專利名稱：一種提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)屬于基因輸運(yùn)領(lǐng)域。它可以通過提高細(xì)胞自噬的水平提高非病毒類載體介導(dǎo)的基 因輸運(yùn)的能力，同時對細(xì)胞毒性較低。
背景技術(shù)：
基因輸運(yùn)是基因治療的技術(shù)基礎(chǔ)，基因輸運(yùn)能力直接影響基因治療的效率。目前基因 輸運(yùn)的載體主要包括病毒類載體和非病毒類載體。病毒類載體病毒類載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄
病毒類載體(CN1871356, CN1159210, CN1302334),慢病毒類載體(CN1688323， CN1487841， CN1668751, CN1633495, CN101186915)，腺病毒類載體(CN1857738， CN1650021， CN1570122， CN101072879, CN1147837, CN1113390, CN1218512, CN1314948)等，雖然病毒類載體具有 較高的基因輸運(yùn)能力但是存在安全性的隱患。非病毒類載體包括陽離子脂質(zhì)體核心的載體 (如Lipofectamine2000)，脂質(zhì)體核心的載體(FuGene6)，陽離子聚合物核心的載體 (CN101016550)，多胺類載體，肽類載體(CN1821399)，復(fù)合類載體(CN101016549)及其 他生物材料類載體(CN1786163， CN1375334)等，雖然相對病毒類載體具有較高的安全性但 是其輸運(yùn)能力始終制約著其應(yīng)用。
細(xì)胞自噬是細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏等外界剌激下的應(yīng)激反應(yīng)，通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)將部分胞 質(zhì)和細(xì)胞器包裹形成自噬體后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，將內(nèi)含物消化并重新利用。 細(xì)胞自噬在非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的關(guān)系未見報道，本發(fā)明第一次將細(xì)胞自噬水 平同非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力聯(lián)系在一起，并通過提高細(xì)胞的自噬水平達(dá)到提高非 病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的方法是通過提高細(xì)胞的自噬水平，顯著提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能 力，同時該技術(shù)具有比較低的生物毒性。
技術(shù)方案本發(fā)明提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法是在非病毒類載體介導(dǎo) 的基因輸運(yùn)的同時或之前的2小時內(nèi)提高細(xì)胞的自噬水平。
提高細(xì)胞的自噬水平的方法包括物理，化學(xué)及生物的刺激導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平提高。 能提高細(xì)胞自噬水平的化合物有可樂定(clonidine)，雙氧水(H202)，百草枯 (paraquat),砷鹽(arsenic salts),三苯氧胺(tamoxifen)，灰安毒素-3 (grayanotoxin III),雷帕霉素(rapamycin),氟司必林(fluspirilene),三夫拉嗪(trifluoperazine),
雙氟苯丁哌啶苯并咪唑酮(pimozide),尼卡地平(nicardipine),震顫毒素-A"(penitrem A),尼古地平(niguldipine),氯苯哌酰胺(l叩eraraide)，胺碘酮(amiodarone),海 藻糖(trehalose),氯化鋰(LiCl)。 其中所述的物理刺激為營養(yǎng)缺乏。
所述的生物刺激為導(dǎo)入提高細(xì)胞自噬水平的基因、導(dǎo)入細(xì)胞自噬抑制基茵的SiRNA, ShRNA、拮抗劑或病毒接觸。所述的導(dǎo)入提高細(xì)胞自噬水平的基因包括表達(dá)產(chǎn)物直接提高細(xì) 胞自噬水平的基因；表達(dá)產(chǎn)物間接提高細(xì)胞自噬水平的基因；表達(dá)產(chǎn)物拮抗自噬抑制基因。
所述的導(dǎo)入提高細(xì)胞自噬水平的基因包括表達(dá)產(chǎn)物直接提高細(xì)胞自噬水平的基因?yàn)锳tg 基因系列；表達(dá)產(chǎn)物間接提高細(xì)胞自噬水平的基因?yàn)閜53;表達(dá)產(chǎn)物拮抗自噬抑制基因?yàn)閙TOR 的抑制基因。
所述的拮抗劑為mTOR的SiRNA和ShRNA。
有益效果本技術(shù)通過提高細(xì)胞的自噬水平對非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的提 高有顯著效果，特別是難于轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞[如成骨細(xì)胞(osteoblast)，肌肉細(xì)胞(myotube) 和胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)]。同時利用的非病毒載體的毒性較低，安全性高。


圖l:胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中自噬促進(jìn)劑的作用(Luciferase作為報告基因)；
圖2:成骨細(xì)胞(osteoblast)中自噬促進(jìn)劑的作用(Luciferase作為報告基因)；
圖3:肌肉細(xì)胞(myotube)中自噬促進(jìn)劑的作用(Luciferase作為報告基函〉；
圖4:胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-WT)中自噬促進(jìn)劑的作用(GFP作為報告基因，western blot
檢測)；
圖5:胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-WT)中自噬促進(jìn)劑的作用(GFP作為報告基因，流式細(xì)胞術(shù)檢 測)；
圖6:胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-WT)中p53的作用(kuciferase作為報告基因)；
圖7:成骨細(xì)胞(osteoblast)中p53的作用(Luciferase作為報告基因)；
圖8:肌肉細(xì)胞(myotube)中p53的作用(Luciferase作為報告基因)；
圖9:胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-WT)中同時引入mTOR的SiRNA的作用(Luciferase作為報告
基因)；
圖10:胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-WT)中短時間營養(yǎng)缺乏的作用(Luciferase作為報告基因)； 圖ll: HeLa細(xì)胞中雷帕霉素(r印amycin)對SiRNA輸運(yùn)的影響(GFP作為報告基因)； 圖12: HeLa-LC3細(xì)胞中細(xì)胞自噬促進(jìn)劑，促進(jìn)基因及營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的GFP-LC3的形成； 圖13:胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-WT)中細(xì)胞自噬促進(jìn)劑，促進(jìn)基因及營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的自噬底物p62的降解；
圖14: MEF-Atg5-/-細(xì)胞中自噬促進(jìn)劑的作用(Luciferase作為報告基因)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一在非病毒類載體介導(dǎo)的基因運(yùn)輸?shù)耐瑫r應(yīng)用促進(jìn)細(xì)胞自噬水平提高的化合物
以陽離子脂質(zhì)體為基因輸運(yùn)載體，Luciferase作為報告基因，雷帕霉素(rapamycin)和 海藻糖(trehalose)為提高細(xì)胞自噬水平的化合物。
細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X107孔，過夜培養(yǎng)，待用。 配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，方法如下Lipofectamine2000每孔L5u 1，溶解在100 u 1 DMEM (含 血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min， DNA為每孔2 y g，溶解在100 u 1 DMEM (含血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育 20-25min。
轉(zhuǎn)染過程方法如下過夜培養(yǎng)的細(xì)胞用DMEM (含血清無抗生素)培養(yǎng)基洗漆2次后加入 孵育過的混合物，在37°C， 5%C02培養(yǎng)條件培養(yǎng)30min,補(bǔ)充培養(yǎng)基DMEM完全培養(yǎng)基300 y 1， 同時加入促進(jìn)細(xì)胞自噬的化合物雷帕霉素(r鄰amycin)濃度為0.2uM，海藻糖(trehalose) 濃度為10raM，對照細(xì)胞中加入等體積PBS。
檢測方法如下培養(yǎng)24小時候后收集細(xì)胞，用Luciferase檢測試劑盒(Promega公司) 中細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用Luciferase檢測試劑盒(Promega公司)進(jìn)行細(xì)胞裂解液中 Lucif erase活力檢測，同時用蛋白濃度試劑盒(碧云天生物公司)測定細(xì)胞裂解液的蛋白濃 度。用蛋白濃度將Luciferase酶活進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
數(shù)據(jù)分析方法如下student' s-T test進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并用Origin做圖。
結(jié)果顯示，在胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中，自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(rapamycin)和海藻糖 (trehalose)能夠提高(147. 88±47. 26) %和(56. 49± 12. 16) %的轉(zhuǎn)染效率，并且與對照 組(只用非病毒類載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染.).比較具有顯著性(見圖1)。
在成骨細(xì)胞(osteoblast)中，自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(rapamycin)和海藻糖(trehalose) 能夠提高46. 95%和(64. 85±25. 39) %的轉(zhuǎn)染效率，并且與對照組比較具有顯著性(見圖2)。
在肌肉細(xì)胞(myotube)中，自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(rapamycin)和海藻糖(trehalose) 能夠提高的(83. 56±20. 58) %和(50. 51±11. 83) %轉(zhuǎn)染效率，并且與對照組比較具有顯著 性(見圖3)。
實(shí)施例二在非病毒類載體介導(dǎo)的基因運(yùn)輸?shù)耐瑫r應(yīng)用促進(jìn)細(xì)胞自噬水平提高的化合物以多胺類轉(zhuǎn)染試劑為基因輸運(yùn)載體，GFP作為報告基因，雷帕霉素(rapamycin)和海藻糖
(trehalose)作為提高細(xì)胞自噬水平的化合物。
細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X104/孔，過夜培養(yǎng)，待用(同實(shí)施例一)。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制，轉(zhuǎn)染過程同實(shí)施例一。
檢測方法如下-
(1) 細(xì)胞培養(yǎng)24小時候后收集，用細(xì)胞裂解液(碧云天公司)裂解細(xì)胞，沸^C煮10min 后，12%SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Amersham公司)。用anti-GFP(Santa Cruz公司)作為一抗，anti-mouse(Promega公司)為二抗，進(jìn)行Western blot。
(2) 細(xì)胞培養(yǎng)24小時后收集并重懸在200 u 1 PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(BD公司)。 結(jié)果顯示，在胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中，自噬促進(jìn)劑明顯增強(qiáng)了細(xì)胞中GFP的表達(dá)量
和表達(dá)GFP細(xì)胞的數(shù)目(見圖4和圖5)。
實(shí)施例三在非病毒類載體介導(dǎo)的基因運(yùn)輸?shù)耐瑫r導(dǎo)入提高細(xì)胞自噬水平的基因(以脂 質(zhì)體為基因輸運(yùn)載體，Luciferase作為報告基因，p53作為提高細(xì)胞自噬水平的基因)。 細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X107孔，過夜培養(yǎng)，待用(同實(shí)施例一)。 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制，方法如下Lipofectamine2000每孔1.5"，溶解在100ul DMEM (含血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min，報告基因DNA為每孔2ug, p53 表達(dá)質(zhì)粒為每孔lug (對照組為p53的空白載體質(zhì)粒)，溶解在100iil DMEM (含血清無抗 生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。 轉(zhuǎn)染過程，檢測方法和數(shù)據(jù)分析方法同實(shí)施例一。
結(jié)果顯示，在胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，成骨細(xì)胞(osteoblast)和肌肉細(xì)胞(myotube) 細(xì)胞中，共同轉(zhuǎn)染自噬促進(jìn)基因p53與對照組(共同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體DNA)相比，轉(zhuǎn)染效率分 別提高(139. 61 ±12. 238)%， (20. 22±0. 996)%和(49. ll士l. 325)%(見圖6， 7和8)。
實(shí)施例四在非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)的同時引入細(xì)胞自噬抑制基因的SiRNA (以 mT0R的SiRNA為例)。
細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X10V孔，過夜培養(yǎng)，待用(同實(shí)施例一)。 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制，方法如下Lipofectamine2000每孔1.5nl，溶解在100yl DMEM (含血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min，報告基因DNA為每孔2y g, mTOR 的SiRNA為每孔1 u g (對照組為陰性對照SiRNA)，溶解在100u 1 DMEM (含血清無抗生素) 培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。 轉(zhuǎn)染過程，檢測方法和數(shù)據(jù)分析方法同實(shí)施例一。
結(jié)果顯示，在胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中，引入raTOR SiRNA組與對照組相比，轉(zhuǎn)染效率 提高(50.23土9. 321)% (見圖9)。
實(shí)施例五在非病毒類載體介導(dǎo)的基因運(yùn)輸之前2小時對細(xì)胞進(jìn)行短暫營養(yǎng)缺乏提高細(xì) 胞自噬水平(以陽離子化合物類轉(zhuǎn)染試劑為基因輸運(yùn)載體，Luciferase作為報告基因)。
細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X104/孔，過夜培養(yǎng)，在進(jìn)行基因輸運(yùn)操作 之前的2小時用DMEM (無血清無抗生素)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待用。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物配置，轉(zhuǎn)染方法，檢測方法和數(shù)據(jù)分析方法同實(shí)施例一。
結(jié)果顯示，在胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中，進(jìn)行短時間營養(yǎng)缺乏的細(xì)胞中Luciferase酶 活比對照組的酶活提高(87.797±11.346) %，并且與對照組比較有顯著性差異(見圖10)。
實(shí)施例六自噬促進(jìn)劑對SiRNA輸運(yùn)能力的影響以陽離子脂質(zhì)體為載體，雷帕霉素 (rapamycin)為自噬促進(jìn)劑，GFP-SiRNA為例。
穩(wěn)定表達(dá)GFP的HeLa細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X 107孔，過夜培養(yǎng)， 待用。
配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，方法如下Lipofectamine2000每孔1.5ul，溶解在100U 1 DMEM (含 血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5miri,SiRNA為每孔2y g，溶解在100 u 1 DMEM (含血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育 20-25min。
轉(zhuǎn)染過程方法如下過夜培養(yǎng)的細(xì)胞用DMEM (含血清無抗生素)培養(yǎng)基洗滌2次后加入 孵育過的混合物，在37°C， 5%C02培養(yǎng)條件培養(yǎng)30min，補(bǔ)充培養(yǎng)基DMEM完全培養(yǎng)基300 P 1， 同時加入促進(jìn)細(xì)胞自噬的化合物雷帕霉素(r印amycin)濃度為0. 2u M，海藻糖(trehalose) 濃度為10mM，對照細(xì)胞中加入等體積PBS。
細(xì)胞培養(yǎng)24小時后熒光顯微鏡下觀察，與轉(zhuǎn)如陰性對照SiRNA組比較，GFP-SiRNA組熒 光強(qiáng)度明顯減弱，說明GFP-SiRNA作用良好。加入雷帕霉素(rapamycin)組較GFP-SiRNA 組熒光強(qiáng)度明顯減弱，說明雷帕霉素(rapamycin)提高了 GFP-SiRNA進(jìn)入細(xì)胞的能力進(jìn)而 提高了其作用(見圖ll)。
實(shí)施例七自噬促進(jìn)劑，自噬促進(jìn)基因和營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的細(xì)胞自噬水平的提高以雷帕 霉素(rapamycin),海藻糖(trehalose)和p53為例。
HeLa—LC3細(xì)胞中加入rapmycin和海藻糖(trehalose)(濃度為0. 2 u M和lOmM)'導(dǎo)入
p53基因(用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)入)，及營養(yǎng)缺乏(DMEM無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng))24小時 后，熒光顯微鏡下可以明顯看出自噬促進(jìn)劑誘導(dǎo)出來的自噬泡樣點(diǎn)狀聚集(見圖12),而對 照組無此現(xiàn)象，說明這些處理能提高細(xì)胞的自噬水平。
胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中加入rapmycin和海藻糖(trehalose)(濃度為和lOmM)，導(dǎo)入 p53基因(用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)入)，及營養(yǎng)缺乏(DMEM無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng))24小時 后，收集細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(碧云天公司)裂解細(xì)胞，沸水煮10min后，15y。SDS-PAGE電泳 后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(A腿rsham公司)。以anti-p62(BI0M0L公司)為一抗， anti-rabbit (Promega公司)為二抗進(jìn)行western blot，結(jié)果顯示這些處理同對照組比較 自噬底物p62都被不同程度降解(見圖13)，說明細(xì)胞自噬水平提高。
實(shí)施例八細(xì)胞自噬水平的提高同提高非病毒類載體基因輸運(yùn)能力之間的關(guān)系以
Lipofectamine2000為基因輸運(yùn)載體，Luciferase作為報告基因，雷帕霉素(rapamycin)和
海藻糖(trehalose)為提高細(xì)胞自噬水平的化合物。
MEF-Atg5-/-細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X107孔，過夜培養(yǎng)，待用。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制，轉(zhuǎn)染過程，檢測方法和數(shù)據(jù)分析方法同實(shí)施例一。
結(jié)果顯示，在缺失了 Atg5的MEF細(xì)胞中，雷帕霉素(rapamycin)和海藻糖(trehalose)
對Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率沒有提高的作用(見圖14)，說明在Atg5介導(dǎo)的細(xì)胞的自
噬無法發(fā)生的細(xì)胞中自噬促進(jìn)劑無法起作用。
權(quán)利要求
1、一種提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法，其特征在于在非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)的同時或之前的2小時內(nèi)提高細(xì)胞的自噬水平。
2、 如權(quán)利要求l所述的提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法， 其特征在于所述 的提高細(xì)胞的自噬水平的方法包括物理，化學(xué)及生物的刺激導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平提高。
3、 如權(quán)利要求l所述的提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法，其特征在于所述 的化學(xué)刺激是采用化合物刺激提高細(xì)胞自噬水平，能提高細(xì)胞自噬水平的化合物有可樂定、 雙氧水、百草枯、砷鹽、三苯氧胺、灰安毒素-3、雷帕霉素、氟司必林、三夫拉嗪、 雙氟苯丁哌啶苯并咪唑酮、尼卡地平、震顫毒素-A、尼古地平、氯苯哌酰胺、胺碘酮、 海藻糖和氯化鋰。
4、 如權(quán)利要求l所述的提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法，其特征在于所述 的物理刺激為營養(yǎng)缺乏。
5、 如權(quán)利要求l所述的提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法，其特征在于所述 的生物刺激為導(dǎo)入提高細(xì)胞自噬水平的基因、導(dǎo)入細(xì)胞自噬抑制基因的SiRNA， ShRNA、拮抗 劑或病毒接觸。
6、 如權(quán)利要求l所述的提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法，其特征在于所述 的導(dǎo)入提高細(xì)胞自噬水平的基因包括表達(dá)產(chǎn)物直接提高細(xì)胞自噬水平的基因；表達(dá)產(chǎn)物間接 提高細(xì)胞自噬水平的基因；表達(dá)產(chǎn)物拮抗自噬抑制基因。
7、 如權(quán)利要求l所述的提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法，其特征在于所述 的導(dǎo)入提高細(xì)胞自噬水平的基因包括表達(dá)產(chǎn)物直接提高細(xì)胞自噬水平的基因?yàn)锳tg基因系 列；表達(dá)產(chǎn)物間接提高細(xì)胞自噬水平的基因?yàn)閜53;表達(dá)產(chǎn)物拮抗自噬抑制基因?yàn)閙TOR的抑 制基因。
8、 如權(quán)利要求l所述的提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法，其特征在于所述 的掊抗劑為mTOR的SiRNA和ShRNA。
全文摘要
本發(fā)明提高非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的方法是在非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)的同時或之前的2小時內(nèi)提高細(xì)胞的自噬水平。提高細(xì)胞的自噬水平的方法包括物理，化學(xué)及生物的刺激導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平提高。本發(fā)明通過提高細(xì)胞的自噬水平對非病毒類載體介導(dǎo)的基因輸運(yùn)能力的提高有顯著效果，特別是難于轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞[如成骨細(xì)胞(osteoblast)，肌肉細(xì)胞(myotube)和胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)]。同時利用的非病毒載體的毒性較低，安全性高。
文檔編號C12N15/63GK101338297SQ200810119119
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者樂 于, 溫龍平, 娜 滿, 芳 鄭 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)