專利名稱：通過(guò)向載體病毒蛋白中直接轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)插入外源免疫決定簇構(gòu)建重組病毒疫苗的制作方法
專利說(shuō)明通過(guò)向載體病毒蛋白中直接轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)插入外源免疫決定簇構(gòu)建重組病毒疫苗 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及通過(guò)向載體病毒蛋白中直接轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)插入外源免疫決定簇構(gòu)建重組病毒疫苗及相應(yīng)的組合物和方法。

背景技術(shù)：
接種是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最大的成就之一，使數(shù)百萬(wàn)人免受毀滅性疾病的作用。在疫苗廣泛使用之前，僅在美國(guó)了每年有成千上萬(wàn)的兒童和成人死于感染性疾病，世界范圍內(nèi)更多。接種被廣泛用于預(yù)防和治療細(xì)菌、病毒和其他病原體引起的感染。在接種中使用數(shù)種不同的方法包括給與殺滅的病原體、減毒活病原體和非活性的病原體亞單位。在病毒感染中，已發(fā)現(xiàn)活疫苗可帶來(lái)最強(qiáng)效和持續(xù)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
已研發(fā)抗黃病毒的減毒活疫苗，它們是一般通過(guò)被感染的蚊子和蜱傳播的體積小有包膜的正鏈RNA病毒。黃病毒科的黃病毒種包括約70種病毒，其中的大部分例如黃熱病(YF)、登革熱(DEN)、日本腦炎(JE)和蜱傳腦炎(TBE)為主要的人類病原體(參考Burke和Monath，F(xiàn)ields Virology，第4版1043-1126，2001)。
在研發(fā)黃病毒的疫苗中使用了不同的方法。例如對(duì)于黃熱病毒通過(guò)連續(xù)傳代研發(fā)了兩種疫苗(黃熱17D和法國(guó)嗜神經(jīng)性疫苗)(Monath，“Yellow Fever，”Plotkin和Orenstein，Vaccines，第3版，Saunders，Philadelphia，第815-879頁(yè)，1999)。另一種用于接種的黃病毒減毒方法涉及構(gòu)建嵌合黃病毒，其包括兩種(或更多)不同黃病毒的組分。理解如何構(gòu)建這些嵌合體需要解釋黃病毒基因組的結(jié)構(gòu)。
黃病毒蛋白由翻譯單一的長(zhǎng)閱讀框以生成多聚蛋白然后通過(guò)宿主和病毒蛋白酶組合對(duì)該多聚蛋白一系列復(fù)雜的翻譯后蛋白水解裂解生成成熟的病毒蛋白質(zhì)產(chǎn)生(Amberg等，J.Virol.738083-8094，1999；Rice，“Flaviviridae，”In Virology，F(xiàn)ields(編輯)，Raven-Lippincott，NewYork，1995，第I卷，第937頁(yè))。該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白以C-prM-E的順序排列在多聚蛋白中，其中“C”為衣殼，“prM”為病毒包膜結(jié)合膜(M)蛋白的前體，“E”為包膜蛋白。這些蛋白質(zhì)存在于多聚蛋白的N端區(qū)域而非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)位于該多聚蛋白的C端區(qū)域。
已制備了包括來(lái)自不同黃病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的嵌合黃病毒。例如所謂的ChimeriVaxTM技術(shù)應(yīng)用了黃熱病毒17D的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白傳遞其他黃病毒的包膜蛋白(prM和E)(參見(jiàn)，例如，Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999)。這一技術(shù)已用于研發(fā)抗登革熱、日本腦炎(JE)、西尼羅(WN)和圣路易腦炎(SLE)病毒的候選疫苗(參見(jiàn)，例如，Pugachev等，New Generation Vaccines，第三版，Levine等編輯，Marcel Dekker，New York，Basel，第559-571頁(yè)，2004；Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999；Guirakhoo等，Virology 257363-372，1999；Monath等，Vaccine 171869-1882，1999；Guirakhoo等，J.Virol.745477-5485，2000；Arroyo等，Trends Mol.Med.7350-354，2001；Guirakhoo等，J.Virol.784761-4775，2004；Guirakhoo等，J.Virol.789998-10008，2004；Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003；Arroyo等，J.Virol.7812497-12507，2004；和Pugachev等，Am.J.Trop.Med.Hyg.71639-645，2004)。
基于ChimeriVaxTM的疫苗已顯示出更有利的性質(zhì)，例如就以下性質(zhì)而言在底物細(xì)胞中復(fù)制、在小鼠模型中低神經(jīng)毒性、在猴子模型中高減毒性、體外和體內(nèi)高遺傳和表型穩(wěn)定性、在蚊子中的無(wú)效復(fù)制(對(duì)于預(yù)防自然界中的不可控傳播非常重要)以及單次劑量給予后可在小鼠、猴子和人中誘導(dǎo)強(qiáng)效的保護(hù)性免疫而不會(huì)引起免疫后副作用。確實(shí)，ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒，包含來(lái)自SA14-14-2 JE病毒(在中國(guó)使用的減毒活JE)的prM-E基因，已成功進(jìn)行了臨床前和I期和II期臨床試驗(yàn)(Monath等，Vaccine 201004-1018，2002；Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003)。相似地，已對(duì)ChimeriVaxTM-WN候選疫苗進(jìn)行了成功的I期臨床試驗(yàn)，其包含來(lái)自西尼羅病毒的prM-E序列，在E蛋白中摻入了3個(gè)特異氨基酸改變以增強(qiáng)減毒(Arroyo等，J.Virol.7812497-12507，2004)。
已進(jìn)行了其他減毒方法，例如黃病毒誘變，包括嵌合黃病毒。這些方法包括例如在包膜蛋白中引入替換、在3’未翻譯區(qū)內(nèi)的缺失和衣殼蛋白中的缺失(這些突變的實(shí)例參見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)Men等，J.Virol.703930-3937，1996；Mandl等，J.Virol.722132-2140，1998；Durbin等，AJTMH 65405-413，2001；Pletnev，Virology 282288-300，2001；Markoff等，J.Virol.763318-3328，2002；Kofler等，J.Virol.763534-3543，2002；Whitehead等，J.Virol.771653-1657，2003；Pletnev等，Virology 314190-195，2003；Pugachev等，Int.J.Parasitol.33567-582，2003；Bredenbeek等，J.Gen.Virol.841261-1268，2003；美國(guó)專利第6184024 B1號(hào)；WO 02/095075；WO 03/059384；WO03/092592；WO 03/103571；WO 2004/045529；和WO 2006/044857)。在另一方法中，使用轉(zhuǎn)座子檢測(cè)該ChimeriVaxTM-JE包膜蛋白E的允許插入位點(diǎn)。根據(jù)這一方法，用預(yù)期外源肽替代活突變病毒的插入轉(zhuǎn)座子(參見(jiàn)，例如WO 02/102828)。
Mason和其同事最近發(fā)表了基于假感染性病毒顆粒(PIV)的黃病毒疫苗(RepliVax)構(gòu)建方法(Mason等，Virology 351432-443，2006)。在黃病毒PIVs(迄今描述了YF 17D和WN病毒)中，該衣殼蛋白基因缺失，除了占據(jù)C約20個(gè)N端密碼子的5’環(huán)化信號(hào)序列。在以反式提供C蛋白的細(xì)胞中增殖PIV。C蛋白對(duì)于PIV包裝入子代病毒(PIV)顆粒中是必需的。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清中已包裝的PIVs并用作單周期復(fù)制疫苗，其可誘導(dǎo)強(qiáng)效的抗體應(yīng)答(由于空病毒顆粒的分泌)以及幾乎完整的T細(xì)胞應(yīng)答武器庫(kù)。這一方法的強(qiáng)效部分是由于黃病毒(例如，YF 17D)以及PIV感染樹(shù)突狀細(xì)胞和活化多重TLR途徑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力(Palmer等，J.Gen.Virol.88148-156，2007；Querec等，J.E.M.203413-424，2006)。
除了用作抗黃病毒感染的疫苗之外，已提議使用黃病毒例如嵌合黃病毒作為傳遞其他非黃病毒抗原的載體。在這一使用的一個(gè)實(shí)施例中，描述了向YF17D包膜蛋白E中插入外源肽的合理方法，這基于對(duì)黃病毒顆粒四級(jí)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，如冷凍電子顯微鏡分析并將已知的E蛋白二聚體X射線結(jié)構(gòu)擬合入電子密度圖中(Rey等，Nature375291-298，1995；Kuhn等，Cell 108717-725，2002)。已分析出融合后構(gòu)象的E蛋白三聚體的三維結(jié)構(gòu)(Modis等，Nature 427313-319，2004；Bressanelli等，EMBO J.23728-738，2004)。Galler和其同事檢測(cè)了E蛋白二聚體和三聚體的3D結(jié)構(gòu)并推論二聚體化結(jié)構(gòu)域II的fg環(huán)應(yīng)以二聚體和三聚體構(gòu)象暴露與溶劑中。他們使用該環(huán)向YF17D病毒的E蛋白中插入瘧疾的體液和T細(xì)胞表位并回收一些活突變體(Bonaldo等，J.Virol.798602-8613，2005；Bonaldo等，J.Mol.Biol.315873-885，2002；WO 02/072835)。然而使用這一方法不能確保就有效病毒復(fù)制、免疫原性和穩(wěn)定性而言所選位點(diǎn)允許/最適于插入各預(yù)期的外源肽(Galler等一些數(shù)據(jù)所證明)。而且，這一方法不可用于3D結(jié)構(gòu)未知的病毒蛋白(例如，黃病毒的prM/M、NS1和大多數(shù)其他NS蛋白)。
在其他方法中，如果在病毒ORF中基因間插入則可在黃病毒載體中表達(dá)外源免疫原蛋白/肽。例如，Andino及其同事嘗試在YE17D病毒多聚蛋白的數(shù)個(gè)位點(diǎn)表達(dá)側(cè)接病毒NS2B/NS3蛋白酶裂解位點(diǎn)的模型8-氨基酸抗腫瘤CTL表位，例如NS2B/NS1連接(McAllister等，J.Virol.749197-9205，2000)。其他人已使用NS2B/NS1位點(diǎn)表達(dá)流感病毒的免疫顯性T細(xì)胞表位(Barba-Spaeth等，J.Exp.Med.2021179-1184，2005)。Tao等在YF 17D病毒中的NS2B-NS3連接表達(dá)了瘧疾寄生蟲的10-氨基酸CTL表位并顯示出對(duì)被寄生蟲攻擊小鼠的良好保護(hù)(Tao等，J.Exp.Med.201201-209，2005)。最近我們?cè)贓/NS1連接表達(dá)了流感病毒的M2e肽(美國(guó)序列號(hào)60/900672)，Bredenbeek也成功在E/NS1連接表達(dá)了拉沙病毒的糖蛋白前體(Bredenbeek等，Virology345299-304，2006)。也可使用其他基因連接。在其他方法中，已雙順?lè)醋颖磉_(dá)外源肽(例如，在3’UTR中)。在其他方法中，單周期黃病毒已開(kāi)發(fā)成抗各種病原體的候選重組疫苗，并驗(yàn)證了出重組復(fù)制子的免疫原性潛質(zhì)(Jones等，Virology 331247-259，2005；Molenkamp等，J.Virol.771644-1648，2003；Westaway等，Adv.Virus.Res.5999-140，2003；Herd等，Virology 319237-248，2004；Harvey等，J.Virol.777796-7803，2003；Anraku等，J.Virol.763791-3799，2002；Varnavski等，J.Virol.744394-4403，2000)。在復(fù)制子中，缺失prM和E包膜蛋白基因或C-prM-E基因。因此，其可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制但不能生成病毒子代(因此為單周期復(fù)制)。當(dāng)以反式提供prM-E或C-prM-E基因時(shí)其可包裝入病毒顆粒中。感興趣的外源抗原可適當(dāng)插入缺失部位。就RepliVax而言，免疫后為單周期復(fù)制，不會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)散至周圍細(xì)胞/組織，得到對(duì)已表達(dá)的異種抗原的免疫應(yīng)答。或者可通過(guò)接種裸露DNA或RNA形式的復(fù)制子進(jìn)行免疫。在其他方法中可在RepliVaxPIVs中表達(dá)外源免疫原，例如取代缺失的C基因(Mason等，Virology351432-443，2006)。
流冒背景知識(shí)。在這一應(yīng)用中流冒免疫原用作模型抗原。流感病毒是全世界急性呼吸疾病的主要誘因。僅在美國(guó)每年的爆發(fā)可引起多于100000人住院以及20000至40000人死亡(Brammer等，MMWRSurveill.Summ.511-10，2002Lui等，Am.J.Public Health 77712-6，1987；Simonsen，Vaccine 17S3-10，1999；Thompson等，JAMA289179-186，2003)。由于每年的流感世界范圍內(nèi)約20％的兒童和5％的成人生病。歷史上有三種亞型的流感A病毒在人群中傳播，H1N1、H2N2和H3N2。從1968年以來(lái)，幾乎只有H1N1和H3N2傳播(Hilleman，Vaccine 203068-3087，2002；Nicholson等，Lancet 3621733-1745，2003；Palese等，J.Clin.Invest.1109-13，2002)。流感B病毒，其只有一種確定的亞型，也在人類中傳播，但是通常只引起比流感A病毒更輕微的疾病。目前的滅活疫苗包含三種組分，基于篩選的H1N1和H3N2流感A株和流感B株(Palese等，J.Clin.Invest.1109-13，2002)。周期性大流行病，例如1918年的H1N1大流行病可引起數(shù)百萬(wàn)人的死亡。流感專家認(rèn)為另一種流感大流行病是不可避免的并且可能即將來(lái)臨(Webby and Webster，Science 3021519-1522，2003)。目前H5N1禽流感的爆發(fā)-史上最大的一次，由對(duì)人類高致死株引起-可能(通過(guò)變異和/或遺傳重組)成為可造成嚴(yán)重后果的大流行病株。2003年在荷蘭發(fā)生了又一次令人震驚的狀況，在養(yǎng)禽業(yè)工作者中爆發(fā)了高致病性H7N7禽流感?？梢鸫罅餍胁〉钠渌麃喰蜑镠9和H6病毒。雖然比H5和H7的毒力小，但是在過(guò)去10年中二者已從水禽傳播至家禽。此外，在豬和人中已檢測(cè)到H9N2病毒(Webby and Webster，Science3021519-1522，2003)。盡管在過(guò)去數(shù)年中對(duì)禽病毒的大量關(guān)注，但人們?nèi)匀粚?duì)傳統(tǒng)的H1、H2和H3亞型病毒心存憂慮，因?yàn)橛捎谛碌目乖圆煌甑囊肟赡軙?huì)出現(xiàn)高毒力株。例如，H2病毒屬于高風(fēng)險(xiǎn)類別，因?yàn)樗鼈兪?957年“亞洲”流感流行的誘因，并持續(xù)地在野鴨和家鴨中循環(huán)。
目前預(yù)防和控制流感疾病的策略為每年針對(duì)當(dāng)年可能傳播的病毒株進(jìn)行免疫。最被認(rèn)可的流感疫苗由雞胚蛋生產(chǎn)并由滅活的完整病毒粒子或部分純化的病毒亞單位(“片段”疫苗)組成。這些疫苗在正常健康成人中70至90％有效(Beyer等，Vaccine 201340-1353，2002)。然而在老年人中的對(duì)抗疾病的有效性較低。美國(guó)和前蘇聯(lián)有鼻內(nèi)給藥的減毒活疫苗，其也由雞胚蛋生產(chǎn)(Treanor等，InNew GenerationVaccines，第3版.Levine編輯，M.M.New York，BaselMarcel Dekker；第537-557頁(yè)，2004)。美國(guó)疫苗(

)未批準(zhǔn)用于5歲以下的兒童和55歲以上的人，他們卻是流感疫苗的主要目標(biāo)人群。因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)識(shí)別的主要流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白經(jīng)突變和重排不斷變化，疫苗組分每年也需要改變以反映即將流行的病毒株的抗原性特征。因此現(xiàn)有疫苗必須每年制備，在流感季節(jié)之前制備并且不能貯存用于大流行病。此外，使用雞胚蛋白生產(chǎn)的效率很低。每只蛋只能生產(chǎn)1至2人劑量的滅活疫苗。提供足夠的無(wú)病原體的雞蛋是目前生產(chǎn)傳統(tǒng)疫苗的瓶頸。甚至在大流行病期間通常需要6個(gè)月生產(chǎn)足夠量的年度流感疫苗(Gerdil，Vaccine 211776-1779，2003)。正努力進(jìn)行多種研發(fā)以在細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)流感疫苗。然而，這一方法也存在許多挑戰(zhàn)，尤其是使用未經(jīng)認(rèn)可的細(xì)胞系。不論是使用雞蛋或細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行疫苗生產(chǎn)都必須應(yīng)用反向遺傳學(xué)和遺傳重排方法將預(yù)期生產(chǎn)疫苗的新流行病毒株轉(zhuǎn)化成可復(fù)制足夠滴度用于生產(chǎn)的生產(chǎn)株。所有這些與傳統(tǒng)流感疫苗相關(guān)的特點(diǎn)流感在大流行病的情況下均不適用。
基于重組血凝素(HA)或由腺病毒或α病毒傳遞的HA研發(fā)新穎流感疫苗可提高生產(chǎn)效率，但是并不能解決每年遺傳漂移的問(wèn)題和每年重新構(gòu)建疫苗的要求。
總而言之，公認(rèn)目前的流感疫苗需面對(duì)以下挑戰(zhàn) 1.就疫苗和病毒株匹配差而言的低效率；活適冷型病毒對(duì)年齡范圍的限制。
2.需要每年生新疫苗以解決病毒的抗原改變。
3.疫苗產(chǎn)量低。
4.構(gòu)建適當(dāng)?shù)闹嘏挪《居糜谏a(chǎn)需要的時(shí)間。
5.生產(chǎn)能力不足以滿足大流行病的需要。
6.大規(guī)模生產(chǎn)滅活抗原病毒中的生物安全問(wèn)題。
7.對(duì)雞蛋產(chǎn)品過(guò)敏的被接種者中或由于一些活適冷型病毒疫苗減毒不足引起不良反應(yīng)(Treanor等，InNew Generation Vaccines，第3版.Levine編輯，M.M.New York，BaselMarcel Dekker；第537-557頁(yè)，2004)。
流感疫苗學(xué)的“圣杯”為可引起對(duì)所有流感株的廣譜、長(zhǎng)期保護(hù)性免疫并可高產(chǎn)量生產(chǎn)、成本低、可貯存的單一產(chǎn)品。
所有有效的傳統(tǒng)流感疫苗可引起抗HA的病毒中和抗體，其目前代表了免疫相關(guān)保護(hù)。但是HA的免疫原性每年都會(huì)變化。近年來(lái)，其他流感病毒蛋白也吸引人們的注意成為疫苗靶標(biāo)。M2蛋白，由其是M2的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域(M2e)在流感A病毒中是高度保守的。圖9A顯示了我們對(duì)之前和最近的人和禽M2e序列的比對(duì)(來(lái)自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html)。不僅人流感病毒之間的M2e結(jié)構(gòu)域保守，禽病毒M2e序列也緊密排列(closely aligned)。最高水平的序列保守位于M2e蛋白的N端部分。因此非常值得注意的是已顯示M2e肽的N端13個(gè)氨基酸(比對(duì)中的陰影部分)是誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的主要原因(Liu等，F(xiàn)EMS Immunol.Med.Microbiol.35141-146，2003；Liu等，Immunol.Lett.93131-136，2004；Liu等，Microbes.Infect.7171-177，2005)。這引起通用流感A病毒疫苗的概念和希望。
M2e代表了M2的外23-氨基酸部分，其為病毒蛋白的一小部分。盡管在流感病毒粒子中不顯著，但是M2在病毒-感染細(xì)胞的表面表達(dá)豐富。但是，在普通的流感病毒感染中或用傳統(tǒng)疫苗接種時(shí)，對(duì)M2或M22決定簇的抗體應(yīng)答非常小。而且，對(duì)于M2蛋白的非病毒中和單克隆抗體顯示在被動(dòng)轉(zhuǎn)移的流感死亡小鼠模型中具有保護(hù)性(Fan等，Vaccine 222993-3003，2004；Mozdzanowska等，Vaccine 212616-2626，2003；Treanor等，J.Virol.641375-1377，1990)?；谶@些結(jié)果，許多疫苗研發(fā)者對(duì)M2和其高度保守M2e結(jié)構(gòu)域作為流感A疫苗組分具有極大的興趣。
M2或M2e抗體不中和病毒而是充分降低有效病毒復(fù)制以保護(hù)免受癥狀性疾病。公認(rèn)由M2引起的保護(hù)機(jī)制涉及NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。M2e胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的抗體(主要是IgG2a亞類)可識(shí)別被病毒感染細(xì)胞上展示的表位，其決定了由NK細(xì)胞消除感染細(xì)胞(Jegerlehner等，J.Immunol.1725598-1605，2004)。由于由M2引起的免疫性不是殺滅性的，感染之后存在有限的病毒復(fù)制，其可用于激活廣譜抗流感免疫應(yīng)答。就理論而言，這可導(dǎo)致對(duì)之后遇到相同病毒或異源株更長(zhǎng)更強(qiáng)的免疫記憶和更好的保護(hù)(Treanor等，InNew Generation Vaccines，第三版.Levine編輯，M.M.New York，BaselMarcel Dekker；第537-557頁(yè)，2004)。
Walter Fiers及其同事(Ghent University，比利時(shí))是驗(yàn)證基于M2e的疫苗潛質(zhì)的先驅(qū)。他們將M2e決定簇基因融合至乙肝病毒核心蛋白，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)可得到乙肝病毒核心蛋白表面上的M2e遞呈(HBc)(Fiers等，Virus Res.103173-176，2004；Neirynck等，Nat.Med.51157-1163，1999)。這些HBc-M2e顆粒在小鼠和白鼬中顯示出免疫原性并在各物種的流感病毒攻擊模型中具有保護(hù)性。
另一種保守流感病毒結(jié)構(gòu)域?yàn)镠A前體蛋白的成熟裂解位點(diǎn)HA0。它的高度保守(Macken等，Osterhaus，A.D.M.E.，Cox，N.，Hampson A.W.編輯，Options for the control of influenza IV.ElsevierScience，Amsterdam，The Netherlands，第103-106頁(yè)，2001)是由兩個(gè)功能約束引起的。首先，該序列必須保持宿主蛋白酶的適當(dāng)?shù)孜镆葬尫艃蓚€(gè)成熟的HA亞單位，HA1和HA2。其次，HA2的N端包含對(duì)于感染非常重要的融合肽(Lamb和Krug，InFields Virology.第4版.Knipe編輯，D.M.，Howley，P.M.，Griffin，D.E.，等PhiladelphiaLippincottWilliams and Wilkins；第1043-1126頁(yè)，2001)。融合肽在流感A和B病毒中均是保守的。在最近的報(bào)道中，Bianchi及其同事(Bianchi等，J.Virol.797380-7388，2005)驗(yàn)證了流感B病毒的結(jié)合HA0裂解肽可在小鼠中引起抗原性不同流感B病毒譜系致命攻擊的保護(hù)性免疫。值得注意的是結(jié)合A/H3/HA0肽也可保護(hù)被免疫小鼠免受流感B病毒的攻擊。-1位的嚴(yán)格保守精氨酸(裂解位點(diǎn)前的最后一個(gè)HA1殘基)以及+3和+9苯丙氨酸殘基(HA2的第3和第9個(gè)殘基)對(duì)于單克隆抗體的結(jié)合非常重要。因此，肽的保守C端部分顯示與保護(hù)相關(guān)，表明制備基于HA0裂解結(jié)構(gòu)域的通用型A和B人流感病毒疫苗的可能性。我們對(duì)人(H1、H2、H3和B)HA0和所有可用禽流感HA0序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html)的比對(duì)得到圖9B所示的共有序列(對(duì)于抗體結(jié)合和免疫原性重要的區(qū)域加陰影)。
最近，可適用可捕獲各種表位數(shù)據(jù)(www.immuneepitope.org)的綜合性在線數(shù)據(jù)庫(kù)(The Immune Epitope Database and Analysis Resources(IEDB))。綜合分析這些數(shù)據(jù)并鑒定出許多交叉保護(hù)流感表位，其可適用于構(gòu)建通用疫苗(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104246-251，2007和補(bǔ)充表格)。鑒定了B細(xì)胞和T細(xì)胞二者的可能表位(包括我們下面使用的H3N2的HA保護(hù)性表位)。絕大多數(shù)B細(xì)胞表位具有構(gòu)象，因此體積巨大。然而，可以通過(guò)本申請(qǐng)描述的直接隨機(jī)插入法鑒定出這些更長(zhǎng)表位的允許位點(diǎn)，例如在ChimeriVax病毒的分泌蛋白中。我們找到的用于更短插入片段的一些高度允許位點(diǎn)可允許長(zhǎng)插入片段(例如，在ChimeriVax-JE的prM蛋白中，見(jiàn)下文)。
人們正在研究各種M2e亞單位疫苗方法，包括肽結(jié)合物和表位展示顆粒。然而這些方法需要強(qiáng)效的佐劑以增強(qiáng)這些弱免疫原的免疫原性。這就M2e(以及很可能HA0)而言尤其其重要。由于所提出的保護(hù)機(jī)制(ADCC)，需要高水平的特異抗體以達(dá)到效力。普遍認(rèn)為正常血清IgG在NK細(xì)胞上與特異(抗M2e)IgG競(jìng)爭(zhēng)Fc受體，其為保護(hù)的主要介導(dǎo)子。因此需要研發(fā)通用大流行流感疫苗的替代方法。上述流感的醫(yī)學(xué)重要性、提高通用流感疫苗的需要以及流感病毒的適當(dāng)表位/抗原的可用性提供了重要病原體的一個(gè)實(shí)例，可使用本申請(qǐng)描述的方法生產(chǎn)抗該病原體的新疫苗。本申請(qǐng)描述的方法可等同地應(yīng)用于抗其他病原體的新/改良疫苗的構(gòu)建，如下文所述。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供生成包括一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)異源肽的病毒基因組的方法。這些方法包括以下步驟(i)提供一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)病毒基因(例如，在一個(gè)或多個(gè)穿梭載體中或在完整病毒基因組背景(context)中)；(ii)誘變目標(biāo)病毒基因以隨機(jī)插入插入位點(diǎn)；以及(iii)將編碼異源肽的核酸分子連接至目標(biāo)病毒基因誘變的隨機(jī)位點(diǎn)中。該方法可進(jìn)一步包括步驟(iv)用基因組核酸文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以啟動(dòng)病毒復(fù)制，然后(v)篩選活的(有效復(fù)制的)病毒重組子使可有效遞呈插入的肽。當(dāng)在一個(gè)或多個(gè)穿梭載體的背景下進(jìn)行時(shí)，該方法可進(jìn)一步包括將包括編碼異源肽的核酸分子庫(kù)的目標(biāo)病毒基因引入可衍生該目標(biāo)病毒基因的病毒基因組中以替代相應(yīng)的無(wú)插入片段的病毒基因的步驟。
本發(fā)明方法也包括通過(guò)將病毒基因組引入細(xì)胞(例如Vero細(xì)胞)從病毒基因組生成病毒載體以及從細(xì)胞或其上清中分離病毒載體。此外，用于本發(fā)明方法的目標(biāo)病毒基因可從之前用于本方法(或通過(guò)其他方法包含插入片段)的病毒或無(wú)插入片段的病毒獲得。
本發(fā)明方法也包括誘變兩個(gè)或更多(例如，2、3、4或更多個(gè))包括兩個(gè)或更多(例如，2、3、4或更多個(gè))目標(biāo)病毒基因的穿梭載體并向病毒基因組中引入兩個(gè)或更多個(gè)(例如，2、3、4或更多個(gè))包括編碼一個(gè)或多個(gè)異源肽的核酸分子的目標(biāo)病毒基因替代(in theplace of)無(wú)插入片段的對(duì)應(yīng)病毒基因。
本發(fā)明方法的誘變步驟可涉及通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變向目標(biāo)病毒基因中同時(shí)或依次引入一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移引物(transprimers)。這些轉(zhuǎn)移引物可通過(guò)內(nèi)切核酸酶消化移除，然后可通過(guò)在限制性內(nèi)切核酸酶消化位點(diǎn)的連接向目標(biāo)病毒基因中引入編碼異源肽的核酸分子。而且，本發(fā)明方法可涉及生成突變目標(biāo)基因的文庫(kù)。
應(yīng)用于本發(fā)明方法的病毒基因組可為黃病毒基因組，例如嵌合黃病毒，例如包括一種黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白和第二種不同黃病毒的膜前(pre-membrane)和包膜蛋白的嵌合黃病毒。在這些實(shí)例中，第一和第二種黃病毒可獨(dú)立選自例如日本腦炎、登革熱-1、登革熱-2、登革熱-3、登革熱-4、黃熱病、墨累谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、昆津、羅氏腦炎、伊利烏斯腦炎、蜱傳腦炎、俄羅斯春夏型腦炎、基亞薩努森林病、鄂木斯克出血熱、跳躍病、波瓦生、根岸、阿布塞塔羅夫、漢薩洛瓦(Hansalova)、阿泊依(Apoi)和海普病毒。此外，本發(fā)明可應(yīng)用完整的黃病毒基因組(例如黃熱病毒基因組，例如YF17D)。
應(yīng)用于本發(fā)明方法的目標(biāo)病毒基因可例如選自編碼包膜、衣殼、膜前、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的基因。
根據(jù)本發(fā)明方法引入病毒基因組的異源肽可包括一個(gè)或多個(gè)疫苗表位(例如，B細(xì)胞表位和/或T細(xì)胞表位)。該表位可衍生自病毒、細(xì)菌或寄生蟲病原體的抗原。例如，該表位可衍生自流感病毒(例如人或禽流感病毒)。就流感病毒表位而言，該異源肽可包括例如流感病毒M2e肽或包括流感血凝素前體蛋白裂解位點(diǎn)(HA0)的肽。在另一個(gè)實(shí)例中，該表位衍生自腫瘤相關(guān)抗原或變應(yīng)原。下文提供了其他可獲得異源肽的來(lái)源(例如病原體)以及這些肽和表位的實(shí)例。
本發(fā)明也包括通過(guò)本文所述任何方法生成的病毒基因組或其組合。而且，本發(fā)明包括由這些病毒基因組編碼的病毒載體，包括這些病毒載體的藥物組合物以及藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，以及給予患者肽的方法，其涉及給予患者這些藥物組合物。在該類方法的一個(gè)實(shí)例中，所述肽為抗原，進(jìn)行給藥以誘導(dǎo)針對(duì)該抗原衍生自的病原體或腫瘤的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明也包括包括不論是否由本文所述方法生產(chǎn)的黃病毒載體，其包括一個(gè)或多個(gè)被插入一個(gè)或多個(gè)選自衣殼、前膜、包膜NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的蛋白的異源肽。黃病毒可為例如黃熱病毒(例如，YF17D)或嵌合黃病毒(例如，包括第一種黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白和第二種不同黃病毒的膜前和包膜蛋白的嵌合黃病毒)。第一和第二種黃病毒可獨(dú)立選自例如日本腦炎、登革熱-1、登革熱-2、登革熱-3、登革熱-4、黃熱病、墨累谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、昆津、羅氏腦炎、伊利烏斯腦炎、蜱傳腦炎、中歐腦炎、基亞薩努森林病、俄羅斯春夏型腦炎、鄂木斯克出血熱、跳躍病、波瓦生、根岸、阿布塞塔羅夫、漢薩洛瓦、阿泊依和海普病毒。
本發(fā)明進(jìn)一步包括對(duì)應(yīng)于上文和本文其他部分描述的黃病毒載體的核酸分子或其互補(bǔ)體；包括這些病毒載體的藥物組合物和藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑；以及通過(guò)給予這些組合物向患者傳遞肽的方法。在這些方法的一個(gè)實(shí)例中，所述肽為抗原，進(jìn)行給藥以誘導(dǎo)針對(duì)衍生該抗原的病原體或腫瘤的免疫應(yīng)答。
在具體的實(shí)施例中，本發(fā)明包括本文描述的黃病毒載體，其包括在非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)的氨基酸236和237之間插入的異源肽。另一實(shí)例，其可單獨(dú)存在或與其他插入片段組合組合(例如NS1插入片段)，為包括插入載體的膜前蛋白的氨基端區(qū)域的異源肽。該插入片段可位于例如衣殼/膜前裂解位點(diǎn)前的-4、-2或-1位，或膜前蛋白的26位(或其組合)。而且，該膜前蛋白插入可任選包括可輔助從膜前蛋白中移除肽的溶蛋白性裂解位點(diǎn)。
可包括于本發(fā)明載體中的肽的具體實(shí)例包括流感(例如人或禽)M2e肽或包括流感(例如人或流感)血凝素前體蛋白裂解位點(diǎn)(HA0)的肽。下文和本文其他部分提供了其他實(shí)例。此外，該載體可包括多于一種的異源肽，例如人和禽流感M2e肽。此外，本發(fā)明載體可包括一個(gè)或多個(gè)本文所述第二位點(diǎn)適應(yīng)(adaptations)，其可提供改良的載體性質(zhì)(例如，改良的生長(zhǎng)特性) 本發(fā)明也包括對(duì)應(yīng)于本文所述黃病毒載體基因組的核酸分子或其互補(bǔ)體。而且，本發(fā)明包括包括病毒載體的醫(yī)藥組合物。該組合物可任選包括一種或多種藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。此外，該組合物可任選包括佐劑(例如，鋁化合物，例如明礬(alum))。組合物也可為凍干形式。
本發(fā)明也包括向受試者(例如人類患者或動(dòng)物例如家養(yǎng)動(dòng)物或家畜)傳遞肽的方法，其涉及給予本文所述的組合物。在一個(gè)實(shí)例中，進(jìn)行給藥以誘導(dǎo)針對(duì)衍生該抗原的病原體或腫瘤的免疫應(yīng)答。在其他實(shí)例中，該方法涉及給予亞單位疫苗。在這些實(shí)例中，可同時(shí)給予黃病毒載體和亞單位疫苗，黃病毒載體可作為初次劑量給予，亞單位疫苗可作為加強(qiáng)劑量給予或?qū)唵挝灰呙缱鳛槌醮蝿┝拷o予而黃病毒載體作為加強(qiáng)劑量給予。該亞單位疫苗可包括例如與乙肝病毒核心蛋白融合的異源肽(例如，流感M2e肽或包括流感血凝素前體蛋白裂解位點(diǎn)(HA0)的肽)的乙肝病毒核心顆粒。這些肽可為如本文所述的天然或共有序列。
本發(fā)明也包括生產(chǎn)本文所述載體的方法，涉及將編碼感興趣的肽的序列插入經(jīng)鑒定允許該插入的位點(diǎn)(使用例如本文所述方法)。這些載體可為黃病毒載體(例如，黃病毒載體或如本文所述的嵌合黃病毒(例如，ChimeriVaxTM-JE或ChimeriVaxTM-WN))。用于插入的示例性位點(diǎn)包括NS1-236和衣殼/膜前裂解位點(diǎn)前的-4、-2或-1位，或膜前蛋白的26位。
此外，本發(fā)明包括通過(guò)例如將本文所述任何載體與藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑、一種或多種佐劑和/或一種或多種其他活性試劑(例如亞單位疫苗)混合生產(chǎn)藥物組合物的方法。
本發(fā)明也包括在制備用于本文所述預(yù)防和治療方法的藥物中使用本文所述所有的病毒載體、核酸分子和肽。
本發(fā)明具有數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，如本發(fā)明所使用的活疫苗病毒(例如ChimeriVaxTM，黃熱病毒或其他活疫苗病毒)可在傳遞小分子多肽抗原分子(例如流感M2e或HA0裂解位點(diǎn)肽)方面提供提供顯著的益處。使用活載體例如基于黃病毒的載體的優(yōu)點(diǎn)包括(i)疫苗接種后增加抗原質(zhì)量；(ii)不需要佐劑；(iii)對(duì)先天和獲得性免疫應(yīng)答的強(qiáng)烈刺激(例如YF17D為最強(qiáng)效的已知免疫原)；(iv)由于例如ChimeriVaxTM(YF17D)感染抗原遞呈細(xì)胞例如樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的能力使得更有利進(jìn)行抗原遞呈的可能性；(v)獲得可提供終生免疫的單次激發(fā)疫苗的可能性；(vi)ChimeriVaxTM疫苗病毒的包膜易于交換，使得可選擇不同的重組疫苗，其中一些比其他在不同的地里區(qū)域更適合(生產(chǎn)雙重疫苗，包括抗地方流行黃熱病毒或避免群體中抗-載體免疫)；(vii)將完整活黃病毒載體修飾成被包裝的、單周期復(fù)制復(fù)制子或上述PIVs以消除不良反應(yīng)幾率或最小化依次使用中抗-載體免疫作用的可能性；(viii)將使用本文所述直接隨機(jī)誘變法插入的表位與其他基因間或雙順?lè)幢磉_(dá)或替代復(fù)制子中的缺失的抗原或PIVs結(jié)合以獲得對(duì)一種病原體(如果表位和其他已表達(dá)的抗原屬于相同病原體)或兩種或多種病原體(如果表位和其他表達(dá)的抗原屬于不同的病原體)更強(qiáng)效的免疫應(yīng)答以及(ix)降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明提供的其他優(yōu)點(diǎn)與以下事實(shí)相關(guān)本發(fā)明的嵌合黃病毒載體被充分減活以達(dá)到安全并仍可誘導(dǎo)對(duì)衍生嵌合體中蛋白質(zhì)尤其是插入該嵌合體的肽的黃病毒的保護(hù)性免疫。其他安全性來(lái)自本發(fā)明使用的一些載體為嵌合的因此消除了回復(fù)至野生型的可能性這一事實(shí)。本發(fā)明使用載體的其他優(yōu)點(diǎn)為黃病毒在細(xì)胞的細(xì)胞漿中復(fù)制，這樣病毒的復(fù)制策略不涉及將病毒基因組整合入宿主細(xì)胞，提供了重要的安全措施。此外，如下文進(jìn)一步描述，本發(fā)明的單一載體可用于傳遞單個(gè)抗原的多個(gè)表位或衍生自多于一種抗原的表位。
附加優(yōu)點(diǎn)為本文描述的直接隨機(jī)插入法可鑒定病毒蛋白中的廣譜允許位點(diǎn)，其可直接用于插入各種其他表位(如下文例證的NS1中的插入位點(diǎn))以及更長(zhǎng)的插入片段。附加優(yōu)點(diǎn)為一些在一種黃病毒中高度允許的插入位點(diǎn)在其他黃病毒中同樣允許，這是由于不同黃病毒蛋白的結(jié)構(gòu)/功能保守性。附加優(yōu)點(diǎn)為負(fù)載表位的重組黃病毒可用作例如亞單位疫苗的加強(qiáng)劑或由例如亞單位或死疫苗組分組成的混合疫苗的協(xié)同組分，其與重組病毒組分一起給予使免疫應(yīng)答顯著提高(如下文例證的A25疫苗與ACAM-Flu-A亞單位疫苗混合)。此外，所述隨機(jī)插入法可應(yīng)用于任何已重排的黃病毒(或缺陷型黃病毒)基因組，例如在經(jīng)修飾的TBE病毒中其中的結(jié)構(gòu)蛋白基因被轉(zhuǎn)移至基因組的3’端并在IRES元件的控制下在NS5之后表達(dá)(Orlinger等，J Virol.8012197-208，2006)。
從以下的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求中可顯而易見(jiàn)本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為通過(guò)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)隨機(jī)插入共有M2e肽至病毒的prM、E和/或NS1蛋白構(gòu)建ChimeriVaxTM-JE-flu的圖解。使用本圖所示的方法也可將C和NS2A-NS5靶向于插入外源肽(例如，T細(xì)胞表位) 圖2為構(gòu)建在prM/M、E和NS1基因中包含隨機(jī)插入的M2e肽的ChimeriVaxTM-JE-flu質(zhì)粒文庫(kù)的圖解。
圖3顯示了在ChimeriVaxTM-JE病毒的NS1蛋白中表達(dá)流感A病毒共有M2e保護(hù)性表位，如病毒空斑染色所顯示。感染后4天用抗JE多克隆抗體(A)或抗M2e單克隆抗體染色35-mm孔中的病毒空斑。用抗M2e單克隆抗體(C)染色100-mm培養(yǎng)皿(包含數(shù)百個(gè)病毒空斑)中的M2e-陽(yáng)性病毒空斑。
圖4為一個(gè)表格和一張照片，顯示了通過(guò)M2e MAb或JE多克隆抗體(左邊的表格；滴度最高的克隆以粗體表示)測(cè)定的篩選純化的ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e病毒克隆(最后的純化步驟之后P2水平的儲(chǔ)備)的滴度分析結(jié)果，以及克隆之一的染色實(shí)例(右邊的照片)。這些結(jié)果顯示克隆的純度并提供高遺傳穩(wěn)定性的證據(jù)。
圖5為ChimeriVaxTM-JE載體病毒在NS1基因中具體位置以及通過(guò)對(duì)病毒克隆A11-A92(包括用于下文所述實(shí)驗(yàn)中的克隆A25)測(cè)序鑒定的M2e插入片段的核苷酸和氨基酸序列的圖解。完整的105-核苷酸插入片段加亮表示。兩邊均含有側(cè)接GG殘基(加入以增加柔性)的M2e肽加框表示。BstBI限制性酶切位點(diǎn)加下劃線。由于轉(zhuǎn)座子的作用，在插入片段(加雙下劃線)的末端復(fù)制插入片段(SV)之前的兩個(gè)病毒氨基酸。
圖6A為ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e的克隆A25的圖解，其顯示了M2e插入片段在病毒基因組中的位置。圖6B為顯示用M2e和JE-特異性抗體染色在Vero細(xì)胞中傳代10次的A25病毒空斑的照片。圖6C為與ChimeriVaxTM-JE載體病毒相比A25病毒在P2和P12傳代時(shí)的生長(zhǎng)曲線圖片。D組圖為感染A25病毒或ChimeriVax-JE載體并用抗JE或抗M2e抗體染色的細(xì)胞的免疫熒光實(shí)例，也顯示了A25病毒有效表達(dá)M2e肽。
圖7為顯示第54天M2e特異性IgG總量的圖來(lái)自2和3免疫組的小鼠血清的連續(xù)稀釋樣品的ELISA OD450值見(jiàn)表5. 圖8為表5所示被免疫小鼠在第55天用20 LD50小鼠適應(yīng)A/PR/8/34流感病毒攻擊后的存活曲線的圖。
圖9為流感A病毒的通用M2e(A)和HA0(B)表位的比對(duì)圖解。最重要的序列部分(例如抗體結(jié)合)加陰影。
圖10為可使用本文描述的隨機(jī)插入法產(chǎn)生的多抗原構(gòu)建體的實(shí)例表達(dá)多個(gè)流感A病毒免疫原作為多重機(jī)制大流行病疫苗的ChimeriVax-JE復(fù)制子，例如表達(dá)NA或HA替代prM-E基因，隨機(jī)插入例如NS1中的M2e表位，例如NS3中的免疫顯性T細(xì)胞表位和插入基因間位點(diǎn)之一(或更多)的附加免疫原。2A自體蛋白酶(來(lái)自EMCV或FMDV)可從糖蛋白的剩余部位裂解NA。或者，可使用該IRES元件替代2A自體蛋白酶以重新起始NS蛋白的翻譯?？墒褂枚鄠€(gè)元件(例如，2A自體蛋白酶、泛素、IRES、用于NA基因的自發(fā)(autonomous)AUG)在所環(huán)繞位點(diǎn)產(chǎn)生NA的N端。相似地，可使用衍生自不同病原體的抗原產(chǎn)生抗數(shù)種病原體的疫苗構(gòu)建體。
圖11為用ChimeriVax-JE/NS1-M2e RNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染并立即用瓊脂覆蓋以消除病毒克隆之間競(jìng)爭(zhēng)的Vero細(xì)胞的M2e抗體染色培養(yǎng)皿的實(shí)例。用于轉(zhuǎn)染的RNA在體外連接的DNA模板上合成，該DNA模板通過(guò)連接來(lái)自質(zhì)粒pUC-AR03-rM2e的NS1-M2e基因文庫(kù)至pBSA-AR3-stop載體獲得。
圖12.顯示了在ChimeriVax-JE病毒的E蛋白中成功表達(dá)M2e肽用M2e MAb染色的插入片段突變體的聚集點(diǎn)(foci)。(A)第6天染色的包含起始35-氨基酸M2e的插入片段的變異體(實(shí)驗(yàn)2)。(B和C)第4天染色的分別含有17-氨基酸M2e和側(cè)接2個(gè)甘氨酸殘基的17-氨基酸M2e的變異體(實(shí)驗(yàn)3)。
圖13顯示了串聯(lián)插入ChimeriVax-JE NS1-236插入位點(diǎn)的人M2e+禽M2e表位。插入片段的總大小為56氨基酸。(A)加入A25病毒的禽M2e表位的圖解。(B)該病毒兩個(gè)變異體的具體序列上組圖顯示使用禽M2e插入片段的天然密碼子構(gòu)建的M2e人/M2e禽病毒的序列(人M2e加下劃線，禽M2e用陰影線加下劃線)；底部組圖顯示相同內(nèi)容，除了將禽M2e密碼子改變成兼并密碼子得到更高的遺傳穩(wěn)定性。(C)用JE和M2e抗體染色的M2e人/M2e禽病毒空斑。
圖14顯示在使用M2e表位鑒定的NS1-236插入位點(diǎn)上ChimeriVax-JE病毒耐受HAtag(流感H3)B/T細(xì)胞表位。(A)所回收活病毒的插入序列。(B)用抗HAtag MAb 12CA5染色Vero細(xì)胞上的病毒空斑。
圖15顯示黃病毒prM、E和NS1蛋白中不同形式的外源表位表達(dá)。
圖16顯示了prM蛋白中含有M2e的ChimeriVax-JE插入片段變異體。(A)與ChimeriVax-JE相比在一次實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的M1、M2、M3、M6和M8克隆的空斑實(shí)例。(B)prM-M2e克隆對(duì)比ChimeriVax-JE載體的生長(zhǎng)曲線。
圖17為prM中含有Me插入片段的ChimeriVax-JE克隆序列的圖解。顯示了SignalP 3.0在線程序預(yù)測(cè)的最可能的信號(hào)肽酶裂解位點(diǎn)。
圖18顯示了A25(ChimeriVax-JE/M2eNS1-236)病毒的ChimeriVax-WN02類似物構(gòu)建和第6天在瓊脂覆蓋下形成并用M2eMAb染色的空斑。
圖19顯示了ChimeriVax-WN02/A25和ChimeriVax-WN02/A25adapt病毒。(A)與A25原型病毒和ChimeriVax-WN02相比第5天在甲基纖維素覆蓋下形成的空斑純化病毒儲(chǔ)備物的空斑。(B)Vero細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線，MOI 0.001。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供生成包括異源肽的病毒載體的方法、包括這些肽的病毒載體、通過(guò)給予該活載體例如以誘導(dǎo)對(duì)衍生被引入肽所的病原體的免疫應(yīng)答傳遞這些肽的方法以及包括這些病毒載體的組合物。這些病毒載體、肽、方法和組合物的相詳細(xì)容見(jiàn)下文。
本發(fā)明的中心特征涉及通過(guò)隨機(jī)向減毒活疫苗病毒蛋白中插入多種病原性生物體的免疫原性肽構(gòu)建活的重組疫苗以在被感染細(xì)胞中有效表達(dá)這些肽并遞呈給免疫系統(tǒng)，目的在于誘導(dǎo)對(duì)目標(biāo)病原體的強(qiáng)效、長(zhǎng)期免疫。對(duì)于有效遞呈而言，將代表例如B細(xì)胞表位的外源肽隨機(jī)插入病毒蛋白中，例如僅是被感染細(xì)胞分泌(例如，NS1和黃病毒prM的氨基末端部分)或病毒顆粒(黃病毒的M和E包膜蛋白)中的蛋白以刺激強(qiáng)效的抗肽抗體應(yīng)答。肽，例如包括T細(xì)胞表位的肽可隨機(jī)插入非結(jié)構(gòu)病毒蛋白中，其可在被感染細(xì)胞內(nèi)部合成，導(dǎo)致通過(guò)MHC I/II復(fù)合物向免疫系統(tǒng)遞呈外源肽以誘導(dǎo)強(qiáng)效的細(xì)胞免疫。在結(jié)構(gòu)蛋白中插入也可導(dǎo)致有效的MHC介導(dǎo)的遞呈。
如下文詳細(xì)說(shuō)明，根據(jù)本發(fā)明向病毒基因中隨機(jī)方式的插入允許篩選最有效復(fù)制的重組病毒變異體，提供所插入肽的最大免疫原性(最佳肽構(gòu)象)和最穩(wěn)定的表達(dá)。也如下文所述，可商業(yè)購(gòu)買的包括例如可移除轉(zhuǎn)移引物的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)插入體系可用作構(gòu)建本發(fā)明重組子的工具。下文的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例部分詳細(xì)描述了本發(fā)明方法。簡(jiǎn)略而言，在這些實(shí)施例中，將在A型流感病毒株中高度保守的流感病毒(也包含T細(xì)胞表位)M2蛋白的共有B細(xì)胞表位M2e插入ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒的NS1、prM/M和E基因中。經(jīng)抗M2e抗體識(shí)別在NS1、prM/M和E蛋白中觀察到表達(dá)M2e肽的多個(gè)病毒克隆，將其中一些純化并進(jìn)一步進(jìn)行體外/體內(nèi)特性研究。此外，如下文所討論，將NS1插入片段從ChimeriVaxTM-JE背景轉(zhuǎn)移至ChimeriVaxTM-WN。
本發(fā)明方法的一個(gè)元素為轉(zhuǎn)座子僅用于向預(yù)期基因(多多個(gè)基因)中隨機(jī)插入一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)這一事實(shí)。然后將編碼所需外源肽的DNA片段在限制性酶切位點(diǎn)處整合入該基因。接著可將突變基因文庫(kù)整合入完整的病毒基因組中(RNA病毒的cDNA)，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞并收獲異源病毒子代。病毒為自己“選擇”最適當(dāng)?shù)牟迦胛稽c(diǎn)，而不影響其活力和有效復(fù)制。快速篩選足夠數(shù)量的突變病毒克隆然后使用對(duì)插入肽特異的抗體檢測(cè)高抗原性，通過(guò)免疫動(dòng)物檢測(cè)高免疫原性(適當(dāng)?shù)碾臉?gòu)象和向免疫細(xì)胞遞呈)并檢測(cè)抗肽免疫應(yīng)答和/或?qū)舻谋Ｗo(hù)以及遺傳穩(wěn)定性，例如通過(guò)監(jiān)控體外或體內(nèi)多次傳代突變病毒的過(guò)程中該肽的存在和表達(dá)，以及基因組測(cè)序顯示對(duì)重組疫苗病毒的生物學(xué)表形具有價(jià)值的任何適應(yīng)(例如，生產(chǎn)中產(chǎn)量更高、遺傳穩(wěn)定性更強(qiáng)和免疫原性更高)。結(jié)果鑒定出“最好”的疫苗病毒變體。這一“讓病毒決定”的方法因此可提供許多益處。
提供了本發(fā)明方法基礎(chǔ)的隨機(jī)插入方法的原理圖解于圖1。在這一實(shí)施例中，將流感A的M2e肽引入結(jié)構(gòu)prM/M和E蛋白以及非結(jié)構(gòu)NS1蛋白中。該結(jié)構(gòu)蛋白以病毒顆粒(也可能分泌prM的N端)從細(xì)胞釋放，NS1被轉(zhuǎn)運(yùn)至感染細(xì)胞的表面，它的一部分分離并在胞外循環(huán)。胞外遞呈是強(qiáng)效抗體應(yīng)答的前提。因此使用NS1蛋白遞呈M2e尤其引人注意，因?yàn)樵撾谋粋鬟f至細(xì)胞表面，模仿了流感病毒M2的天然情況，其對(duì)于M2介導(dǎo)免疫的一些方面是重要的；而prM和E蛋白遞呈可導(dǎo)致更高的免疫應(yīng)答，因?yàn)槎鄠€(gè)肽拷貝在假定為更強(qiáng)免疫原的病毒顆粒表面遞呈。
首先使用可商業(yè)購(gòu)買的試劑盒例如New England Biolabs(Beverly，MA)GPS-LS Tn7介導(dǎo)誘變?cè)噭┖袑⑾拗菩悦盖形稽c(diǎn)(例如PmeI位點(diǎn))隨機(jī)整合入亞克隆的目標(biāo)基因中(大部分為每個(gè)基因分子一個(gè)位點(diǎn)，盡管可根據(jù)需要改變這一頻率，例如通過(guò)附加周期的誘變)。然后通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶(例如PmeI)消化移除轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移引物部分并用M2eDNA插入片段替代，從而生成突變基因質(zhì)粒文庫(kù)。將突變的基因分子連接至ChimeriVaxTM-JE的全長(zhǎng)cDNA。體外轉(zhuǎn)錄DNA模板然后用RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分離活子代病毒的單個(gè)克隆并檢測(cè)M2e肽的存在、免疫原性和遺傳穩(wěn)定性。該實(shí)施例的進(jìn)一步細(xì)節(jié)描述于下文的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例部分。
在上述方法的變體中，誘變發(fā)生在全部的完整病毒基因組中(例如在質(zhì)粒中克隆的包含RNA的病毒的全長(zhǎng)cDNA或DNA病毒的完整基因組分子)或包含數(shù)個(gè)病毒基因的DNA片段中，然后回收活的插入突變體。在這些實(shí)施例中，該病毒不僅在特異目標(biāo)蛋白中“選擇”最適當(dāng)?shù)耐庠措牟迦胛稽c(diǎn)，它也選擇在完整基因組或基因組大片斷中編碼的最適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)蛋白。在另一變體中，其他載體生物體例如細(xì)菌(例如沙門氏菌等)的適當(dāng)基因也可相似進(jìn)行隨機(jī)插入誘變?nèi)缓蠛Y選可作為疫苗的該生物體的重組變異體。
在本文所述方法的另一變體中，依次或同時(shí)使用多于一個(gè)的轉(zhuǎn)座子誘變相同的基因以隨機(jī)插入多于一個(gè)的免疫原肽，然后篩選攜帶一種病原體(例如以增強(qiáng)免疫源性/保護(hù)性)或數(shù)種病原體(例如以產(chǎn)生重組疫苗)的不同外源抗原決定簇的活病毒克隆。該隨機(jī)插入法也可在病毒/載體生物體中與如上所述的其他表達(dá)平臺(tái)(例如，McAllister等，J.Virol.749197-205，2000；Bredenbeek等，Virology 345299-304，2006)組合以生成表達(dá)一種抗原或不同抗原的數(shù)種抗體的候選疫苗。此外，附加表達(dá)的蛋白質(zhì)可為免疫刺激分子，例如各種已知的細(xì)胞因子，其可刺激適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答分支增強(qiáng)重組疫苗的免疫源性/效率。此外，該方法可用于鑒定廣譜允許插入位點(diǎn)(例如NS1-236和prM的N端區(qū)域(例如，氨基酸1-5))。進(jìn)一步而言，所篩選的候選重組子本身可用作疫苗或與其他(例如，亞單位或滅活或其他活的)疫苗組合作為初始劑或增強(qiáng)劑(如果依次應(yīng)用不同的組分)或作為協(xié)同疫苗組分(如果同時(shí)接種不同的組分)。
本文所述方法值得注意的特點(diǎn)包括以下內(nèi)容(i)使用可裂解的抗生素抗性基因(與表位插入片段一起)輔助質(zhì)粒文庫(kù)的生成(圖2)；(ii)向全長(zhǎng)質(zhì)?？寺?病毒cDNA)中引入終止密碼子或移碼以最小化插入片段少的病毒出現(xiàn)的幾率(圖2)；(iii)用PmeI酶處理包含隨機(jī)插入片段的質(zhì)粒文庫(kù)以消除任何插入片段少的DNA模板或?qū)⑥D(zhuǎn)染細(xì)胞或用于轉(zhuǎn)染的RNA進(jìn)行梯度稀釋以最小化插入突變體與插入片段少的病毒(E蛋白表達(dá)部分)之間的競(jìng)爭(zhēng)；以及(iv)使用空斑純化與細(xì)胞單層免疫染色組合簡(jiǎn)便分離包含插入片段的病毒克隆。
病毒載體 可用于本發(fā)明的嵌合病毒可基于ChimeriVaxTM病毒，如上所述其由結(jié)構(gòu)蛋白被第二種病毒對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)蛋白取代的第一種黃病毒(例如，骨架黃病毒)組成。例如，嵌合體可由其中的prM和E蛋白被第二種黃病毒的prM和E蛋白取代的第一種黃病毒組成。
用于本發(fā)明的嵌合病毒可由任何病毒組合制備。可用于本發(fā)明作為第一和第二種病毒的具體黃病毒的實(shí)例包括蚊傳黃病毒，例如日本腦炎、登革熱(血清型1-4)、黃熱病、墨累谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、昆津、羅西奧腦炎和伊利烏斯腦炎病毒；蜱傳腦炎，例如中歐腦炎、西伯利亞腦炎、俄羅斯春夏型腦炎、基亞薩努森林病、鄂木斯克出血熱、跳躍病、波瓦生、根岸、阿布塞塔羅夫、漢薩洛瓦、阿泊依和海普病毒；以及肝炎病毒種的病毒(例如丙型肝炎病毒)。
可用于本發(fā)明嵌合病毒的具體實(shí)例為人黃熱病毒疫苗株YF17D，其中的prM和E蛋白被另一種病毒的prM和E蛋白取代，例如日本腦炎病毒、西尼羅病毒、圣路易病毒、墨累谷腦炎病毒、登革熱病毒或任何其他黃病毒，例如上文所列之一。例如以下批轉(zhuǎn)保存日期為1998年1月6日在布達(dá)佩斯條約下保存于美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的嵌合黃病毒可用于本發(fā)明嵌合黃熱病17D/日本腦炎SA14-14-2病毒(YF/JE A1.3；ATCC登錄號(hào)ATCCVR-2594)和嵌合黃熱病17D/登革熱2型病毒(YF/DEN-2；ATCC登錄號(hào)ATCC VR-2593)。
例如美國(guó)專利第6962708和6696281號(hào)；國(guó)際申請(qǐng)WO 98/37911和WO 01/39802；以及Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999中提供了制備可用于本發(fā)明的嵌合病毒的細(xì)節(jié)，其完整內(nèi)容均以參考形式并于本文。此外，這些嵌合病毒可包括減毒突變，例如上文和本文所引用的參考文獻(xiàn)(也可參見(jiàn)例如WO 2003/103571；WO 2005/082020；WO 2004/045529；WO 2006/044857；WO 2006/116182)中所描述者。例如在美國(guó)專利號(hào)6962708中提供了可用于制備本發(fā)明病毒的病毒序列信息(也可參見(jiàn)，Genbank登錄號(hào)NP_041726；CAA27332；AAK11279；P17763；注這些序列僅為示例性；本領(lǐng)域已知許多其他黃病毒序列并可用于本發(fā)明)。附加實(shí)例包括Genbank登錄號(hào)NC_002031，其以序列附錄3(YF17D)提供于本文，Genbank登錄號(hào)AF315119，其以序列附錄4(JE-SA-14-14-2)提供于本文，以及Genbank登錄號(hào)AF196835，其以序列附錄5(西尼羅病毒)提供于本文。這些序列信息僅為示例性，有許多可用于本發(fā)明的其他黃病毒序列。此外，這些序列可包括本文(以及所引用文獻(xiàn))所述的突變，包含于如本文(和所引用的文獻(xiàn))所述的嵌合體中和/或包括本文所述的插入片段。
在使用ChimeriVaxTM疫苗作為載體的優(yōu)點(diǎn)中，一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是包膜蛋白(其為抗黃病毒免疫的主要抗原決定簇，在這種情況下為抗載體免疫)易于交換，使得可使用相同的YF17D骨架(其可依次應(yīng)用至相同的個(gè)體)構(gòu)建數(shù)種不同的疫苗。此外，不同的重組ChimeriVax TM插入疫苗可測(cè)定為更適用于不同黃病毒流行的具體地理區(qū)域，作為抗地方流行黃病毒和另一種目標(biāo)病原體的雙重疫苗。例如，ChimeriVaxTM-JE-流感病毒更適用于JE流行的亞洲以保護(hù)免受JE和流感的攻擊，YF17D流感疫苗更適用于YE流行的非洲和南美，ChimeriVaxTM-WN-流感更適用于WN流行的美國(guó)和部分歐洲和中東，ChimeriVaxTM-登革熱-流感更適用于存在登革熱病毒的熱帶。
除了嵌合黃病毒，其他黃病毒例如非嵌合黃病毒可用于根據(jù)本發(fā)明的載體?？捎糜诒景l(fā)明的這些病毒的實(shí)例包括減毒活疫苗，例如YF17D和衍生自YF17D株者，其本來(lái)由減毒野生型Asibi株獲得(Smithburn等，“Yellow Fever Vaccination，”World Health Organization，第238頁(yè)，1956；Freestone，in Plotkin等(編輯)，Vaccines，第二版，W.B.Saunders，Philadelphia，U.S.A.，1995)。可衍生可用于本發(fā)明的病毒的YF17D株的實(shí)例為YF17D-204(

Sanofi-Pasteur，Swiftwater，PA，USA；

，Sanofi-Pasteur，Marcy-L’Etoile，F(xiàn)rance；ARILVAXTM，Chiron，Speke，Liverpool，UK；

，BernaBiotech，Bern，Switzerland；YF17D-204 France(X15067，X15062)；YF17D-204，234 US(Ric等，Science 229726-733，1985))，而可使用的這些病毒株的其他實(shí)例為緊密相關(guān)的YF17DD株(GenBank登錄號(hào)U17066)、YF17D-213(GenBank登錄號(hào)U17067)以及Galler等，Vaccines16(9/10)1024-1028，1998描述的黃病毒17DD株。除了這些病毒株外，在人類例如人類患者中任何其他適當(dāng)減毒的黃病毒疫苗株均可用于本發(fā)明。
除了嵌合黃病毒和完整黃病毒例如黃熱病毒(例如YE17D疫苗)之外，本發(fā)明方法也可與其他非黃熱病毒、減毒或疫苗病毒(RNA和包含DNA的病毒)一起使用。這些疫苗病毒的實(shí)例包括用于麻疹、風(fēng)疹、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎(VEE)、單股反鏈病毒目(彈狀病毒、副流感病毒等)和DNA病毒的減活株(例如，痘苗病毒、水痘病毒等)。
此外，除了上述活病毒之外，在復(fù)制子骨架蛋白(例如，NS1和其他NS蛋白以及C)中表達(dá)外源肽的已包裝復(fù)制子可用于本發(fā)明。該方法可用于例如需要增強(qiáng)安全性或最小化抗載體免疫(中和抗包膜蛋白的抗體應(yīng)答)的情況中以使用相同的載體制備可應(yīng)用至相同個(gè)體的不同疫苗或在相同復(fù)制子構(gòu)建體中表達(dá)數(shù)種抗原。該構(gòu)建體的圖解見(jiàn)圖10。已建立了構(gòu)建單周期復(fù)制子的技術(shù)，也已驗(yàn)證了復(fù)制子的免疫原潛質(zhì)(Jones等，Virology 331247-259，2005；Molenkamp等，J.Virol.771644-1648，2003；Westaway等，Adv.Virus.Res.5999-140，2003)。在這些復(fù)制子的實(shí)例中，缺失了絕大多數(shù)的prM和E包膜蛋白基因。因此，其可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但是不能產(chǎn)生病毒子代(因此為單周期復(fù)制)。當(dāng)反式提供prM-E基因時(shí)其可被包裝入病毒顆粒中。而且，當(dāng)細(xì)胞被這些包裝的復(fù)制子(例如，接種之后)感染時(shí)，之后進(jìn)行單周期復(fù)制，不會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)散至周圍細(xì)胞/組織。此外，隨機(jī)插入的免疫源肽可在PIVs(例如，Mason等，Virology 351432-443，2006)背景下與其他抗原和任何其他缺陷病毒疫苗構(gòu)建體、完整載體病毒、重排病毒(例如，Orlinger等，J.Virol.8012197-12208，2006)通過(guò)基因間、雙順?lè)醋颖磉_(dá)附加抗原替代PIV缺失等方式組合。
來(lái)自不同病原體的保護(hù)性表位可在一種病毒中組合得到三價(jià)、四價(jià)疫苗等。而且，可使用包含來(lái)自非地方流行性黃病毒包膜的ChimeriVaxTM變異體避免否則會(huì)限制接種在某一地理區(qū)域的有效性的群體中的天然抗載體免疫(例如ChimeriVaxTM-JE載體可用于不存在JE的美國(guó))。
進(jìn)一步而言，本發(fā)明包括病毒，例如黃病毒(例如黃熱病毒如YF17D和嵌合黃病毒，如本文所述者)，其在選自C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的蛋白中包括一個(gè)或多個(gè)如本文所述的異源肽插入片段，不論是否采用本發(fā)明所述方法制備。本文試驗(yàn)實(shí)施例中描述的用于向prM、E和NS1中插入的方法精確地指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員如何誘變其他黃病毒蛋白(C和NS2A-NS5)以及其他載體病毒、細(xì)菌等的蛋白。由于C和NS2A-NS5黃病毒蛋白主要在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(除了C，它也是病毒顆粒的一部分)，這些蛋白最適用于插入T細(xì)胞外源免疫原表位；但是也可插入B細(xì)胞表位，因?yàn)橐恍┛贵w應(yīng)答在體內(nèi)抗絕大多數(shù)(如果不是所有的)胞內(nèi)病毒蛋白生成。
異源肽 本發(fā)明的病毒載體可用于傳遞任何具有預(yù)防或治療價(jià)值的肽或蛋白。例如，本發(fā)明的載體可用于誘導(dǎo)對(duì)任何插入病毒蛋白(例如黃病毒的包膜、膜前、衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白)中基于蛋白質(zhì)的抗原的免疫應(yīng)答(預(yù)防或治療)。
本發(fā)明的載體可各自包含單一表位。或者，可向載體中的單一位點(diǎn)(例如，以多表位的形式，其中可通過(guò)柔性接頭分離不同的表位，例如氨基酸的聚甘氨酸延伸)、不同位點(diǎn)或其任意組合插入多個(gè)表位。這些不同表位可衍生自單一病原體屬或衍生自不同屬和/或不同種。該載體可包括多個(gè)肽，例如如本文所列肽的多個(gè)拷貝或如本文所列肽的組合。作為實(shí)例，該載體可包括人或禽M2e肽(和/或其保守序列) 可用于本發(fā)明的抗原可衍生自例如感染因子如病毒、細(xì)菌和寄生蟲。該感染因子的具體實(shí)例為流感病毒。來(lái)自流感病毒的抗原的具體實(shí)例包括衍生自血凝素(HA；例如H1-H6之一或其亞單位)(或亞單位HA1和HA2)、神經(jīng)氨酸酶(NA；例如N1-N9之一)、M2、M1、核蛋白(NP)和B蛋白。例如，可使用包括血凝素前體蛋白裂解位點(diǎn)(HA0)的肽(A/H1株的NIPSIQSRGLFGAIAGFIE，A/H3株的NVPEKQTRGIFGAIAGFIE以及流感B株的PAKLLKERGFFGAIAGFLE)或M2e(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD)。流感病毒中保守的肽的其他實(shí)例可用于本發(fā)明并包括流感病毒B保守的NBe肽(共有序列MNNATFNYTNVNPISHIRGS)；流感病毒B的BM2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(共有序列MLEPFQ)以及來(lái)自HAN1禽流感病毒的M2e肽(MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD)?？捎糜诒景l(fā)明的流感肽的其他實(shí)例以及可衍生(例如經(jīng)片段化)該類肽的蛋白質(zhì)描述于US2002/0165176、US 2003/0175290、US 2004/0055024、US 2004/0116664、US 2004/0219170、US 2004/0223976、US 2005/0042229、US2005/0003349、US 2005/0009008、US 2005/0186621、美國(guó)專利第4752473號(hào)、美國(guó)專利第5374717號(hào)、美國(guó)專利第6169175號(hào)、美國(guó)專利第6720409號(hào)、美國(guó)專利第6750325號(hào)、美國(guó)專利第6872395號(hào)、WO 93/15763、WO 94/06468、WO 94/17826、WO96/10631、WO99/07839、WO 99/58658、WO 02/14478、WO 2003/102165、WO2004/053091、WO 2005/055957，以及本文包含的序列附錄1和2(以及本文引用的參考文獻(xiàn))，其內(nèi)容均以參考形式并于本文。而且，可從www.immuneepitope.org數(shù)據(jù)庫(kù)選擇流感的保守免疫/保護(hù)性T和B細(xì)胞表位，其中已鑒定出許多可交叉保護(hù)的候選表位(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 104246-251，2007和補(bǔ)充表格)，包括我們?cè)谙挛闹忻枋龅腍3N3病毒的HA表位。本發(fā)明可應(yīng)用來(lái)自在線IEDB來(lái)源的任何肽，例如，包括上文中Bui等描述的保守B和T細(xì)胞表位的流感病毒表位。
來(lái)自人/獸病原體例如寄生蟲(例如瘧疾)、其他病原體病毒(例如人乳頭瘤病毒(HPV))的表位、單純皰疹病毒(HSV)，人免疫缺陷病毒(HIV，例如gag)和丙型肝炎病毒(HCV)和細(xì)菌(例如結(jié)核分枝桿菌、艱難梭菌和幽門螺桿菌)的表位也可用于本發(fā)明載體。可從文獻(xiàn)中輕易發(fā)現(xiàn)這些和其他病原體的各種適當(dāng)表位。例如Schiller和其同事鑒定出乳突瘤病毒L2蛋白的交叉保護(hù)性表位/肽，其可誘導(dǎo)可保護(hù)不同HPV表型攻擊的廣譜交叉中和抗體，例如HPV16病毒(WO2006/083984 A1；QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV)的例如L2蛋白的氨基酸1-88，或氨基酸1-200，或氨基酸17-36。WO 2004/053091、WO03/102165、WO 02/14478和US 2003/0185854提供了可用于本發(fā)明的其他病原體以及來(lái)自這些病原體的抗原和表位的實(shí)例，其內(nèi)容以參考形式并于本文。
可獲得抗原的病原體的附加實(shí)例列于下文表1，該類抗原的具體實(shí)例包括列于表2者。此外，可插入本發(fā)明載體的表位的具體實(shí)例提供于表3。如表3所示，用于本發(fā)明載體的表位可為B細(xì)胞表位(例如，中和表位)或T細(xì)胞表位(即T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性表位)。
本發(fā)明載體可用于傳遞除病原體衍生抗原之外的抗原。例如，該類載體可用于傳遞腫瘤相關(guān)抗原用于癌癥的免疫療法。本領(lǐng)域已知多種腫瘤相關(guān)抗原并可根據(jù)本發(fā)明給予。癌癥(以及對(duì)應(yīng)的腫瘤相關(guān)抗原)的實(shí)例為黑色素瘤(NY-ESO-1蛋白(尤其是位于氨基酸157-165位的CTL表位)、CAMEL、MART 1、gp100、酪氨酸相關(guān)蛋白TRP1和2以及MUC1)；腺癌(ErbB2蛋白)；結(jié)直腸癌(17-1A、791Tgp72和癌胚抗原)；前列腺癌(PSA1和PSA3)。熱休克蛋白(hsp110)也可用作抗原。
在本發(fā)明的其他實(shí)例中，可使用編碼預(yù)期對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過(guò)敏誘導(dǎo)抗原表位的外源蛋白。此外，本發(fā)明載體可包括用于靶向載體以傳遞肽例如抗原至給予該載體的受試者的細(xì)胞(例如，包括配體受體的細(xì)胞)的配體。
插入本發(fā)明載體的肽或蛋白的大小可為3-1000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，例如5-500、10-100、20-55、25-45或35-40個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，如本領(lǐng)域技術(shù)人員確定認(rèn)為適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度。如本文其他部分所述，本文描述的氨基端前膜插入片段可提供插入更長(zhǎng)片段的可能性(見(jiàn)下文)。進(jìn)一步而言，本文描述的肽可包括附加序列或可降低長(zhǎng)度，也可如本領(lǐng)域技術(shù)人員確定認(rèn)為適當(dāng)者。本文列出的肽可如本文所示存在于本發(fā)明載體中或通過(guò)例如替換或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸)進(jìn)行修飾。此外，該肽可為更大的肽存在于載體中。
本發(fā)明也包括鑒定和使用可插入多個(gè)不同肽的廣譜允許插入位點(diǎn)，例如NS1-236，如兩個(gè)不同嵌合體(見(jiàn)下文)的情況下所示。其他廣譜允許位點(diǎn)包括嵌合病毒(包括ChimeriVaxTM-JE和ChimeriVaxTM-WN(見(jiàn)下文))的prM氨基端區(qū)域?？稍谶@些病毒的1-50位，例如1-25、1-15、1-10或1-5的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行插入。
進(jìn)一步，本發(fā)明包括鑒別和使用從細(xì)胞(例如，Vero)培養(yǎng)獲得的第二位點(diǎn)適應(yīng)。這些適應(yīng)可提供益處，例如增強(qiáng)復(fù)制等?？捎糜谄渌闆r下的這些適應(yīng)的具體實(shí)例如下文實(shí)驗(yàn)實(shí)施例所示。
生產(chǎn)和給藥 可使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法制備上述病毒。例如，可將對(duì)應(yīng)于病毒基因組的RNA分子引入可從中(或其上清中)純化子代病毒的原代細(xì)胞、雞胚胎或二倍體細(xì)胞?？缮a(chǎn)該類病毒的其他方法應(yīng)用異倍體細(xì)胞，例如Vero細(xì)胞(Yasumura等，Nihon Rinsho 211201-1215，1963)在該類方法的實(shí)例中，可將對(duì)應(yīng)于病毒基因組的核酸分子(例如，RNA分子)引入異倍體細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中收獲病毒，用核酸酶(例如可降解DNA和RNA二者的內(nèi)切核酸酶，例如，BenzonaseTM；美國(guó)專利第5173418號(hào))處理收獲的病毒，濃縮(例如，通過(guò)使用可截留例如500kDa分子的濾器進(jìn)行超濾)經(jīng)核酸酶處理的病毒，然后將已濃縮的病毒配置成疫苗。這一方法的細(xì)節(jié)提供于WO 03/060088 A2，其以參考形式并于本文。進(jìn)一步而言，當(dāng)提及嵌合病毒構(gòu)建體的構(gòu)建時(shí)上述引用的文獻(xiàn)提供了生產(chǎn)嵌合病毒的方法。
以本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便確定的量和方法給予本發(fā)明載體。就嵌合黃病毒和黃熱病毒為基礎(chǔ)的載體而言，該類載體可以與黃熱病17D疫苗相同的方式給予和配置，例如以被感染雞胚組織的澄清混懸液或從嵌合黃熱病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)收獲的流體。本發(fā)明載體可因此配置成包含100至1000000感染單位(例如，空斑形成單位或組織培養(yǎng)感染劑量)的無(wú)菌含水溶液以例如腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或皮內(nèi)途徑給藥(關(guān)于皮內(nèi)接種方法的細(xì)節(jié)參見(jiàn)，例如，WO 2004/0120964)。此外，由于黃病毒可通過(guò)粘膜途徑感染人類宿主，例如口腔途徑(Gresikova等，“Tick-borne Encephalitis，”The Arboviruses，Ecology andEpidemiology，Monath(ed.)，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1988，Volume IV，177-203)，所以可通過(guò)粘膜途徑給予這些載體。
當(dāng)用于免疫方法時(shí)，該載體可作為可被具體病原體感染的成人和兒童的初免預(yù)防劑。該載體也可用作通過(guò)刺激抗衍生該肽抗原的病毒的免疫應(yīng)答治療患者的加強(qiáng)劑。例如，表達(dá)E6/E7蛋白的表位或完整E6/E7蛋白或HPV的重組子可用作治療性HPV疫苗。
對(duì)于應(yīng)用疫苗而言，任選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的佐劑。佐劑可用于增強(qiáng)嵌合載體的免疫原性例如脂質(zhì)體制劑、合成佐劑，例如(如QS21)、胞壁酰二肽、單磷酸類脂A或聚磷嗪。雖然這些佐劑通常用于增強(qiáng)對(duì)滅活疫苗的免疫應(yīng)答，它們也可用于活疫苗。就粘膜途徑例如經(jīng)口腔給藥的嵌合載體而言，粘膜佐劑例如大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素(LT)或LT的突變衍生物可用作佐劑。此外，可將編碼具有佐劑活性的細(xì)胞因子的基因插入載體中。因此，編碼細(xì)胞因子例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因可與外源抗原基因一起插入以生產(chǎn)可得到免疫應(yīng)答增強(qiáng)的疫苗或調(diào)節(jié)更特異于細(xì)胞、體液或粘膜應(yīng)答的免疫?；蛘?，可通過(guò)已知方法(例如直接接種、裸DNA、用病毒載體等)分別從重組疫苗病毒同時(shí)或依次給予細(xì)胞因子。
本發(fā)明病毒可與其他免疫方法組合使用。例如可將病毒與包括相同或不同抗抗原的亞單位疫苗組合給予。本發(fā)明的組合方法可包括同時(shí)給予本發(fā)明病毒和其他形式的抗原(例如，亞單位形式或包括肝炎核心蛋白(例如包含在大腸桿菌產(chǎn)生的表面上的M2e肽的肝炎核心蛋白(HBc-M2e；Fiers等，Virus Res.103173-176，2004))的給藥裝置)?；蛘?，本發(fā)明載體可與其他方法(例如亞單位或HBc方法)在初免-加強(qiáng)策略中組合使用，其中本發(fā)明載體或其他方法均可用作初免，然后使用另一種方法作為加強(qiáng)或相反。進(jìn)一步，本發(fā)明包括使用本發(fā)明載體作為初免和加強(qiáng)二者的初免-加強(qiáng)策略。
除了疫苗應(yīng)用外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，本發(fā)明載體可用于向患者細(xì)胞中引入治療性基因產(chǎn)品的基因治療方法以及癌癥療法。進(jìn)一步而言，包含免疫原表位的重組病毒例如本文所述嵌合或完整黃病毒可用于初免/加強(qiáng)方案中以增強(qiáng)亞單位或完整生物體死疫苗的藥效，與重組α病毒復(fù)制子相似(US 2005/0208020 A1)。而且，下文中我們的一些數(shù)據(jù)也證明當(dāng)將二者混合并同時(shí)接種時(shí)包含外源肽(例如，ChimeriVax-JE/NS1-M2e)的黃病毒和亞單位疫苗(例如HBc-M2e)之間存在強(qiáng)效的協(xié)同作用。后者可得到新的有效組合疫苗制劑，其不需要佐劑并可提供新的期望特點(diǎn)，例如免疫應(yīng)答中的Th1移動(dòng)(shift)。此外，可如本文所述在病毒顆粒表面(在prM-E)表達(dá)外源表位，然而不是使用重組病毒作為活疫苗，可例如使用福爾馬林將其滅活并用作死疫苗。如果載體病毒為野生型病毒(其可對(duì)人/動(dòng)物具有免疫原性)時(shí)該方法尤其適用。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例 以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例顯示了向ChimeriVaxTM-JE中插入M2e序列以及HA表位。也將序列插入ChimeriVaxTM-WN構(gòu)建體。這一實(shí)施例中描述的方法也可用于其他病毒，例如嵌合黃病毒和基于病毒的載體(例如，復(fù)制子和PIVs)以及上文所述的其他載體生物體以將序列插入其他蛋白質(zhì)以及插入其他肽。
過(guò)去60年中黃熱病17D(YF17D)減毒活疫苗株一直應(yīng)用于人類，具有非常好的安全記錄并可在單劑量給藥后提供長(zhǎng)期免疫。如上文所述，ChimeriVaxTM-JE為減毒活重組疫苗株，其中編碼YF17D的某些結(jié)構(gòu)蛋白(PrME)的基因被來(lái)自基因減毒日本腦炎(JE)病毒SA14-14-2的對(duì)應(yīng)基因替代。與該嵌合體的胞內(nèi)復(fù)制相關(guān)的衣殼和所有非結(jié)構(gòu)(NS)基因衍生自YF17D疫苗株。相似地，ChimeriVaxTM-WN為減毒活重組疫苗株，其中編碼YF17D的PrM和E蛋白的基因被西尼羅病毒株的對(duì)應(yīng)基因替代。這一嵌合體的實(shí)例應(yīng)用了西尼羅病毒株NY99-flamingo 382-99(GenBank登錄號(hào)AF196835)的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本文中稱作ChimeriVaxTM-WN02，NY99-flamingo382-99包膜序列107位的賴氨酸被苯丙氨酸取代，316位的丙氨酸被纈氨酸取代，440位的賴氨酸被精氨酸取代。
本部分描述圖2顯示的質(zhì)粒構(gòu)建步驟。構(gòu)建以pBeloBac11低拷貝數(shù)載體為基礎(chǔ)從包含ChimeriVaxTM-JE病毒的完整cDNA的pBSA單質(zhì)粒構(gòu)建體開(kāi)始。通過(guò)將YFM5’3’SA14-14-2的ChimeriVaxTM-JE-特異cDNA部分(與SP6啟動(dòng)子一起)和YF5.2SA14-14-2質(zhì)粒(ChimeriVaxTM-JE的兩個(gè)起始質(zhì)粒)裝配在一個(gè)低拷貝數(shù)載體pBeloBac11(New England Biolabs，Beverly，MA)中構(gòu)建該載體。該載體包含數(shù)個(gè)獨(dú)特的適于基因亞克隆(圖2中右上角質(zhì)粒圖中病毒基因組上面所顯示)的限制性酶切位點(diǎn)。通過(guò)沉默位點(diǎn)定向突變(圖2中的步驟1-3)將用于亞克隆prM、E和NS1基因的附加限制性酶切位點(diǎn)SphI、NsiI和EagI引入pBSA質(zhì)粒。
向PUC18質(zhì)粒載體(步驟6)中引入三個(gè)目標(biāo)基因并使用Tn7轉(zhuǎn)座子(步驟7)將所得質(zhì)粒隨機(jī)突變。使已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在氯霉素存在下生長(zhǎng)(氯霉素抗性基因由轉(zhuǎn)座子的可移除轉(zhuǎn)移引物編碼)，制備由大量的細(xì)菌菌落代表的三個(gè)突變質(zhì)粒文庫(kù)。在制備突變質(zhì)粒文庫(kù)時(shí)，各文庫(kù)菌落的數(shù)量應(yīng)至少高于突變DNA序列中核苷酸數(shù)量的三倍以確保在每一個(gè)目標(biāo)基因的核苷酸之后接著摻入了相關(guān)的外源插入片段(編碼肽例如M2e)。各文庫(kù)的菌落數(shù)量顯示于圖2。突變的prM、E和NS1基因文庫(kù)被亞克隆至pUC18載體(步驟8)，通過(guò)PI消化和重新連接去除轉(zhuǎn)移引物(步驟9)，每個(gè)基因分子中只剩下包含特異PmeI位點(diǎn)的15核苷酸的隨機(jī)插入片段。為了輔助M2e的插入，首先裝配包含M2e和卡那霉素抗性基因的SmaI-SmaI盒(步驟4-5)。通過(guò)在基因工程側(cè)接BstBI位點(diǎn)處消化移除Kanr基因。從第九步開(kāi)始將該盒插入文庫(kù)的PmeI位點(diǎn)，使細(xì)菌在卡那霉素存在下生長(zhǎng)篩選包含M2e的文庫(kù)(步驟12)。用于該構(gòu)建中的天然人流感AM2e共有序列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD被修飾為兩個(gè)半胱氨酸殘基替換成絲氨酸以避免不需要的S-S橋連，其不會(huì)影響該肽的抗原性/免疫原性，并且在兩邊均添加甘氨酸殘基以增加柔性(GGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGG)。通過(guò)用BstBI消化從所得包含隨機(jī)M2e的基因文庫(kù)中移除卡那霉素抗性基因(步驟13)。
在一個(gè)方法中(圖2的方法A)，為了用隨機(jī)插入病毒prM、E和NS1基因的M2e生產(chǎn)ChimeriVaxTM-JE-flu模板cDNA文庫(kù)，將步驟9的突變基因文庫(kù)(包含隨機(jī)PmeI位點(diǎn))克隆至步驟1-3的經(jīng)修飾的pBSA質(zhì)粒。然而，當(dāng)我們第一次試圖將M2e/Kanr盒插入步驟10的pBSA-AR3-rPmeI文庫(kù)時(shí)所得在卡那霉素存在下生長(zhǎng)的pBSA-AR3-rM2e/Kan文庫(kù)的細(xì)菌菌落的數(shù)量比較低(步驟11)。盡管如此，這一方法允許快速構(gòu)建包含任何免疫原表位的文庫(kù)(例如，來(lái)自瘧疾寄生蟲、TB、病毒病原體等)。
在另一個(gè)方法中(方法B)，首先將終止密碼子/移碼突變修飾引入亞克隆的prM、E和NS1基因(步驟14)，將該包含病毒致死突變的經(jīng)修飾基因引入pBSA-AR1-3質(zhì)粒(步驟15)。這樣可消除由于終ChimeriVaxTM-JE-flu模板文庫(kù)中包含非突變模板部分的存在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后未突變ChimeriVaxTM-JE出現(xiàn)的可能性。最后，通過(guò)將步驟15文庫(kù)中的目標(biāo)基因片段替換成步驟13中包含隨機(jī)M2e插入片段者獲得ChimeriVaxTM-JE-flu病毒的全長(zhǎng)模板文庫(kù)(步驟16)。
為了用插入NS1的共有M2e序列生產(chǎn)ChimeriVaxTM-JE-flu病毒，用XhoI(位于病毒cDNA末端的XhoI位點(diǎn))將pBSA-AR3-rM2e質(zhì)粒文庫(kù)線性化并用SP6RNA聚合酶(SP6啟動(dòng)子位于病毒cDNA的上游)體外轉(zhuǎn)錄，然后轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后3-6天當(dāng)細(xì)胞病變作用可檢測(cè)或明顯時(shí)收獲病毒子代。通過(guò)空斑測(cè)定法(甲基纖維素覆蓋)測(cè)定所收獲樣品的病毒滴度，其中使用小鼠超免疫抗JE腹水(ATCC)染色甲醇固定單分子層以檢測(cè)所有空斑，或可使用商業(yè)購(gòu)買的抗流感M2e表位的單克隆抗體(Mab)14C2僅檢測(cè)表達(dá)由Mab識(shí)別的M2e肽的空斑?？傮w滴度超過(guò)7 log10 pfu/ml。M2e陽(yáng)性空斑易于檢測(cè)并達(dá)到總空斑的0.4％(圖3A和3B)。一些M2e陽(yáng)性空斑與M2e陰性空斑一樣大，表明有效的病毒復(fù)制。大多數(shù)總空斑為M2e陰性，這是由于NS1一些隨機(jī)位點(diǎn)的插入片段不穩(wěn)定，使得轉(zhuǎn)染之后立即出現(xiàn)未突變ChimeriVaxTM-JE病毒?；蛘?，存在該插入片段但是無(wú)法接近抗體。
可使用數(shù)種技術(shù)分離單個(gè)的陽(yáng)性病毒克隆。我們將MAb染色(免疫聚焦測(cè)定法)與空斑純化組合。在這一測(cè)定法中，用梯度稀釋病毒轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞被瓊脂覆蓋。第5天時(shí)去除瓊脂糖并用甲醇固定細(xì)胞單層(例如，在培養(yǎng)皿中，圖3C)并用MAb染色。將瓊脂糖與培養(yǎng)皿排列并回收對(duì)應(yīng)于陽(yáng)性M2e空斑的凝膠部分并冷凍?；蛘哂肕ab染色細(xì)胞單層但是不用甲醇固定。小心地從塑料上刮下陽(yáng)性空斑中的細(xì)胞并冷凍。使用這一步驟分離了大約80個(gè)候選病毒克隆并通過(guò)1-2輪的空斑純化進(jìn)一步純化。我們使用的另一種方法將病毒終稀釋、收獲細(xì)胞上清和在96孔板中用MAb染色細(xì)胞單層以鑒定最高可能稀釋(最好由單個(gè)陽(yáng)性病毒顆粒感染)的陽(yáng)性孔組合。這一方法得到37個(gè)候選克隆。進(jìn)一步的分析表明這些之一表現(xiàn)為純克隆，而其它仍然與M2e陰性病毒混合。
接下來(lái)可檢測(cè)足夠大數(shù)量的M2e陽(yáng)性克隆(例如，50-100)的免疫原性和對(duì)小鼠(和/或白鼬)中對(duì)野生型流感病毒攻擊的保護(hù)效率(包括長(zhǎng)期保護(hù))，使用可獲得的動(dòng)物模型和方法以測(cè)量小鼠血清中的抗M2e抗體滴度(例如，使用ELISA(應(yīng)用合成M2e肽)測(cè)量IgG/IgM或同型IgG1/IgG2抗體)以及在體外ADCC檢測(cè)中的活性(或體內(nèi))，然后進(jìn)行免疫聚焦檢測(cè)和/或測(cè)序。
在進(jìn)一步的研發(fā)中，在從轉(zhuǎn)染后收獲病毒進(jìn)行的最后3-4次空斑純化步驟之后通過(guò)在Vero細(xì)胞中的兩次擴(kuò)增傳代生產(chǎn)13個(gè)克隆的病毒儲(chǔ)備。這些經(jīng)擴(kuò)增的樣品命名為P2研究病毒儲(chǔ)備(純化后的傳代2)。儲(chǔ)備的滴度測(cè)定為2.6×106-1.0×107pfu/mL。重要的是用M2eMAB和JEHIAF染色產(chǎn)生幾乎相同的滴度(圖4)，表明病毒儲(chǔ)備是純的。此外，這一結(jié)構(gòu)是重組病毒遺傳穩(wěn)定性的第一個(gè)證據(jù)。如果病毒不純或不穩(wěn)定的話，未突變ChimeriVaxTM-JE病毒將生長(zhǎng)超過(guò)表達(dá)M2e的重組子，而這不是現(xiàn)有的情況。此外，用甲醇固定細(xì)胞(檢測(cè)胞內(nèi)和表面蛋白)和不用甲醇固定(僅檢測(cè)表面蛋白)均觀察到病毒空斑的有效M2e染色。因此，包含M2e肽的NS1蛋白如預(yù)期正常轉(zhuǎn)運(yùn)至已感染細(xì)胞的表面并很可能被分泌。NS1因此可有效表面/胞外遞呈肽，其對(duì)于誘導(dǎo)體內(nèi)強(qiáng)效的抗M2e抗體應(yīng)答是非常必要的。
對(duì)13個(gè)克隆(圖4中的A11-92)的NS1基因進(jìn)行測(cè)序以測(cè)定它們M2e插入片段的位點(diǎn)。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)該35氨基酸插入片段位于所有13個(gè)克隆中相同的位點(diǎn)，在NS1蛋白的C端一半，在ChimeriVaxTM-JE病毒基因組的核苷酸3190之后，在病毒NS1氨基酸殘基236和237之間。該插入片段的確切序列和周圍的NS1核苷酸和氨基酸殘基顯示于圖5。
對(duì)于該插入片段在所有13個(gè)克隆中的位點(diǎn)相同最可能的解釋為當(dāng)觀察到CPE時(shí)這些克隆為來(lái)自感染Vero細(xì)胞6天后收獲的病毒分離的空斑。不同起始變異體(在不同位點(diǎn)含有插入片段)之間的競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生在收獲前的病毒復(fù)制過(guò)程中，在病毒群體中一種變異體變得占優(yōu)勢(shì)。因此，13個(gè)篩選的克隆表示一種插入變異體。
為了解決變異體之間競(jìng)爭(zhēng)這一問(wèn)題，可通過(guò)轉(zhuǎn)染之后立即進(jìn)行空斑篩選制備其他克隆(例如，如果必要的話尋找更多的免疫原候選疫苗)。在后一方法中，用體內(nèi)合成的RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞并立即用瓊脂覆蓋，然后用M2e抗體染色細(xì)胞并從瓊脂中收獲陽(yáng)性克隆。我們用RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行轉(zhuǎn)染進(jìn)行這一嘗試，其或由體內(nèi)轉(zhuǎn)錄pBSA-AR3質(zhì)粒文庫(kù)(圖2)或體內(nèi)將來(lái)自質(zhì)粒pUC-AR03-rM2e(其比pBSA-AR3文庫(kù)更具有代表性)的NS1-M2e基因文庫(kù)連接至pBSA-AR3-終止載體中產(chǎn)生(圖2)。第4-5天去除瓊脂覆蓋，用M2eMAb染色細(xì)胞單層。觀察到不同大小的多個(gè)陽(yáng)性病毒聚集點(diǎn)。用體內(nèi)DNA連接步驟獲得的RNA轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞的染色培養(yǎng)皿的實(shí)例如圖11所示。收集對(duì)應(yīng)于數(shù)個(gè)更大的陽(yáng)性空斑的瓊脂糖部分并通過(guò)附加周期的空斑純化進(jìn)一步純化。有趣的是，當(dāng)測(cè)序新的變異體時(shí)，它們與A25病毒具有相同的M2e插入。這鑒定出NS1-236為NS1蛋白中的高度允許位點(diǎn)，其可產(chǎn)生高度有效的復(fù)制插入突變體，產(chǎn)生最大的空斑。然而，由圖11中不同大小的聚集點(diǎn)判斷，很明顯該M2e插入片段間插(intercalate)在NS1的不同位點(diǎn)。一些形成中間體或小空斑的低效復(fù)制變異體具有實(shí)用價(jià)值。
我們也使用位于A25克隆(圖5)M2e插入片段末端的BstBI限制性酶切位點(diǎn)在該NS1位點(diǎn)添加第二個(gè)流感保護(hù)性表位。例如，我們摻入了來(lái)自H5N1禽流感的被兩個(gè)甘氨酸接頭側(cè)接的M2e表位以增加柔性(如圖13A圖解)并獲得了活病毒。因此，后一插入突變體包含串聯(lián)人流感M2e，其后為禽流感M2e。這一病毒可為通用疫苗，其可保護(hù)群體免受人流感A株和禽流感的攻擊。在這一構(gòu)建體中，首先將來(lái)自A25病毒的含有人M2e插入片段的NS1基因經(jīng)反向遺傳學(xué)的方法克隆至ChimeriVax-JE感染克隆中。然后通過(guò)在BstBI位點(diǎn)克隆一個(gè)由兩個(gè)退火的磷酸寡核苷酸組成的雙鏈DNA片段添加禽M2e序列。構(gòu)建了兩個(gè)版本的M2e人/M2e禽，一個(gè)具有H5N1流感病毒的天然M2e序列(除了倒數(shù)第二個(gè)半胱氨酸替換成絲氨酸；序列顯示于圖13B的上組)，另一個(gè)中的天然H5N1密碼子被簡(jiǎn)并密碼子取代以最小化與上游人M2e序列的核苷酸序列相似性(序列顯示于圖13B的下組)。后者是為了降低重組病毒中人M2e和禽M2e同源重組的幾率，其應(yīng)得到更高的病毒遺傳穩(wěn)定性。用JE和M2e特異性抗體(圖13)對(duì)所構(gòu)建病毒的空斑進(jìn)行染色。空斑大小與A25母體病毒相比有所減小。轉(zhuǎn)染后立即收獲的P1病毒滴度較高(～5log10 pfu/ml)。雖然未在Vero細(xì)胞中進(jìn)一步傳代病毒，可預(yù)計(jì)P2和后續(xù)傳代的滴度更高，因?yàn)榕cP1相比P2 ChimeriVax構(gòu)建體的滴度通常更高。這一實(shí)驗(yàn)明顯表明可將更長(zhǎng)的插入片段(就56個(gè)氨基酸長(zhǎng)度以及來(lái)自轉(zhuǎn)座子的少數(shù)附加殘基而言)摻入使用較短插入片段(A25病毒的35氨基酸M2e表位)鑒定的插入位點(diǎn)。另一個(gè)重要的結(jié)論是向人M2e序列插入禽M2e序列改變了與A25病毒相比NS1-236位點(diǎn)的全部插入序列(可能和結(jié)構(gòu))。這是該插入位點(diǎn)的廣譜允許度的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
此外，HA0流感A表位可以相似的串聯(lián)方式與M2e組合。其他流感病毒表位，例如來(lái)自HA蛋白的病毒中和表位，或CTL表位可單獨(dú)或以各種組合插入這一位點(diǎn)(或通過(guò)在NS1或其他病毒蛋白中一些其他位點(diǎn)的類似物)。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證NS1-236插入位點(diǎn)的廣譜允許度，在N1-236殘基之后構(gòu)建流感H3病毒的SKAFSNCYPYDVPDYASL線性保護(hù)性表位(也稱作HAtag表位)，其可提供對(duì)于各種H3流感株的保護(hù)(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104246-251，2007)，使用標(biāo)準(zhǔn)的二質(zhì)粒方法生成重組病毒。兩個(gè)甘氨酸在兩邊側(cè)接該表位以增加柔性并且其半胱氨酸殘基變成絲氨酸。所回收活病毒的插入序列如圖17A所示。用抗HAtag MAb 12CA5染色病毒空斑(Vero細(xì)胞)(圖14B)。因此，由隨機(jī)插入M2e表位發(fā)現(xiàn)的NS1-236插入位點(diǎn)允許具有完全不同序列的表位(例如，HAtag)。與M2e插入片段相似，該實(shí)例驗(yàn)證了B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的插入，因?yàn)镠Atag表示B細(xì)胞和T細(xì)胞流感病毒表位二者(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104246-251，2007)。
ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e病毒的遺傳穩(wěn)定性以及細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 將在第二次傳代具有最高滴度7log10 pfu/mL的A25病毒克隆的NS1基因(圖6，A組)用于進(jìn)一步的生物特性研究。圖6中被M2e MAb(以及JE抗體)特異染色的A25感染細(xì)胞的免疫熒光附加驗(yàn)證了的M2e的有效表達(dá)。
為了測(cè)定該病毒是否遺傳穩(wěn)定，以約MOI 0.001pfu/mL在可用于疫苗生產(chǎn)的Vero細(xì)胞中將其傳代10次至P12水平。當(dāng)P12病毒在免疫聚焦測(cè)定法中被M2eMAB或JE HIAF染色時(shí)，所有空斑均被兩種抗體染色并產(chǎn)生相同的滴度8log10pfu/mL(Fig 6B)。這表明傳代12的病毒可穩(wěn)定保持其插入片段。
由于病毒變得細(xì)胞病變性更強(qiáng)，一些Vero細(xì)胞適應(yīng)發(fā)生在傳代中，P12水平的空斑大于P2病毒的空斑。P12病毒空斑的平均直徑變得與ChimeriVaxTM-JE載體病毒可比。當(dāng)測(cè)序P12病毒的全部基因組時(shí)，檢測(cè)到8個(gè)核苷酸改變(表4)。四個(gè)改變引起氨基酸替換E蛋白的殘基E357處纈氨酸變成丙氨酸，NS4B-95處甲硫氨酸變成纈氨酸，以及緊接著上游來(lái)自M2e肽的2個(gè)替換(N1-235處絲氨酸至亮氨酸以及殘基1ins處苯丙氨酸至亮氨酸)。后面的一些適應(yīng)一定與空斑大小增加和更好的病毒復(fù)制(如下所示)相關(guān)。這些改變中沒(méi)有ChimeriVaxTM-JE疫苗減毒標(biāo)記的回復(fù)突變(如表4所示，也傳代至P12并進(jìn)行了測(cè)序的其他三個(gè)克隆A11、A79和A88中的突變穩(wěn)定保持了M2e插入片段)。
在Vero細(xì)胞中比較P2和P12水平A25克隆與ChimeriVaxTM-JE母體載體病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。圖6C顯示了一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)(MOI 0.001)的結(jié)果。P2病毒可有效生長(zhǎng)，但是慢于ChimeriVaxTM-JE，第6天達(dá)到峰值，比載體病毒慢一天。相反P12病毒在第5天以高于ChimeriVaxTM-JE的滴度達(dá)到峰值，高于7log10pfu/mL。MOI 0.1時(shí)P12病毒的更有效復(fù)制更明顯。因此，在Vero細(xì)胞中A25克隆在10次傳代后可更有效復(fù)制。一些在P12時(shí)發(fā)現(xiàn)的序列改變有利于重組疫苗病毒的高產(chǎn)量生產(chǎn)。
使用ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e A25病毒建立用于分析ChimeriVaxTM-JE/flu重組子的免疫原性和保護(hù)效率的小鼠模型的中試研究 對(duì)于任何病毒疫苗載體，尤其是嚙齒動(dòng)物不是天然宿主者(例如，YF(YF17D的野生型原型)的天然宿主是猴和人)，建立相關(guān)和可用的小動(dòng)物模型是充滿挑戰(zhàn)的。用這樣的模型應(yīng)可以比較多個(gè)表達(dá)各種構(gòu)象的外源肽的重組病毒構(gòu)建體的相對(duì)免疫原性。為了確定最佳的給藥途徑并獲得ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e免疫原性的初步數(shù)據(jù)，用5log10pfu/劑量的A25克隆皮下(SC)或腹腔(IP)免疫(分別1和2組，表5)數(shù)組5周大的Balb/c小鼠(N＝10)。對(duì)照組3接受皮下10μg劑量的包含在大腸桿菌產(chǎn)生表面上的M2e肽的肝炎B核心顆粒(HBc-M2e；Fiers等，Virus Res.103173-176，2004)和明礬佐劑；相似地在第20天加強(qiáng)免疫該組。用ChimeriVaxTM-JE載體(5log10pfu)免疫陰性對(duì)照組4和5或模擬免疫(稀釋劑)。
在第1、3、7、9和11天收集的血清中測(cè)定接種了病毒的單個(gè)動(dòng)物中的病毒血癥。兩種途徑下A25均不引起可檢測(cè)的病毒血癥。接種ChimeriVaxTM-JE病毒的10只動(dòng)物中的2只僅在第1天具有低水平的病毒血癥(50和275pfu/mL)，其很可能表示接種的病毒。因此，A25病毒不能通過(guò)這兩種途徑引起明顯的系統(tǒng)感染。
第38天，取所有動(dòng)物的血樣并用ELISA測(cè)定各組血漿樣品的抗M2e抗體應(yīng)答。在病毒免疫組中，僅在2組(A25IP)中檢測(cè)到低水平的應(yīng)答，其總IgG和IgG2a滴度為100(沒(méi)有可檢測(cè)的IgG1)，而3組的滴度如預(yù)期較高總IgG、IgG1和IgG2a分別為218700、218700、和24300。由于這一原因，第40天用5log10pfu的各自病毒強(qiáng)化免疫1、2和4組1組皮下強(qiáng)化而其他組腹腔強(qiáng)化(IP)。(5組也接受腹腔劑量的稀釋劑)。兩周后(第54天)，再次取動(dòng)物血樣并在血清樣品中檢測(cè)M2e抗體應(yīng)答(表5)。A25病毒強(qiáng)化導(dǎo)致2組(A25IP/IP)中抗體滴度的顯著增加。這一組的總IgG滴度增加了約30倍至2700。3組(HBc-M2e)的總IgG滴度為72900。2組和3組的總IgG的450nmOD讀數(shù)顯示于圖7。重要的是，盡管HBc-M2e免疫引起明顯的IgG1應(yīng)答，幾乎所有A25病毒誘導(dǎo)的抗體為IgG2a亞型(表5)。IgG2a抗體是ADCC的主要介導(dǎo)子，其被認(rèn)為是流感感染的M2e-誘導(dǎo)保護(hù)的主要機(jī)制。因此，用于測(cè)量ChimeriVaxTM-JE/flu重組子免疫原性的有效小鼠模型依賴IP免疫后IP加強(qiáng)建立。
第55天，用高劑量20LD50的小鼠適應(yīng)A/PR/8/34流感病毒鼻內(nèi)(IN)免疫動(dòng)物。該劑量比用于HBc-M2e研究的4LD50免疫劑量高5倍，我們刻意選擇高劑量以回答與HBc-M2e免疫相比當(dāng)通過(guò)ChimeriVaxTM-JE病毒載體傳遞即使免疫后M2e抗體滴度更低是否可能產(chǎn)生更有效的保護(hù)這一問(wèn)題。理論上而言，這可由于抗原遞呈細(xì)胞的非特異性病毒刺激、CTL應(yīng)答(M2e肽包含CTL表位)、誘導(dǎo)強(qiáng)效T細(xì)胞輔助以及一些固有免疫機(jī)制。免疫后存活曲線見(jiàn)圖8。如預(yù)期給予攻擊劑量，HBc-M2e免疫動(dòng)物的存活不完全(50％)。用A25病毒IP/IP免疫的2組中兩只動(dòng)物存活，該組在兩個(gè)A25-免疫組(20％存活)中具有最高的M2e抗體滴度。1組中存活一只動(dòng)物(A25SC/SC)。陰性對(duì)照組4和5中的所有動(dòng)物均死亡。從這些數(shù)據(jù)可顯示保護(hù)水平與M2e抗體滴度之間的明顯相關(guān)性，不論用重組病毒還是亞單位疫苗免疫動(dòng)物。然而，應(yīng)注意的是一些上述機(jī)制可能在A25免疫中發(fā)揮作用，因?yàn)榻o予小鼠的實(shí)際M2e的微克量未知并且可能由于病毒在這一模型中的有限復(fù)制而非常低。這一方面可在hamster模型中解釋，其中預(yù)期更有效的外周病毒復(fù)制。在靈長(zhǎng)類/人類中，ChimeriVaxTM-JE(以及ChimeriVaxTM和YF 17D疫苗)引起相對(duì)有效的系統(tǒng)感染，峰病毒血癥滴度為約2log10pfu/Ml。因此，可預(yù)期相對(duì)低劑量單次接種病毒后對(duì)流感的強(qiáng)效M2e應(yīng)答和保護(hù)。
使用A25病毒的小鼠實(shí)驗(yàn)2 用更年幼的4周大的小鼠(來(lái)自兩個(gè)供應(yīng)商)以A25病毒進(jìn)行附加小鼠實(shí)驗(yàn)，使用更高的A25IP劑量(7log10pfu/ml)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表6。在絕大多數(shù)組中使用A25P2病毒儲(chǔ)備(其也用于之前的實(shí)驗(yàn)中)；該實(shí)驗(yàn)也包括接種上述Vero細(xì)胞適應(yīng)A25P12病毒的組(#5)。陰性對(duì)照為ChimeriVax-JE和稀釋劑(2、4和7組)。陽(yáng)性對(duì)照Taconic小鼠SC接種與明礬佐劑混合的HBc-M2e顆粒(稱作Acam-Flu-A)。在Jackson小鼠組中，產(chǎn)生兩個(gè)組用于檢測(cè)A25病毒和Acam-Flu-A之間的協(xié)同作用8組經(jīng)IP途徑僅接受Acam-Flu-A而且不需佐劑，9組IP接受與A29混合的Acam-Flu-A。在接種1個(gè)月后強(qiáng)化免疫所有的小鼠，在第59天用ELISA測(cè)定單獨(dú)血清(用于總IgG))或各組血清混合(用于IgG同型)的特異抗體滴度(總IgG和IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3型)；也在第30天(加強(qiáng)之前)測(cè)定M2e特異性總IgG滴度。ELISA滴度見(jiàn)表7；給出單獨(dú)血清中測(cè)定的總IgG的GMT值。該數(shù)據(jù)與之前的小鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致，除了A25免疫的動(dòng)物具有顯著較高的M2r特異抗體滴度。絕大多數(shù)接種了A25和Acam-Flu-A的動(dòng)物在第一次劑量之后第30天發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。在第59天(強(qiáng)化后約1個(gè)月)A25和Acam-Flu-A組中的所有動(dòng)物為血清陽(yáng)性并且與第30天相比總IgG滴度顯著增加。如預(yù)期，Acam-Flu-A/明礬佐劑免疫(3組)引起占優(yōu)勢(shì)的Th2型應(yīng)答，與其他IgG同型相比IgG1滴度最高。A25(1、5和6組)免疫引起占優(yōu)勢(shì)的與更高IgG2a滴度相關(guān)的Th1型應(yīng)答，IgG2a為經(jīng)ADCC機(jī)制的M2e介導(dǎo)保護(hù)的需要類型；檢測(cè)也與ADCC機(jī)制相關(guān)的IgG2b和IgG3抗體(Jegerlehner等，J.Immunol.1725598-5605，2004)。這在一次驗(yàn)證了插入ChimeriVax-JE NS1-236位點(diǎn)的M2e表位的高免疫原性。
本發(fā)明的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)為與單獨(dú)接種Acam-Flu-A或A25病毒相比同時(shí)接種Acam-Flu-A與A25可顯著增強(qiáng)抗M2e抗體應(yīng)答(比較表7中的9組與8和6組)。第59天，9組和8組的總IgG GMTs分別為95940和35050(第30天的比例差值甚至更明顯)。因此，觀察到同時(shí)接種的強(qiáng)效協(xié)同作用。而且，盡管單獨(dú)Acam-Flu-A可誘導(dǎo)絕大多數(shù)Th1型應(yīng)答(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的滴度分別為72900、8100、300和900)，同時(shí)接種Acam-Flu-A與A25可導(dǎo)致明顯的Th2移動(dòng)，可由IgG1比例更低和其他抗體同型比例顯著更高證明(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的滴度分別為72900、72900、8100和8100)。該協(xié)同作用不僅僅是由于被同時(shí)接種的動(dòng)物中A25病毒引起抗原(M2e)質(zhì)量增加，因?yàn)閱为?dú)接種A25可引起中度的免疫應(yīng)答(在Jackson balb/c小鼠中，見(jiàn)表7中的6組)。這些作用也可能是由于佐劑對(duì)例如接種位點(diǎn)的樹(shù)突狀細(xì)胞中病毒復(fù)制的作用。已報(bào)道在α病毒復(fù)制子中觀察到該類佐劑作用(Thompson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1033722-3727，2006；Hidmark等，J.Virol.807100-7110，2006)。
隨機(jī)插入ChimeriVax-JE E蛋白中的M2e的表達(dá) 進(jìn)行三個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定是否可以隨機(jī)插入M2e并在ChimeriVax-JE載體的E蛋白中表達(dá)于病毒顆粒表面。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在pBSA-AR2-rM2e質(zhì)粒文庫(kù)上用SP6RNA聚合酶合成RNA(圖2第16步)。使用lipofectamine用RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。在收獲的細(xì)胞上清中僅觀察到未突變病毒空斑，其不能被M2e MAb染色。假定上，就隨機(jī)插入NS1而言，由于插入片段在E的不穩(wěn)定位點(diǎn)所以不攜帶M2e插入片段的病毒會(huì)快速出現(xiàn)并變得占優(yōu)勢(shì)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用NsiI和KasI從pUCAR02-rM2e中萃取E-M2e基因文庫(kù)(圖12第13步)并體外連接至pBSA-AR2終止載體(圖2第15步)。用XhoI將連接產(chǎn)物線性化并體外轉(zhuǎn)錄。用合成RNA電穿孔Vero細(xì)胞，然后系列稀釋感染細(xì)胞混懸液(以降低未突變和M2e陽(yáng)性病毒之間的干擾)，將細(xì)胞稀釋液置于培養(yǎng)皿中。向接種了更高稀釋的已轉(zhuǎn)染細(xì)胞液的培養(yǎng)皿中加入未轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞以確保細(xì)胞單層融合。結(jié)合后，用瓊脂覆蓋細(xì)胞單層。當(dāng)6天后用M2e Mab染色細(xì)胞單層時(shí)(在去除瓊脂糖覆蓋之后)，在高轉(zhuǎn)染細(xì)胞稀釋(1∶4和1∶8)觀察到數(shù)個(gè)陽(yáng)性聚集點(diǎn)。圖12A顯示了該聚集點(diǎn)的一個(gè)實(shí)例。與NS1-M2e文庫(kù)轉(zhuǎn)染觀察到的一些聚集點(diǎn)相比，這些聚集點(diǎn)的數(shù)量和大小較小，表明與NS1相比更難向E蛋白中插入35-氨基酸插入片段(用于pUC-AR02-rM2e中，與圖5所示相同)。在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將兩個(gè)互補(bǔ)的磷酸化引物退火生產(chǎn)較短的M2e插入片段(SLLTEVETPIRNEWGSR)。該插入片段的核酸序列如下所示5’-P-AGC CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACGCCT ATC AGA AAC GAA TGG GGG AGC AGA-3’ 相似地生產(chǎn)相同的但是兩端包含兩個(gè)附加甘氨酸接頭殘基用于增加柔性的插入片段(總長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸)。第二個(gè)插入片段的核酸序列如下所示 5’-P-GGA GGA AGC CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CCTATC AGA AAC GAA TGG GGG AGC AGA GGC GGC-3’ 將兩個(gè)插入片段連接至pUC-AR02-rTn7enr文庫(kù)的平端PmeI位點(diǎn)取代轉(zhuǎn)移引物(步驟8，圖2)。連接前將該載體質(zhì)粒DNA脫磷酸化。分別制備兩個(gè)新的質(zhì)粒文庫(kù)，pUC-AR2-17M2e和pUC-AR2-17gM2e。將兩個(gè)文庫(kù)的NsiI-KasI插入片段轉(zhuǎn)移至pBSA-AR2終止載體，得到pBSA-AR2-17M2e和pBSA-AR2-17gM2e全長(zhǎng)文庫(kù)，其接著可用于體外轉(zhuǎn)錄。首先用PmeI消化后面的兩個(gè)文庫(kù)以去除任何不包含該插入片段的全長(zhǎng)模板DNA分子(而在包含插入片段的分子中切除插入片段兩端的PmeI克隆位點(diǎn))。然后用XhoI將它們線性化并用SP6 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。用轉(zhuǎn)錄物電穿孔Vero細(xì)胞并接種(不稀釋)至培養(yǎng)皿并在細(xì)胞結(jié)合后用瓊脂糖覆蓋。為了避免插入片段少的病毒的干擾，早期即轉(zhuǎn)染后第4天用M2e Mab染色細(xì)胞單層。兩個(gè)轉(zhuǎn)染中觀察到多至約100個(gè)小聚集點(diǎn)。這些聚集點(diǎn)的實(shí)例見(jiàn)圖12A和B，分別為包含E蛋白中17-氨基酸M2e插入片段的ChimeriVax-JE病毒和GG-17氨基酸-GG插入片段。因此，將插入片段從35個(gè)氨基酸縮短至17或21個(gè)氨基酸可顯著增加重組病毒的回收。所觀察到的一些M2e陽(yáng)性變異體一旦被分離即可很好地復(fù)制。如果必要的話，可從附加轉(zhuǎn)染中分離更有效復(fù)制的變異體。此外，可在例如Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代慢速?gòu)?fù)制的變異體以希望出現(xiàn)一些第二位點(diǎn)突變改善生長(zhǎng)。這一實(shí)施例明顯驗(yàn)證了向E蛋白中隨機(jī)插入外源免疫原表位的可能性。
在ChimeriVax-JE載體病毒的prM蛋白中隨機(jī)插入M2e表位 病毒糖蛋白(prM、E或NS1)中不同的表達(dá)方式見(jiàn)圖15。插入E蛋白的表位將遞呈于病毒顆粒(180拷貝)表面并因此可預(yù)期為免疫原性最強(qiáng)。NS1蛋白中的表達(dá)將插入的表位傳遞至被感染細(xì)胞表面以及在分泌型NS1寡聚體中傳遞至胞外。雖然上述實(shí)驗(yàn)實(shí)施例驗(yàn)證了后一方式的高免疫原性，但是這種情況下低于E中的表達(dá)(對(duì)于一些表位仍然足夠高，例如病毒中和抗體表位，其與非中和表位例如流感的M2e相比可提供更強(qiáng)效的保護(hù))。由于已知的在黃病毒顆粒的成熟過(guò)程中弗林蛋白酶對(duì)prM的不完全裂解所以prM中的表達(dá)將導(dǎo)致病毒顆粒表面上的部分遞呈以及在由弗林蛋白酶裂解生成的分泌型prM N端部分附加胞外表達(dá)。這一表達(dá)方式也預(yù)期具有高免疫原性，比NS1中表達(dá)的免疫原性更高。如果可在成熟M蛋白(prM的C端部分)中插入表位，所有的表位分子均可遞呈于病毒顆粒(180拷貝)的表面，與E中的表達(dá)相似。
為了在SphI和NsiI位點(diǎn)(SphI位于prM基因起始的上游)之間將M2e表位(插入片段總長(zhǎng)35個(gè)氨基酸)插入ChimeriVax-JE的prM，構(gòu)建pBSA-AR1-rM2e質(zhì)粒文庫(kù)(圖2)。這一文庫(kù)的代表性為約105克隆。將其用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，所得RNA轉(zhuǎn)錄物用于使用lipofectamine轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞單層。用瓊脂糖覆蓋已轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在第5-6天用M2e MAb染色。觀察到M2e陽(yáng)性空斑。從瓊脂糖覆蓋中收獲對(duì)應(yīng)于陽(yáng)性空斑的M2e陽(yáng)性病毒克隆并在另外幾輪的空斑純化中進(jìn)一步純化，然后擴(kuò)增傳代2次以制備5個(gè)純病毒儲(chǔ)備，命名為M1、M2、M3、M6和M8。
用M2e和JE抗體有效染色所有新的重組克隆，而用JE抗體染色ChimeriVax-JE載體病毒空斑。在標(biāo)準(zhǔn)空斑測(cè)定法(甲基纖維素覆蓋)中第5天染色的空斑實(shí)例見(jiàn)圖16A。與ChimeriVax-JE相比，M1、M2和M3插入片段突變體的空斑更大，而M6和M8克隆的空斑更小。(這一空斑大小的差異在瓊脂糖覆蓋下更明顯)。因此，與載體病毒相比可M1-3克隆在體外更好地復(fù)制。這一點(diǎn)在生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)(圖16B)。M1-3克隆生長(zhǎng)更快并且產(chǎn)生比ChimeriVax-JE更高的滴度，而M6和M7的滴度稍微較低。
通過(guò)測(cè)序測(cè)定插入片段的位置。結(jié)果見(jiàn)圖17。有趣的是在M1、M2和M3中M2e插入片段添加入ChimeriVax-JE病毒的JE-特異性prM的N端，盡管在不同的氨基酸處?？寺6和M8中的位置相同(在病毒ORF的Pro殘基147之后；或prM-26)。在ChimeriVax-JE病毒中，prM的N端(MKLS...)由宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶裂解形成(圖17)。在克隆M1、M2和M3中，插入片段分別摻入了JE prM起始上游4、1和2個(gè)氨基酸殘基處。因此在這些病毒中突變prM的N端包含M2e肽序列，其后為天然prM序列前的4、1、和2個(gè)病毒殘基，然后是prM序列。用普通的SignalP 3.0在線程序使用兩種不同的算法預(yù)測(cè)新的信號(hào)肽酶裂解位點(diǎn)(如圖17所示)。在M1克隆中，兩個(gè)可能的裂解位點(diǎn)可移除一個(gè)或三個(gè)M2e的N端氨基酸。強(qiáng)烈預(yù)測(cè)在M2中單個(gè)裂解可得到后面為完整M2e序列的N端甘氨酸。在M3中，或者該N端在M2中或者M(jìn)2殘基的三個(gè)被其他可能的裂解裂解掉。三個(gè)克隆的空斑可被M2e MAb有效染色這一事實(shí)表明M1和M3裂解中M2e殘基損失最小。重要的是，所預(yù)測(cè)的信號(hào)肽酶裂解M1-3克隆的可能性大于ChimeriVax-JE(例如，M2克隆為0.387相對(duì)ChimeriVax-JE的0.073)。這可解釋為什么M1-3病毒比ChimeriVax-JE母體生長(zhǎng)的好。
因此，prM蛋白高度允許不同位點(diǎn)的插入，尤其是N端殘基。基于已述結(jié)果(更大的空斑、Vero細(xì)胞內(nèi)更有效的復(fù)制、更高預(yù)測(cè)的M1-3克隆中信號(hào)肽酶裂解可能性)，我們認(rèn)為prM的N端(看上去對(duì)黃病毒顆粒的裝配不重要)為廣譜允許插入位點(diǎn)并可耐受各種其他插入片段，包括長(zhǎng)插入片段(例如，50、100、200、400個(gè)氨基酸等)。我們因此在這一位點(diǎn)插入HIV gag，多至約200個(gè)HPV16 L2蛋白首個(gè)殘基的肽、流感HA1和全長(zhǎng)HA(長(zhǎng)度約550個(gè)氨基酸)。將這些設(shè)計(jì)成在載體病毒prM序列之前包含與N端或prM融合的異源序列(如M1-3克隆中M2e的情況)，或通過(guò)摻入其他信號(hào)從prM裂解，或適當(dāng)?shù)牡鞍酌噶呀馕稽c(diǎn)或自體蛋白酶。
構(gòu)建A25病毒的ChimeriVax-WN類似物(在NS1-236包含M2e插入片段的ChimeriVax-JE) ChimeriVax-JE以及上述A25病毒不能在小鼠中有效復(fù)制(例如，沒(méi)有可檢測(cè)的接種后病毒血癥)。然而，ChimeriVax-JE可在人類中更好地復(fù)制(～2 log10 pfu/ml病毒血癥)(Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003)，因此A25病毒可在人體中誘導(dǎo)高M(jìn)2e抗體應(yīng)答并保護(hù)他們免受流感感染。我們最近驗(yàn)證了ChimeriVax-WN病毒(WN02人疫苗版本；WO 2004/045529)可在倉(cāng)鼠中很好地復(fù)制(～3log10 pfu/ml病毒血癥)(WO 2006/116182)，也可在人中很好地復(fù)制(～2 log10 pfu/ml病毒血癥)(Monath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1036694-6699，2006)。為了使用更強(qiáng)效的模型(倉(cāng)鼠中ChimeriVax-WN02對(duì)比小鼠中ChimeriVax-JE)獲得在ChimeriVax病毒的NS1-236位點(diǎn)表達(dá)的M2e表位保護(hù)的附加證據(jù)，構(gòu)建A25病毒的ChimeriVax-WN02/M2eNS1-236類似物。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)用ChimeriVax-WN02病毒的prM-E基因取代包含全長(zhǎng)ChimeriVax-JEcDNA的pBSA中的JE-特異prM-E基因。這樣得到pBWN02質(zhì)粒(圖18)。將包含來(lái)自A25病毒M2e插入片段的NS1基因(含有或不含M2e序列上游的Vero細(xì)胞適應(yīng))克隆至pBWN02。體外轉(zhuǎn)錄得到的兩個(gè)質(zhì)粒，用RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞并用瓊脂覆蓋。在第6天觀察到非常大的空斑，用M2e MAb染色(圖18，底部組圖)。
將ChimeriVax-WN02/M2eNS1-236的兩個(gè)版本W(wǎng)N02/A25和WN02/A25adapt進(jìn)行一次空斑純化并通過(guò)在Vero細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增制備已克隆病毒的儲(chǔ)備。與ChimeriVax-WN02和ChimeriVax-JE對(duì)比的空斑實(shí)例顯示于圖19A。Vero細(xì)胞中新病毒的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖19B。WN02/A25病毒生長(zhǎng)次于ChimeriVax-WN02(峰滴度分別為～7.5log10pfu/ml對(duì)比～8.7log10 pfu/ml)。與適應(yīng)A25病毒(見(jiàn)圖6C)相似，WN02/A25adapt版本(包含M2e序列上游2個(gè)氨基酸改變)生長(zhǎng)得更好，幾乎和ChimeriVax-WN02一樣好。因此，原本引入ChimeriVax-JENS1蛋白的插入片段成功轉(zhuǎn)移至ChimeriVax-WN02疫苗病毒。原本在A25病毒中觀察到的兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)增強(qiáng)了WN02/A25病毒的生長(zhǎng)。
結(jié)論 總之，我們成功進(jìn)進(jìn)行了轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)誘變ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒的prM/M、E和NS1基因以隨機(jī)插入流感A病毒的共有M2e保護(hù)性表位，目的在于生成抗流感A的高效的通用疫苗。通過(guò)向prM和NS1蛋白中快速引入一定數(shù)量包含該插入片段的病毒突變體(可由抗M2e抗體識(shí)別)并將M2e肽插入E蛋白中驗(yàn)證了該方法的可行性。我們也表明ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e病毒的A25克隆和ChimeriVaxTM-JE-prM/M2e病毒的數(shù)個(gè)克隆可在Vero細(xì)胞中有效復(fù)制并鑒定出這些病毒中的M2e插入位點(diǎn)。而且，我們表明了A25病毒遺傳穩(wěn)定，因?yàn)樗梢栽隗w外10次低MOI傳代中保持M2e插入片段。一些由本發(fā)明的直接隨機(jī)誘變法鑒定的插入位點(diǎn)就插入片段大小和序列二者而言為廣譜允許，如使用NS1-236位點(diǎn)例證。在一種黃病毒中發(fā)現(xiàn)的允許插入位點(diǎn)可用于其他黃病毒，如在我們的實(shí)驗(yàn)中通過(guò)將來(lái)自ChimeriVax-JE包含M2e的NS1基因轉(zhuǎn)移至ChimeriVax-WN所例證。進(jìn)一步而言，成功建立了分析小鼠中免疫原性的有效IP初免/IP強(qiáng)化模型并證明一個(gè)插入片段變異體具有高免疫原性。盡管不可檢測(cè)小鼠的外周復(fù)制(包括IP接種后)，該病毒具有高免疫原性并誘導(dǎo)占優(yōu)勢(shì)的IgG2a M2e抗體，其對(duì)于M2e免疫的ADCC介導(dǎo)保護(hù)非常必要。我們實(shí)驗(yàn)中的另一新穎發(fā)現(xiàn)為同時(shí)接種表達(dá)M2e肽的病毒重組子和亞單位基于M2e的候選疫苗的協(xié)同作用。
如上所述，本文所述方法適用于所有其他ChimeriVaxTM目標(biāo)蛋白以及其他作為載體的活疫苗病毒，包括YF17D或非黃病毒活疫苗，或非活載體生物體。這一方法可用于構(gòu)建對(duì)人類公共健康和獸類具有重要性的大范圍病原體的重組疫苗。
值得注意的是所列構(gòu)建步驟的順序(圖2)可以變化并仍屬于本發(fā)明范疇。而且，除Tn7之外轉(zhuǎn)座子可用于直接隨機(jī)插入隨機(jī)限制性酶切位點(diǎn)或外源表位。后者以及使用限制性酶切位點(diǎn)而不是PmeI進(jìn)行隨機(jī)插入，或任何該構(gòu)建步驟的不同篩選標(biāo)記，或使用任何不同方法分離活突變病毒(例如所用被病毒感染的細(xì)胞上清的ELISA，或細(xì)胞分選以分離陽(yáng)性細(xì)胞等)或體外或體內(nèi)對(duì)病毒進(jìn)行特性研究等不改變本發(fā)明含義。
表1-可衍生表位/抗原/肽的病原體的實(shí)例列表 病毒 黃病毒 黃熱病毒 日本腦炎病毒 登革熱病毒，1、2、3和4型 西尼羅病毒 蜱傳腦炎病毒 丙型肝炎病毒(例如，基因型1a，1b，2a，2b，2c，3a，4a，4b，4c和4d) 乳多泡病毒科 乳頭瘤病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒科 人免疫缺陷病毒，I型 人免疫缺陷病毒，II型 猴免疫缺陷病毒 人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒I和II型 肝病毒科 乙肝病毒 小核糖核酸病毒科 甲肝病毒 鼻病毒 脊髓灰質(zhì)炎病毒 皰疹病毒科 單純皰疹病毒，I型 單純皰疹病毒，II型 巨細(xì)胞病毒 愛(ài)潑斯坦巴爾病毒 水痘-帶狀皰疹病毒 披膜病毒科 α病毒 風(fēng)疹病毒 副粘病毒科 呼吸道合胞病毒 副流感病毒 麻疹病毒 腮腺炎病毒 正粘病毒科 流感病毒 纖絲病毒科 馬爾堡病毒 埃博拉病毒 輪狀病毒科 輪狀病毒 冠狀病毒科 冠狀病毒 腺病毒科 腺病毒 彈狀病毒科 彈狀病毒 細(xì)菌 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌 腸道致病性大腸桿菌 空腸彎曲桿菌 幽門螺旋桿菌 傷寒沙門菌 霍亂弧菌 艱難梭菌 破傷風(fēng)梭菌 化膿性鏈球菌 百日咳桿菌 腦膜炎奈瑟菌 奈瑟球菌 Legionella neumophilus 披衣菌屬 嗜血桿菌屬 志賀菌屬 寄生蟲 瘧原蟲屬 血吸蟲屬 錐體蟲屬 弓形蟲屬 隱孢子蟲屬 肺孢子蟲屬 利什曼原蟲屬 表2-所列病毒篩選抗原的實(shí)例 表3-所列病毒/抗原的B和T細(xì)胞表位實(shí)例

表4 ChimeriVax-JE-NS1/M2e病毒以及克隆A11、A79和A88的遺傳穩(wěn)定性。在P12遺傳穩(wěn)定性傳代時(shí)測(cè)序完整病毒基因組。顯示核苷酸改變/異質(zhì)性和氨基酸改變。


1NS1插入片段的位點(diǎn)和核苷酸/氨基酸.編號(hào)見(jiàn)圖5. 表5 Balb/c小鼠第54天(1、2、4和5組加強(qiáng)后2周)的M2e抗體應(yīng)答
1對(duì)于病毒而言，免疫和加強(qiáng)劑量為5 log10 pfu；對(duì)于HBc-M2e，劑量為10g顆粒+明礬。
2在第20天強(qiáng)化3組，而在第40天強(qiáng)化1、2、4和5組。
表6.設(shè)計(jì)使用A25病毒的小鼠實(shí)驗(yàn)#2(來(lái)自兩個(gè)供應(yīng)商的4周大雌性balb/c小鼠)。第59天測(cè)定ELISA抗體滴度(約強(qiáng)化后一個(gè)月)。

表7.實(shí)驗(yàn)2中小鼠的M2e-特異抗體應(yīng)答

上文引用的所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以參考形式并于本文。本文中單數(shù)形式例如“一個(gè)”和“該”的使用不排除對(duì)應(yīng)復(fù)數(shù)形式的含義，除非文章中指明相反的情況。因此，例如，如果一項(xiàng)權(quán)利要求指明給予“一種”黃病毒，其也可理解為包含給予多余于一種黃病毒，除非另外指明。其他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.生成包含編碼異源肽的核酸分子的病毒基因組的方法，該方法包括以下步驟
(i)提供目標(biāo)病毒基因；
(ii)誘變目標(biāo)病毒基因；以及
(iii)將編碼異源肽的核酸分子連接至目標(biāo)病毒基因的誘變位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括以下步驟
(iv)用基因組核酸文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以起始病毒復(fù)制；以及
(v)篩選活病毒重組子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在穿梭載體中提供所述目標(biāo)病毒基因，并且在將編碼異源肽的核酸分子連接至目標(biāo)病毒基因的誘變位點(diǎn)之后所述方法進(jìn)一步包括以下步驟將突變的目標(biāo)病毒基因引入衍生目標(biāo)病毒基因的病毒基因組，替代缺失該插入的對(duì)應(yīng)病毒基因，以生成包含插入片段的病毒基因組。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述穿梭載體包含兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)病毒基因。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在完整病毒基因組背景中提供所述目標(biāo)病毒基因，并且所述方法生成包含插入片段的病毒基因組。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括通過(guò)向細(xì)胞中引入包含插入片段的病毒基因組，從包含插入片段的病毒基因組生成病毒載體。
7.權(quán)利要求6的方法，其進(jìn)一步包括從細(xì)胞或其上清中分離病毒載體。
8.權(quán)利要求3的方法，其包括誘變包含兩或更多目標(biāo)病毒基因的兩種或更多穿梭載體，并將兩個(gè)或更多個(gè)包含編碼一個(gè)或多個(gè)異源肽的核酸分子的目標(biāo)病毒基因引入衍生該目標(biāo)基因的病毒基因組中替代缺失插入片段的對(duì)應(yīng)病毒基因以生成包含插入片段的病毒基因組。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述誘變步驟包括通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變向目標(biāo)病毒基因中引入一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移引物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中由內(nèi)切核酸酶消化移除一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移引物，并通過(guò)在限制性內(nèi)切核酸酶消化位點(diǎn)的連接將編碼異源肽的核酸分子引入目標(biāo)病毒基因。
11.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括生成突變目標(biāo)病毒基因的文庫(kù)。
12.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)病毒基因包括在被再次應(yīng)用于該方法之前由權(quán)利要求1的方法引入的插入片段。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒基因組為黃病毒基因組。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述黃病毒為嵌合黃病毒。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述嵌合黃病毒包含第一種黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白以及第二種不同黃病毒的膜前和包膜蛋白。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一種和第二種黃病毒獨(dú)立選自日本腦炎、登革熱-1、登革熱-2、登革熱-3、登革熱-4、黃熱病、墨累谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、昆津、羅西奧腦炎、伊利烏斯腦炎、蜱傳腦炎、中歐腦炎、西伯利亞腦炎、俄羅斯春夏型腦炎、基亞薩努森林病、鄂木斯克出血熱、跳躍病、波瓦生、根岸、阿布塞塔羅夫、漢薩洛瓦、阿泊依和海普病毒。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)病毒基因選自編碼包膜、衣殼、膜前、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的基因。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述異源肽包含疫苗表位。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述疫苗表位為B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述表位衍生自病毒病原體、細(xì)菌病原體、寄生蟲病原體、變應(yīng)原抗原，或腫瘤相關(guān)抗原。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述病毒病原體為流感病毒。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述異源肽包含流感M2e肽或包含流感血凝素前體蛋白裂解位點(diǎn)(HA0)的肽。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述流感病毒為禽或人流感病毒。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒基因組包含編碼多于一個(gè)異源肽的核酸分子，并且所述異源肽包含人和禽流感M2e肽。
25.由權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的方法生成的病毒基因組或其互補(bǔ)體。
26.由權(quán)利要求25的病毒基因組編碼的病毒載體。
27.包含插入選自衣殼、膜前、包膜、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白中的異源肽的黃病毒載體。
28.權(quán)利要求27的黃病毒載體，其中所述黃病毒為黃熱病毒。
29.權(quán)利要求27的黃病毒載體，其中所述黃病毒為嵌合黃病毒。
30.權(quán)利要求29的黃病毒載體，其中所述嵌合黃病毒包含第一種黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白和第二種不同黃病毒的膜前和包膜蛋白。
31.權(quán)利要求30的黃病毒載體，其中第一和第二種黃病毒獨(dú)立選自日本腦炎、登革熱-1、登革熱-2、登革熱-3、登革熱-4、黃熱病、墨累谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、昆津、羅西奧腦炎、伊利烏斯腦炎、蜱傳腦炎、中歐腦炎、西伯利亞腦炎、俄羅斯春夏型腦炎、基亞薩努森林病、鄂木斯克出血熱、跳躍病、波瓦生、根岸、阿布塞塔羅夫、漢薩洛瓦、阿泊依和海普病毒。
32.權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的黃病毒載體，其中所述黃病毒載體包含插入非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)的氨基酸236和237之間的異源肽。
33.權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)的黃病毒載體，其中所述黃病毒載體包含插入載體膜前蛋白的氨基端區(qū)域的異源肽。
34.權(quán)利要求33的黃病毒載體，其中所述異源肽插入在衣殼/膜前裂解位點(diǎn)前的-4、-2或-1位或膜前蛋白的26位。
35.權(quán)利要求33或34的黃病毒載體，其進(jìn)一步包含輔助從膜前蛋白移除所述肽的溶蛋白裂解位點(diǎn)。
36.權(quán)利要求27-35中任一項(xiàng)的黃病毒載體，其中所述異源肽包含流感M2e肽或包含流感血凝素前體蛋白裂解位點(diǎn)(HA0)的肽。
37.權(quán)利要求36的黃病毒載體，其中所述流感病毒為禽流感病毒或人流感病毒。
38.權(quán)利要求27-37中任一項(xiàng)的黃病毒載體，其中所述病毒基因組包含編碼多于一種異源肽的核酸分子，并且所述異源肽包含人和禽流感M2e肽。
39.權(quán)利要求27-38中任一項(xiàng)的黃病毒載體，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)第二位點(diǎn)適應(yīng)。
40.對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求27-39中任一項(xiàng)的黃病毒載體基因組的核酸分子或其互補(bǔ)體。
41.包含權(quán)利要求27-39中任一項(xiàng)的病毒載體的藥物組合物。
42.權(quán)利要求41的藥物組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。
43.權(quán)利要求41或42的藥物組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。
44.權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述佐劑包含鋁化合物。
45.權(quán)利要求44的藥物組合物，其中所述鋁化合物為明礬。
46.給予患者肽的方法，所述方法包括給予患者權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的組合物。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述肽為抗原并且進(jìn)行給藥以誘導(dǎo)對(duì)所述病原體或衍生所述抗原的腫瘤的免疫應(yīng)答。
48.權(quán)利要求47的方法，其進(jìn)一步包括給予亞單位疫苗。
49.權(quán)利要求48的方法，其中同時(shí)給予所述黃病毒載體和亞單位疫苗，以初免劑量給予所述黃病毒載體，以強(qiáng)化劑量給予所述亞單位疫苗，或以初免劑量給予所述亞單位疫苗，以強(qiáng)化劑量給予所述黃病毒載體。
50.權(quán)利要求48或49的方法，其中所述亞單位疫苗包含乙肝病毒核心顆粒，其包含與乙肝病毒核心蛋白融合的異源肽。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述融合的異源肽包含流感M2e肽或包含流感血凝素前體蛋白裂解位點(diǎn)(HA0)的肽。
52.權(quán)利要求27-39中任一項(xiàng)的黃病毒載體、權(quán)利要求40的核酸分子、權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的藥物組合物、權(quán)利要求25的病毒基因組、權(quán)利要求26的病毒載體或權(quán)利要求1-24或46-51中任一項(xiàng)的方法，其中所述異源肽或肽源選擇本文其他部分包括表格和序列附錄列出的。
53.制備病毒載體的方法，所述方法包括向黃病毒的允許所述插入的位點(diǎn)插入編碼相關(guān)肽的序列。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述病毒載體包含黃病毒或嵌合黃病毒。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述插入在所述病毒載體的NS1-236位或所述載體膜前蛋白的氨基端部分進(jìn)行。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述氨基端插入位于衣殼/膜前裂解位點(diǎn)前的-4、-2或-1位，或膜前蛋白的26位。
57.制備藥物組合物的方法，所述方法包括將權(quán)利要求27-39中任一項(xiàng)的黃病毒載體與藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑、佐劑和/或附加活性劑混合。
全文摘要
本發(fā)明提供病毒載體，例如嵌合黃病毒載體，包括插入載體目標(biāo)蛋白的外源肽，制備和使用這些載體的方法以及包這些載體的組合物。
文檔編號(hào)A61K39/12GK101528254SQ200780034274
公開(kāi)日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2007年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者K·V·普加喬夫, A·A·魯緬采夫 申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德生物制劑公司