一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法。本發(fā)明是利用負(fù)載膜將所篩選菌株接種到印跡膜上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所分泌的脂肪酶結(jié)合到印跡膜，再利用脂肪酶催化酯類水解的產(chǎn)物可與顯色劑顯色的原理對(duì)分泌型脂肪酶基因工程菌進(jìn)行高通量篩選。本發(fā)明可篩選到具有特殊性能的分泌型脂肪酶基因工程菌，尤其是耐高溫、耐甲醇等脂肪酶基因工程菌株。本發(fā)明可對(duì)大量脂肪酶工程菌突變庫進(jìn)行高通量篩選，在獲得篩選高效性的同時(shí)，保證了亞克隆庫的完整性，以便于實(shí)現(xiàn)對(duì)亞克隆庫多種條件下的篩選，適用范圍廣，操作簡單便捷，結(jié)果準(zhǔn)確。
【專利說明】一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡 高通量篩選方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑之一，可以催化脂解、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng) 用于食品行業(yè)，造紙行業(yè)，皮革行業(yè)，飼料行業(yè)，醫(yī)藥催化合成，油脂奶酪加工及生物柴油生 產(chǎn)等行業(yè)。然而，脂肪酶本身是一種蛋白質(zhì)，必須在一定的條件下才能發(fā)揮其催化作用，一 旦外界條件諸如溫度、pH及有機(jī)溶劑濃度等改變的情況下就容易失活。為了獲得酶活力更 高、性能更加穩(wěn)定的脂肪酶，目前研宄人員通常采用分子進(jìn)化、定點(diǎn)突變等方法對(duì)脂肪酶進(jìn) 行改造，而這些方法都涉及脂肪酶突變文庫的構(gòu)建及高通量篩選等步驟。一種高效的高通 量篩選方法是保證突變文庫順利進(jìn)行篩選的關(guān)鍵因素。
[0003] 目前通常的脂肪酶高通量篩選方法是指示劑顯色法及水解圈法。這些方法涉及粗 酶大量發(fā)酵及酶活力測(cè)定等步驟，工作量大，耗費(fèi)時(shí)間長。已有改進(jìn)方法是對(duì)硝基苯酚顯色 法，通過將對(duì)硝基苯酚酯直接鋪在突變庫菌株的表面，再根據(jù)顏色反應(yīng)篩選脂肪酶活力高 的菌株。該方法雖在篩選效率上有所提高，但是這些方法在保證亞克隆庫的完整性及特殊 條件下的篩選（如高甲醇濃度、高pH等）存在著一定的局限性。因此，迫切需要獲得一種 新型脂肪酶基因工程菌株的高通量篩選方法，既要保證篩選的高效性，又要保證亞克隆庫 的完整性，以便于實(shí)現(xiàn)對(duì)亞克隆庫多種條件下的篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法。該 方法能夠篩選具有特殊性能的如耐高溫、耐甲醇及產(chǎn)酶活力高的分泌型脂肪酶基因工程 菌。
[0005] 本發(fā)明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征在于，包括 以下步驟：
[0006] (1)、將分泌型脂肪酶基因工程菌接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，所述的分泌型脂 肪酶基因工程菌含有能夠表達(dá)脂肪酶的表達(dá)載體，該表達(dá)載體上含有正常的或者經(jīng)過突變 的脂肪酶基因表達(dá)盒；
[0007] (2)、將負(fù)載膜平置于步驟（1)中的接種有分泌型脂肪酶基因工程菌的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基上，使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落轉(zhuǎn)移到負(fù)載膜上；
[0008] (3)、將印跡膜放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，再將步驟⑵中轉(zhuǎn)移了菌落的負(fù)載膜的含菌 落面正面朝向上置于印跡膜上，并根據(jù)被篩選工程菌菌株的最佳生長溫度進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的脂肪酶基因充分表達(dá)；
[0009] (4)、將步驟（3)中的印跡膜取出，用緩沖液充分清洗，洗膜結(jié)束后將印跡膜取出， 將其浸在顯色溶液中，靜置一段時(shí)間直至顏色顯現(xiàn)，將印跡膜取出，再用緩沖液充分清洗；
[0010] (5)、觀測(cè)印跡膜的顯色情況，所顯顏色越深說明其菌株所產(chǎn)脂肪酶活力越高，根 據(jù)印跡膜上顏色較深點(diǎn)的相應(yīng)位置確定在已保存的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上表達(dá)該脂肪酶的相應(yīng)位 置。
[0011] 所述的分泌型脂肪酶基因工程菌，優(yōu)選為酵母或細(xì)菌。
[0012] 所述的酵母，優(yōu)選為畢赤酵母。
[0013] 所述的畢赤酵母，優(yōu)選為畢赤酵母GS115或畢赤酵母X33。
[0014] 所述的能夠表達(dá)脂肪酶的表達(dá)載體，優(yōu)選為酵母表達(dá)載體，所述的酵母表達(dá)載體 為能將蛋白分泌到胞外的表達(dá)載體。
[0015] 所述的酵母表達(dá)載體，優(yōu)選為酵母表達(dá)載體pPIC9K或酵母表達(dá)載體pPICZaA。
[0016] 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為相應(yīng)菌株的最適生長培養(yǎng)基，優(yōu)選為MD固定培養(yǎng)基或YH)固 體培養(yǎng)基。
[0017] 所述的負(fù)載膜為能在菌落轉(zhuǎn)移中起負(fù)載作用并能夠支撐菌株生長的薄膜，優(yōu)選為 醋酸纖維素膜或?yàn)V紙膜，負(fù)載膜的大小與培養(yǎng)皿相適應(yīng)。
[0018] 所述的印跡膜為具有一定通透性、菌株能夠透過其吸取下層營養(yǎng)物質(zhì)且能夠高效 吸附分泌蛋白的薄膜，優(yōu)選為硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜，所述的印跡膜，其孔徑大小 優(yōu)選為〇. 22?0. 45 ym，印跡膜的大小與培養(yǎng)皿相適應(yīng)。
[0019] 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為分泌型脂肪酶基因工程菌表達(dá)脂肪酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選為添加 了 0. 5?1 %甲醇的BMMY培養(yǎng)基。
[0020] 配制好液體的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)基后分別倒入培養(yǎng)皿中形成固體培養(yǎng)基，所 述的培養(yǎng)皿為方形或圓形，優(yōu)選為圓形，直徑大小為5?15_，優(yōu)選為9_。
[0021] 步驟（3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)選為12?48h。
[0022] 所述的緩沖液為具有合適pH值、乳化劑等能夠使目的脂肪酶穩(wěn)定的緩沖液，優(yōu)選 為添加了 〇? 75mg/mL NaCl、l% Trriton X-100 的 pH8. 0 磷酸緩沖液。
[0023] 所述的顯色溶液為一種能夠被脂肪酶水解的酯類和一種能夠與該酯類顯色的顯 色劑組合，優(yōu)選為：fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕櫚酸酯水溶液，所述的 fastblue RR 萘醋水溶液含萘醋 0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的 fastblue B 萘 基棕櫚酸醋水溶液含萘醋〇? 6mg/ml，fastblue B 0? 2mg/ml。
[0024] 優(yōu)選，在步驟（3)和（4)之間還包括步驟：將印跡膜置于高溫下及高濃度的有機(jī)溶 液中進(jìn)行處理，從而在之后的步驟中獲得該溫度下及該濃度的有機(jī)溶液下酶活穩(wěn)定的脂肪 酶及其菌株。
[0025] 所述的將印跡膜置于高溫下，優(yōu)選溫度為不低于55°C，所述的高濃度的有機(jī)溶液， 優(yōu)選為55 %的甲醇水溶液。
[0026] 本發(fā)明中涉及到印跡膜的顯色，顯色原理為：脂肪酶與能被其水解的酯類發(fā)生作 用，生成能與顯色劑進(jìn)行顯色的物質(zhì)，通過顏色作為初步篩選的依據(jù)。
[0027] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0028] (1)、可高通量地篩選分泌型脂肪酶的基因工程菌，更優(yōu)選的，能夠高通量篩選到 具備特殊性能脂肪酶基因工程菌；
[0029](2)、方便快捷，節(jié)約成本，結(jié)果靈敏準(zhǔn)確；
[0030](3)、本發(fā)明的方法不涉及對(duì)菌株進(jìn)行直接添加化學(xué)物質(zhì)，不會(huì)影響菌株的生長及 活性，保證亞克隆庫的完整性，以便于實(shí)現(xiàn)對(duì)亞克隆庫多種條件下的篩選；
[0031] (4)、本發(fā)明操作步驟簡單，材料價(jià)格低廉容易獲得；
[0032] (5)、本發(fā)明適用范圍廣泛，適用于細(xì)菌、酵母、真菌等。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0033] 圖1是本發(fā)明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法的示意圖，其 中（1)為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上放置負(fù)載膜（左側(cè)，淺藍(lán)色表示），在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上放置印跡膜 (右側(cè)，黃色表示）；（2)將負(fù)載膜180°翻轉(zhuǎn)使菌落面正面朝上并轉(zhuǎn)移到印跡膜上，并進(jìn)行 誘導(dǎo)培養(yǎng)，菌株產(chǎn)生的脂肪酶印跡到印跡膜上；（3)培養(yǎng)結(jié)束后將帶有脂肪酶的印跡膜轉(zhuǎn) 移到另一個(gè)器皿中；（4)在膜上分別添加緩沖液、甲醇及顯色溶液處理；(4)染色結(jié)果，顏 色深的為陽性克隆；
[0034] 圖2是對(duì)不同產(chǎn)酶能力大小的分泌型脂肪酶基因工程菌的篩選結(jié)果，其中，1?6 為不同產(chǎn)脂肪酶活力的米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌，9K為將pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢 赤酵母GS115的基因工程菌，作為陰性對(duì)照；
[0035] 圖3是對(duì)脂肪酶突變文庫進(jìn)行高通量篩選的結(jié)果，箭頭所示A1?A5菌株為所挑 選的產(chǎn)脂肪酶能力較大的基因工程菌菌株；
[0036] 圖4是在脂肪酶基因工程菌突變文庫中對(duì)耐高溫脂肪酶基因工程菌菌株進(jìn)行高 通量篩選的結(jié)果，箭頭所示B1及B2菌株為所挑選的耐高溫脂肪酶基因工程菌菌株；
[0037] 圖5是在脂肪酶基因工程菌突變文庫中對(duì)耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株進(jìn)行高 通量篩選的結(jié)果，箭頭所示C1?C6菌株為所挑選的耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株。

【具體實(shí)施方式】：
[0038] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0039] MD固體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、BMMY固體培養(yǎng)基、磷酸緩沖液的配制方法為現(xiàn)有 技術(shù)。
[0040] 質(zhì)粒pPIC9K、畢赤酵母GS115、畢赤酵母X33均購自LifeTechnologies公司。
[0041] 濾紙膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、醋酸纖維素膜及PVDF膜均購自上海生物工程股 份有限公司。
[0042] 其他沒有詳細(xì)說明的技術(shù)步驟均為本領(lǐng)域人員所熟知的方法。
[0043] 實(shí)施例1 :不同產(chǎn)酶活力的脂肪酶基因工程菌的篩選
[0044] 將米黑根毛霉脂肪酶基因rml與pPIC9K質(zhì)粒同時(shí)用EcoR I及Not I雙酶切，用 T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后細(xì)胞涂布于含有l(wèi)〇〇ug/mL 氨芐青霉素的LB平板中，37°C倒置培養(yǎng)12?16h后從平板上挑取2?5個(gè)單菌落，接種 于LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min振搖過夜。用質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA的小量提取， 用EcoRI及Not I雙酶切鑒定，獲得連接成功的pPIC9K-rml質(zhì)粒。將pPIC9K-rml質(zhì)粒用 Sal I進(jìn)行線性化并電轉(zhuǎn)化至宿主菌畢赤酵母GS115上，涂布于MD平板上，28°C培養(yǎng)2-3d 后獲得產(chǎn)酶能力大小不同的米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株。
[0045] 將產(chǎn)酶能力大小不同的6個(gè)米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株（見表1)及 已轉(zhuǎn)化了PPIC9K質(zhì)粒的畢赤酵母GS115工程菌菌株（作為陰性對(duì)照），分別接種于含有MD 固體培養(yǎng)基的直徑為9mm的培養(yǎng)皿上，30°C培養(yǎng)至長出相應(yīng)單菌落；將直徑為9mm的濾紙 膜平置于MD固體培養(yǎng)基上，用涂布棒輕壓使濾紙膜完全濕潤并趕盡氣泡，使所有菌落轉(zhuǎn)移 到濾紙膜上，將該MD固體培養(yǎng)基平板置于4°C保存；在另一個(gè)直徑為9mm的培養(yǎng)皿的添加 了 0. 5%甲醇的BMMY固體培養(yǎng)基平板上平置一張同樣大小的孔徑為0. 2ym的硝酸纖維素 膜，趕出氣泡；將轉(zhuǎn)移了菌落的濾紙膜的菌落面正面朝上置于硝酸纖維素膜上，趕出氣泡， 在30°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)36h;培養(yǎng)結(jié)束后將下層的硝酸纖維素膜取出，用含0. 75mg/mLNaCl、 1%TrritonX-100的pH8. 0磷酸緩沖液洗膜5min，重復(fù)3次，洗膜結(jié)束后將硝酸纖維素膜 取出，將其浸在fastblueRR萘酯水溶液（含萘酯0.4mg/ml，fastblueRR0.2mg/m)中進(jìn) 行顯色，靜置一段時(shí)間直至顯色，再將硝酸纖維素膜取出，同樣用含〇.75mg/mLNaCl、l% TrritonX-100的pH8. 0磷酸緩沖洗膜5min;觀測(cè)硝酸纖維素膜的顯色情況，如圖2所示， 顯紫色的為陽性克隆的產(chǎn)酶能力大小不同的6個(gè)米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株 的蛋白印跡，而陰性對(duì)照并沒有顯色，紫色圈大小與菌落的產(chǎn)酶能力相符。
[0046] 表1.產(chǎn)酶能力大小不同的6個(gè)米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 將分泌型脂肪酶基因工程菌接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，所述的分泌型脂肪酶 基因工程菌含有能夠表達(dá)脂肪酶的表達(dá)載體，該表達(dá)載體上含有正常的或者經(jīng)過突變的脂 肪酶基因表達(dá)盒； (2) 、將負(fù)載膜平置于步驟（1)中的接種有分泌型脂肪酶基因工程菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上， 使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落轉(zhuǎn)移到負(fù)載膜上； (3) 、將印跡膜放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，再將步驟（2)中轉(zhuǎn)移了菌落的負(fù)載膜的含菌落面 正面朝向上置于印跡膜上，并在一定溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)，直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的 脂肪酶基因充分表達(dá)； (4) 、將步驟（3)中的印跡膜取出，用緩沖液充分清洗，洗膜結(jié)束后將印跡膜取出，將其 浸在顯色溶液中，靜置一段時(shí)間直至顏色顯現(xiàn)，將印跡膜取出，再用緩沖液充分清洗； (5) 、觀測(cè)印跡膜的顯色情況，所顯顏色越深說明其菌株所產(chǎn)脂肪酶活力越高，根據(jù)印 跡膜上顏色較深點(diǎn)的相應(yīng)位置確定在已保存的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上表達(dá)該脂肪酶的的相應(yīng)位置。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征 在于，所述的分泌型脂肪酶基因工程菌為酵母或細(xì)菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征 在于，所述的酵母為畢赤酵母，進(jìn)一步為畢赤酵母GS115或畢赤酵母X33。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征 在于，所述的能夠表達(dá)脂肪酶的表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體，進(jìn)一步為酵母表達(dá)載體PPIC9K 或酵母表達(dá)載體pPICZaA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征 在于，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MD固定培養(yǎng)基或YH)固體培養(yǎng)基；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了 0. 5?1 %甲醇的BMMY培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征 在于，所述的負(fù)載膜為醋酸纖維素膜或?yàn)V紙膜，負(fù)載膜的大小與培養(yǎng)皿相適應(yīng)；所述的印跡 膜為硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜，其孔徑大小為0. 22?0. 45 ym，印跡膜的大小與培養(yǎng) 皿相適應(yīng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征 在于，步驟（3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間為12?48h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特征 在于，所述的緩沖液為添加了 〇. 75mg/mL NaCl、l% Trriton X-100的pH8. 0磷酸緩沖液； 所述的顯色溶液為fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕櫚酸酯水溶液，所述的 fastblue RR 萘醋水溶液含萘醋 0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的 fastblue B 萘 基棕櫚酸醋水溶液含萘醋〇? 6mg/ml，fastblue B 0? 2mg/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特 征在于，完成步驟（3)的誘導(dǎo)培養(yǎng)之后，將印跡膜置于高溫下及高濃度的有機(jī)溶液中進(jìn)行 處理，從而在之后的步驟中獲得該溫度下及該濃度的有機(jī)溶液下酶活穩(wěn)定的脂肪酶及其菌 株。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特 征在于，所述的高溫為不低于55°C，所述的高濃度的有機(jī)溶液為55%的甲醇水溶液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/44GK104450866SQ201410576815
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】呂鵬梅, 何東, 王治元, 袁振宏, 羅文 , 劉姝娜, 李志兵, 楊改秀, 楊玲梅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院廣州能源研究所