為10450bp。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是為了克服現(xiàn)有載體的不足，能增加重組雞痘病毒基因工程疫苗在商品雞群使用的實用性，同時保持和增強重組雞痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表達產(chǎn)物的免疫原性，可使用新的雞痘病毒表達載體表達外源基因，使得重組雞痘病毒活疫苗早日商品化，提供一種能在母源抗體陽性的商品雞群使用的重組雞痘病毒基因工程疫苗。
本發(fā)明疫苗為含共表達H5和H9亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒疫苗，2005年6月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 1391。
本發(fā)明的重組雞痘病毒中的外源基因既含H5亞型AIV HA基因又含H9亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒(rFPV)疫苗，不受母源抗體干擾，能增加重組雞痘病毒基因工程疫苗在商品雞群使用的實用性，同時保持和增強重組雞痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表達產(chǎn)物的免疫原性，使得重組雞痘病毒活疫苗早日應(yīng)用于臨床，一次免疫可預(yù)防兩種亞型禽流感。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的構(gòu)建方法包括以下步驟(1)獲得含H5亞型AIV HA基因整個閱讀框架的基因片段。
(2)獲得含H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架的基因片段。
(3)將上述基因片段置于各自合適的啟動子下游，背向串聯(lián)插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必需片段FPV1-2和報告基因(LacZ)的插入雞痘病毒表達載體p12-18中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p12LSH5H9，長度為14000bp。
(4)用轉(zhuǎn)移載體p12LSH5H9轉(zhuǎn)染已感染wt-FPV的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，通過同源重組獲得共表達H5和H9亞型AIV HA基因的rFPV-12LSH5H9。
通過以上方法能得到不受母源抗體干擾的重組雞痘病毒活疫苗，其方法科學(xué)、可靠性強，獲得的疫苗穩(wěn)定性好，純度高。
步驟(1)中，H5亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，根據(jù)已發(fā)表的H5亞型AIV HA基因序列設(shè)計引物，PH5A1 5’-AAAGGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTC-3’PH5A2 5’-GGGGGATCCAAGCTTATAAAAACTGAACTCACAGATTTAAATGC-3’先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴增出H5亞型AIV HA基因整個閱讀框架。
步驟(2)中，H9亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，根據(jù)已發(fā)表的H9亞型AIV HA基因序列設(shè)計引物，PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴增出H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架。
分別將H5和H9亞型AIV HA基因連接到T-載體，測序證明所得的基因序列的正確性。
在步驟(3)中，為了分別表達H5和H9亞型AIV HA基因，需要足夠長度和功能活性的啟動子連接到上述各自基因上。啟動子可以是任何能夠在重組雞痘病毒(rFPV)感染細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的FPV啟動子、痘苗病毒啟動子或人工合成啟動子，啟動子和上述基因可以通過酶切加接的方法或用PCR設(shè)計引物加接的方法連接在一起，按常規(guī)方法將其插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必須片段和報告基因LacZ的FPV插入載體中(孫蕾，劉武杰，陳素娟等.雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)的選擇對重組雞痘病毒免疫效力的影響.微生物學(xué)報，2005，45(3)42-45.)，在將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，按常規(guī)方法純化并分析重組體，以確保得到正確的轉(zhuǎn)移載體。堿裂解方法制備轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA并以PEG純化質(zhì)粒DNA。
在步驟(4)中，用GeneJammerTM轉(zhuǎn)染試劑將轉(zhuǎn)移載體分別與wt-FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現(xiàn)單個典型蝕斑后，用含有X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，藍(lán)斑篩選純化得重組病毒rFPV-12LSH5H9。
rFPV中外源基因的插入和表達，可通過核酸雜交、PCR擴增外源基因、重組病毒與特異性抗體結(jié)合的反應(yīng)性及所表達外源基因產(chǎn)物的生物學(xué)特性等方法予以鑒定。
最后，還可將共表達H5和H9亞型AIV HA基因的rFPV在CEF單層上增殖，使病毒在CEF中大量擴增。長成完全病變后收獲，分別吸取0.1ml病毒液，以細(xì)胞培養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋，取10-4、10-5、10-6三個稀釋度的病毒液接種生長于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的形成致密單層的CEF，每個稀釋度接種4孔，每孔接種0.1ml病毒液。37℃培養(yǎng)72h，然后觀察病變，計算接種每一稀釋度病毒液的CEF上形成的蝕斑數(shù)目，根據(jù)計數(shù)結(jié)果計算病毒原液中含有的病毒蝕斑形成單位(PFU)。接種實驗用動物。
本發(fā)明的第三個目的在于發(fā)明重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的用途，用于防治H5亞型禽流感和用于防治H9亞型禽流感。
本重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9用于防治H5、H9亞型禽流感，特別是禽類皮下使用本發(fā)明所述的疫苗，使用量為104-106PFU/羽?？蓪5、H9亞型禽流感病毒具有良好的防治效果。


圖1為H5亞型AIV HA基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。
圖中，M列為200bp DNA ladder maker；1列為G5株HA基因PCR產(chǎn)物。
圖2為H9亞型AIV HA基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。
圖中，M列為200bp DNAladder maker；1列為F株H9A基因PCR產(chǎn)物。
圖3為重組質(zhì)粒p12LSH5A的酶切鑒定電泳圖譜。
圖中，1列為p12LSH5A(EcoRI)；2列為p12-18(BamHI+SmaI)；3列為pTH5A(HindIII+BamHI)；M列為DL2000+15000。
圖4為重組質(zhì)粒p12LSH5H9的酶切鑒定電泳圖譜。
圖中，1列為pPELH9(HindIII)；2列為p12LSH5 A(EcoRI)；3列為p12LS H5A(HindIII)；4列為p12LSH5H9(PstI)；M列為DL2000+15000。
圖5為含H5和H9亞型AIV HA基因的轉(zhuǎn)移載體p12LSH5H9的構(gòu)建圖。
圖6為純化重組病毒感染CEF后形成的蘭色空斑。
圖7為重組病毒感染CEF后表達外源蛋白質(zhì)的熒光圖。
圖8為H5亞型AIV HA基因的序列圖。
圖9為H9亞型AIV HA基因的序列圖。
具體實施例方式
以下將結(jié)合實施例子與附圖具體說明，但是下例實施例子是在進一步解釋而不是限制本發(fā)明。
以下涉及雞痘病毒表達載體p12-18為2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO1385，其長度為10450bp。
步驟一H5亞型AIV HA基因的擴增、克隆及序列分析根據(jù)已發(fā)表的H5亞型AIV HA基因的序列，設(shè)計H5A基因的PCR擴增引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
H5A基因的擴增引物上游引物PH5A1的5’端引入BamHI位點和Kozak序列(如方框所示)，下游引物PH5A2的5’端引入BamHI、HindIII位點外，還引入了痘病毒基因組早期基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(如方框所示)。上、下游引物跨幅約為1.7kb，覆蓋整個H5A基因編碼框。
PH5A1 5’-AAAGGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTC-3’BamHIPH5A2 5’-GGGGGATCCAAGCTTATAAAAACTGAACTCACAGATTTAAATGC-3’BamHI HindIII取以上的質(zhì)粒pTH5A，用Expand High Fidelity PCR system擴增H5A基因。輕輕混勻后，按下列循環(huán)參數(shù)進行PCR擴增94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，一共進行30個循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保存。循環(huán)結(jié)束后，取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。進行回收和純化，并與pGEM-T easy vector進行連接。用BamHI+HindIII雙酶切法篩選，以切出1.7Kb大小條帶的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒，命名為pTH5A。陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進行測序，得到確證。
步驟二H9亞型AIV HA基因的擴增、克隆及序列分析根據(jù)已發(fā)表的H9亞型AIV HA的序列，設(shè)計H9N2亞型AIV HA基因的PCR擴增引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
H9A基因的擴增引物上游引物PH9A1的5’端引入BamHI位點和Kozak序列(如方框所示)；下游引物PH9A2的5’端引入BamHI、HindIII位點外，還引入了痘病毒基因組早期基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(如方框所示)。上、下游引物跨幅約為1.7kb，覆蓋整個H9A基因編碼框。
PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’BamHIPH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’BamHI HindIII以質(zhì)粒pTH9A為模板，用PH9A1和PH9A2引物和Expand High FidelityPCR system對H9A基因進行PCR擴增，使H9A基因翻譯起始區(qū)前連接一段Kozak序列，終止密碼子后連接痘病毒早期轉(zhuǎn)錄終止信號T5NT。PCR循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，一共進行30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物通過電泳鑒定后，進行回收和純化，并與pGEM-T easy vector進行連接。用BamHI+HindIII雙酶切法篩選，以切出1.7Kb大小條帶的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒，命名為pTH9A。陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進行測序，得到確證。
步驟三轉(zhuǎn)移載體(p12LSH5H9)的構(gòu)建如圖5所示，將質(zhì)粒pTH5A用HindIII酶切經(jīng)klenow酶補平，酚∶氯仿抽提回收線型質(zhì)粒DNA，再用BamHI酶切電泳回收1.7kb片段，分別與用SmaI和BamHI酶切的載體質(zhì)粒p12-18連接，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p12LSH5A。用BamHI酶切質(zhì)粒pTH9A，回收1.7kb的H9A基因與同樣經(jīng)BamHI酶切的線性質(zhì)粒pSKIFN連接，得中間載體pSKPELH9A；再將質(zhì)粒pSKPELH9A用SacI和SalI雙酶切，與用SacI和SalI雙酶切的PUC18連接得含H9A基因表達盒的中間質(zhì)粒pPPELH9A。用HindIII酶切質(zhì)粒pPPELH9A，回收1.9kb左右的H9A基因表達盒PE/4-H9A與經(jīng)HindIII酶切的線性質(zhì)粒p12LSH5A連接，篩選陽性重組質(zhì)粒并命名為p12LSH5H9。
步驟四轉(zhuǎn)染與純化轉(zhuǎn)染按GeneJammerTM6轉(zhuǎn)染試劑的說明進行。在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)SPF成纖維細(xì)胞至形成單層，以0.1MOI的wt-FPV疫苗株感染CEF，37℃培養(yǎng)3～4h，倒去上清用DMEM基礎(chǔ)基洗滌兩次后加4ml備用。將1-2μg p12LSH5H9分別溶于30μl的TE，按1∶6將GeneJammerTM6稀釋到100μl DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置室溫作用15min，將p12LSH5H9的上述混合物緩慢滴加至已感染wt-FPVCEF的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混勻；37℃培養(yǎng)6h后換維持液，待細(xì)胞完全病變后收獲病毒，-70℃～37℃反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選。
將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現(xiàn)單個典型蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，37℃培養(yǎng)72h，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑進一步克隆純化，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色。
步驟五共表達H5和H9亞型AIV HA基因的不同重組雞痘病毒的鑒定H9A基因表達產(chǎn)物的鑒定用rFPV-11SH5H9和rFPV-12LSH5H9感染形成致密單層的CEF，并分別設(shè)單表達H9A基因的重組雞痘病毒rFPV-11SH9A與野生型雞痘病毒作對照。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)直至出現(xiàn)典型蝕斑后，傾去培養(yǎng)液，以PBS(0.01M，pH7.4)洗滌一次，然后用冷甲醇固定10min；加入稀釋度為1∶1000的鼠抗H9N2亞型AIVF株的單克隆抗體，37℃孵育1h；以含0.05％吐溫-80的0.01M PBS(簡稱PBST，pH7.2)洗5min×3次，再加入稀釋度為1∶200的羊抗鼠IgG-FITC熒光抗體，37℃孵育1h；用PBST洗滌5min×3次后置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄結(jié)果。
H5A基因表達產(chǎn)物的鑒定用rFPV-11SH5H9和rFPV-12LSH5H9感染形成致密單層的CEF，并分別設(shè)單表達H5A基因的重組雞痘病毒rFPV-11SH5A與野生型雞痘病毒作對照。按上述步驟，待單層CEF出現(xiàn)典型蝕斑后用冷甲醇固定，先后用雞抗H5N1亞型AIV G5株的單克隆抗體和羊抗鼠IgG-FITC熒光抗體與之作用，充分洗滌后置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄結(jié)果。
應(yīng)用重組病毒的免疫效力實驗1、SPF實驗雞接種rFPVs后抵抗H9亞型AIV感染的免疫保護作用(以攻毒后第5天的排毒為指標(biāo))7日齡自來航SPF雛雞隨機分組，分別于頸部皮下免疫rFPV-11SH9A、rFPV-12LSH9A、rFPV-11SH5H9、rFPV-12LSH5H9、wt-FPV、PBS和H9亞型AI油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞。于免疫后7，10，14，18，21天采血，分離血清檢測HI抗體效價。免疫后21天，用劑量為107ELD50/只的H9亞型AIVF株進行滴鼻攻毒，攻毒后5天采集口腔棉拭子，用10日齡非免疫雞胚分離病毒。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SPF雞的免疫保護試驗中，各種重組疫苗均能誘生針對H9亞型AIV的特異性HI抗體。由p12-18載體構(gòu)建的疫苗比由p11S載體構(gòu)建的相應(yīng)疫苗誘生的HI抗體水平略高。rFPV-11SH5H9、rFPV-12LSH5H9的PI分別為88.89和100。由p12-18載體構(gòu)建的疫苗比由p11S載體構(gòu)建的相應(yīng)疫苗保護率高。
表1.SPF雞接種rFPVs后抵抗H9亞型AIV感染的免疫保護作用

2、rFPVs在SPF雞抵抗H5亞型AIV的免疫效力(以保護臨床不發(fā)病不死亡為指標(biāo))7日齡白來航SPF雛雞隨機分組，分別于頸部皮下免疫rFPV-11SH5A、rFPV-12LSH5A、rFPV-11SH5H9、rFPV-12LSH5H9、wt-FPV、PBS和H5亞型AI油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞。于免疫后7，10，14，18，21天采血，分離血清檢測HI抗體效價。免疫后21天，用劑量為105ELD50/只的A/Goose/Huadong/G5/1996株進行滴鼻攻毒。所有試驗雞于攻毒后持續(xù)觀察18天，記錄試驗雞的發(fā)病和死亡情況。
在SPF雞的免疫保護試驗中，無論重組疫苗能否誘生HI抗體的產(chǎn)生，其PI均為100，不同的載體、不同的外源基因組合、不同的親本病毒的重組病毒免疫效力均沒差異。
表2.SPF雞接種rFPVs后抵抗H5亞型AIV強毒攻擊的免疫保護作用

3、rFPVs在商品雞抵抗H9亞型AIV的免疫效力(以攻毒后第5天的排毒為指標(biāo))10日齡商品代伊莎蛋雞隨機分組，每組26只雞，分別于頸部皮下免疫rFPV-11SH9A、rFPV-12LSH9A、rFPV-11SH5H9、rFPV-12LSH5H9、wt-FPV、PBS和H9亞型AI油乳劑滅活疫苗免疫商品雞。于免疫后7，10，14，18，21，24，28天采血分離血清檢測HI抗體效價。
免疫后28天，用劑量為107ELD50/只的H9亞型AIVF株進行滴鼻攻毒，攻毒后5天采集口腔棉拭子，用10日齡非免疫雞胚分離病毒。
在商品雞的免疫保護試驗中，油乳劑滅活苗的PI為83；雙聯(lián)苗rFPV-11SH5H9和rFPV-12LSH5H9的PI分別為58和68；由p12-18載體構(gòu)建的重組疫苗分別比相應(yīng)的由p11S載體構(gòu)建的重組疫苗的免疫效力略高。
表3.商品蛋雞接種rFPVs后抵抗H9亞型AIV感染的免疫保護試驗

4、rFPVs在商品雞抵抗H5亞型AIV的免疫效力(以保護臨床不發(fā)病不死亡為指標(biāo))10日齡商品代伊莎蛋雞隨機分組，每組26只雞，分別于頸部皮下免疫rFPV-11SH5A、rFPV-12LSH5A、rFPV-11SH5H9、rFPV-12LSH5H9、wt-FPV、PBS和H5亞型AI油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞。于免疫后7，10，14，18，21，24，28天采血分離血清檢測HI抗體效價。免疫后28天，用劑量為105ELD50/只的A/Goose/Huadong/G5/1996株進行滴鼻攻毒。所有試驗雞于攻毒后持續(xù)觀察18天，記錄試驗雞的發(fā)病和死亡情況。
在商品雞的免疫保護試驗中，雙聯(lián)苗rFPV-11SH5H9和rFPV-12LSH5H9的PI分別為27.2和45.4。由p12-18載體構(gòu)建的疫苗比相應(yīng)的由p11S載體構(gòu)建的疫苗免疫效力高。
表4.商品蛋雞接種rFPVs后抵抗H5亞型AIV強毒攻擊的免疫保護試驗

權(quán)利要求
1.重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9，其特征在于該疫苗為含表達H5和H9亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒疫苗，保藏號為CGMCC NO1391。
2.重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)獲得含H5亞型AIV HA基因整個閱讀框架的基因片段；2)獲得含H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架的基因片段；3)將上述基因片段置于各自合適的啟動子下游，背向串聯(lián)插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必需片段FPV1-2和報告基因(LacZ)的插入雞痘病毒表達載體p12-18中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p12LSH5H9，長度為14000bp；4)轉(zhuǎn)移載體p12LSH5H9轉(zhuǎn)染已感染wt-FPV的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，通過同源重組獲得共表達H5和H9亞型AIV HA基因的rFPV-12LSH5H9。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的制備方法，其特征在于步驟1)中，H5亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，通過以下引物PH5A1 5’-AAAGGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTC-3’PH5A2 5’-GGGGGATCCAAGCTTATAAAAACTGAACTCACAGATTTAAATGC-3’先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴增出H5亞型AIV HA基因整個閱讀框架。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的制備方法，其特征在于步驟2)中，H9亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，通過以下引物，PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴增出H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的制備方法，其特征在于步驟3)中，啟動子是任何能夠在重組雞痘病毒(rFPV)感染細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的FPV啟動子、痘苗病毒啟動子或人工合成啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的制備方法，其特征在于步驟3)中，啟動子和步驟1)、2)所得基因通過酶切加接的方法或用PCR設(shè)計引物加接的方法連接在一起，按常規(guī)方法將其插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必須片段FPV1-2和報告基因LacZ的FPV插入載體中。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的制備方法，其特征在于步驟4)中，用GeneJammerTM轉(zhuǎn)染試劑將轉(zhuǎn)移載體分別與wt-FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現(xiàn)單個典型蝕斑后，用含有X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，藍(lán)斑篩選純化得重組病毒rFPV-12LSH5H9。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的制備方法，其特征在于將共表達H5和H9亞型AIV HA基因的rFPV在CEF單層上增殖，使病毒在CEF中大量擴增。
9.重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的用途，其特征在于用于防治H5亞型禽流感。
10.重組雞痘病毒疫苗rFPV-12LSH5H9的用途，其特征在于用于防治H9亞型禽流感。
全文摘要
重組雞痘病毒疫苗rFPV－12LSH5H9及其構(gòu)建方法、用途，涉及一種重組雞痘病毒疫苗。先將含H5亞型和含H9亞型AIV HA基因片段置于各自合適的啟動子下游，背向串聯(lián)插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必需片段FPV1－2和報告基因的插入雞痘病毒表達載體p12－18中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體p12LSH5H9后，再將轉(zhuǎn)移載體p12LSH5H9轉(zhuǎn)染已感染wt－FPV的雞胚成纖維細(xì)胞，通過同源重組獲得共表達H5和H9亞型AIV HA基因的rFPV－12LSH5H9，是一種不受母源抗體干擾的重組雞痘病毒活疫苗，其方法科學(xué)、可靠性強，獲得的疫苗穩(wěn)定性好，純度高，可用于防治H5亞型、H9亞型禽流感。
文檔編號A61P31/00GK1736482SQ20051004145
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月8日
發(fā)明者劉秀梵, 陳素娟, 孫蕾, 劉武杰 申請人:揚州大學(xué)