專利名稱：一種脫毒工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域的一種工程菌，特別是涉及一種脫毒工程菌及其應(yīng)用。
近幾十年來，化學(xué)農(nóng)藥一直是園林農(nóng)業(yè)中控制病蟲草、鼠害的主要手段，其品種和銷量逐年增加?；瘜W(xué)農(nóng)藥在控制病蟲草鼠害提高產(chǎn)量的同時(shí)，也破壞了生態(tài)，污染了環(huán)境，每年50萬余噸的農(nóng)藥用量的70％將流入江河土壤，而且有的農(nóng)藥消解速度慢，空氣中農(nóng)藥濃度將維持一個(gè)相當(dāng)長的時(shí)間，并由于其殘留對水域、食品的污染直接危害了人體健康以及動(dòng)物的安全，污染的地表水又直接污染著地下水，正如偉大導(dǎo)師恩格斯教導(dǎo)的那樣“人類正在承受著大自然所給予的報(bào)復(fù)”。而為確保糧食豐收，農(nóng)藥又是必不可少的，因此，脫毒、凈化水資源，綜合治理水環(huán)境污染刻不容緩，勢在必行。
脫毒工程菌可用于降解被有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑污染的水源、土壤。國外有人已鑒定出耐藥昆蟲中與脫毒有關(guān)的酶類，然后從蚜蟲中分離出控制該酶合成的基因，并將其克隆轉(zhuǎn)入細(xì)菌中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，用于污水處理。但因其基因片段很小，故在細(xì)菌中的表達(dá)效率很低而沒有應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明目的在于構(gòu)建一種載有殺蟲藥劑解毒酶的高脫毒能力的重組質(zhì)粒，并用這種質(zhì)粒處理被有機(jī)磷、氨基甲酸酯、有機(jī)氯類酯化合物污染的水源和土壤，以期有效地治理水環(huán)境污染，拯救保護(hù)人類和人類賴以生存的地球。
本發(fā)明提供的脫毒工程菌如下從對殺蟲藥劑抗性的蚊蟲中分離得到擴(kuò)增500-800倍的酯酶基因，即酯酶Bl,1.3Kb片段(序列見附圖3)，并將其克隆到pRL-439質(zhì)粒中，構(gòu)建pRL-B1重組質(zhì)粒，再用新構(gòu)建的pRL-B1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E,Coli HB101)，并在大腸桿菌中大量表達(dá)，制得帶有含該重組體的酯酶基因的細(xì)菌，即為對有機(jī)磷，氨基甲酸酯，有機(jī)氯類酯化合物有降解作用一種脫毒工程菌。
其具體制備方法(參照附圖1)構(gòu)建重組體pRL-B1質(zhì)粒DNA1、煮沸法制備pRL-439質(zhì)粒DNA(由PWol提供，Ref.Gene,68:119-138,1988)取2ml在37℃振蕩培養(yǎng)過夜的含質(zhì)粒pRL-439的E.Coli HB 101菌液，離心收集菌體，加入700μl溶菌酶緩沖液，吹打混勻后加入17-20μl溶菌酶，沸水浴40秒。離心后吸去沉淀，上清用等體積酚，酚/仿，仿各抽提一次，離心收集上清，加入1/10體積3M NaAc，等體積異丙醇，-20℃沉淀30分鐘。離心后用70％乙醇洗滌DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即得pRL-439質(zhì)粒DNA。2、pRL-439質(zhì)粒DNA酶解片段的分離回收pRL-439質(zhì)粒DNA用適量的E.coR1酶解完全后，在0.7％瓊脂糖低溶點(diǎn)膠上電泳分離，于長波紫外燈下切下含2.7kb的DNA片段的瓊脂糖低溶點(diǎn)膠，切碎后裝入Eppendorf管中，在65-70℃水浴溫5-10分鐘，分別加入等體積酚，酚/仿，仿抽提，離心后收集上清，加入1/10體積3MNaAc，二倍體積無水乙醇沉淀；沉淀用70％乙醇洗滌，真空抽干，適量TE溶解即為2.7kb的pRL-439kb DNA片段。3、煮沸法制備pUC-19B1質(zhì)粒DNA(B1 in GenBank data base.accession no:M32328)取2ml在37℃振蕩培養(yǎng)過夜的含質(zhì)粒pUC-19的E.Coli HB 101菌液，離心收集菌體，加入700μl溶菌酶緩沖液，吹打混勻后加入17-20μl溶菌酶，沸水浴40秒。離心后吸去沉淀，上清用等體積酚，酚/仿，仿各抽提一次，離心收集上清，加入1/10體積3M NaAc，等體積異丙醇，-20℃沉淀30分鐘。離心后用70％乙醇洗滌DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即得pUC-19質(zhì)粒DNA。4、pUC-19質(zhì)粒DNA酶解片段的分離回收pUC-19質(zhì)粒DNA用適量的E.coR1酶解完全后，在0.7％瓊脂糖低溶點(diǎn)膠上電泳分離，于長波紫外燈下切下含1.3kb的DNA片段的瓊脂糖低溶點(diǎn)膠，切碎后裝入Eppendorf管中，在65-70℃水浴溫5-10分鐘，分別加入等體積酚，酚/仿，仿抽提，離心后收集上清，加入1/10體積3M NaAc，二倍體積無水乙醇沉淀；沉淀用70％乙醇洗滌，真空抽干，適量TE溶解即為1.3kb DNA片段。5、pRL-439DNA脫磷反應(yīng)70μl反應(yīng)體系，加入pRL-439(2.7kb片段)15μl，10X緩沖液7μl，雙蒸水42μl,6μl CIP(Alkaline phosphatase)。在37℃溫育30分鐘后，75℃溫育10分鐘。等體積酚/仿，仿各抽提一次，離心收集上清，加入1/10體積3MNaAc，等體積異丙醇，-20℃沉淀30分鐘。離心后用70％乙醇洗滌DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即為脫磷后的pRL-439DNA。6、連接反應(yīng)10μl反應(yīng)體系中，加入1xT4 DNA連接酶緩沖液，0.5μ(1.5U)T4DNA連接酶，1μl 10X緩沖液，1μl(約200ng)載體DNA(即脫磷后的pRL-439的基因片段)，1μl酯酶基因DNA(1.3kb的B1基因片段)，6.5μl雙蒸水。在14-16℃，反應(yīng)16小時(shí)；即為重組體pRL-B1質(zhì)粒DNA。
pRL-B1工程菌(E.coli HB101)的制備1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備接種大腸桿菌HB101于LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約12小時(shí)。挑取單菌落于30ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)移1 ml菌液至50ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4-0.5，離心收集菌體，重懸于25ml冰預(yù)冷的0.1M MgCL2中，冰浴約7分鐘，離心收集沉淀，重懸于25ml 0.1M CaCL2中，冰浴20分鐘，離心后用2ml 0.1M CaCL2懸浮沉淀即為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。2、pRL-B1質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化取200μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入上述(6)連接物，并加50μlTCM(Tris,CaCL2,MgCL2)冰上放置30分鐘，42℃水浴2分鐘，冰浴20-50分鐘，加入37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基1.5ml,37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，離心后用0.1mlTCM重懸沉淀，涂布于含25-50％的氨芐霉素的LB瓊脂板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。在含抗生素的LB瓊脂板上能生長的菌落即為陽性克隆。
pRL-B1工程菌(E.coli HB101)的表達(dá)(1)試劑磷酸緩沖液(pH7.0)含1％ Triton-x 10095％乙醇α-乙酸萘酯溶液111.6mg/ml溶于95％乙醇中β-乙酸萘酯溶液111.6mg/ml溶于95％乙醇中顯色劑五份5％ SDS，二份1％固藍(lán)B(2)實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒pRL-B1的大腸桿菌HB 101的菌液的表達(dá)鑒定取37℃振蕩培養(yǎng)過夜含重組質(zhì)粒pRL-B1的大腸桿菌HB 101的菌液，測初始OD600，然后將菌液分為三組對照組；α-乙酸萘酯組(A組)；β-乙酸萘酯組(B組)。每組都用磷酸緩沖液將細(xì)胞稀釋成六個(gè)濃度梯度于六個(gè)試管中，每管體積2.5ml，對照組加5μl95％的乙醇，A組加5μlα-乙醇萘酯溶液，β組加5μlβ-乙酸萘酯溶液。每組(A、B)都用適量的磷酸緩沖液將相同濃度的藥液(α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯)充分混合使之溶解；對照組加入相同量的乙醇，再加入不同量(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml)的初始OD600細(xì)胞液。37℃振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)后，每管加入500μl新配制的顯色劑，室溫下顯色反應(yīng)15分鐘，分別測定600nm和555nm處的OD值。A組取OD600值，B組取OD555值，分別減去相應(yīng)對照組OD值，作OD-菌液濃度曲線。其OD-菌液濃度曲線的如圖2所示。該曲線表明本發(fā)明提供的脫毒工程菌對α-乙酸萘酯和β-乙酸萘脂這兩種有機(jī)磷酸酯類的代表藥有很強(qiáng)的降解脫毒作用。
載體質(zhì)粒pRL-439的大腸桿菌HB 101的菌液(此作為對照用)取37℃振蕩培養(yǎng)過夜含載體質(zhì)粒pRL-439的大腸桿菌HB 101的菌液，測初始OD600，然后將菌液分為三組對照組；α-乙酸萘酯組(A組)；β-乙酸萘酯組(B組)。每組都用磷酸緩沖液將細(xì)胞稀釋成六個(gè)濃度梯度于六個(gè)試管中，每管體積2.5ml，對照組加5μl95％的乙醇，A組加5μlα-乙酸萘酯溶液，β組加5μlβ-乙酸萘酯溶液。每組(A、B)都用適量的磷酸緩沖液將相同濃度的藥液(α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯)充分混合使之溶解；對照組加入相同量的乙醇，再加入不同量(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml)的初始OD600細(xì)胞液。37℃振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)后，每管加入500μl新配制的顯色劑，室溫下顯色反應(yīng)15分鐘，分別測定600nm和555nm處的OD值。A組取OD600值，B組取OD555值，分別減去相應(yīng)對照組OD值，作OD-菌液濃度曲線。其OD-菌液濃度曲線的如圖2所示。該曲線表明本發(fā)明提供的脫毒工程菌對α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯這兩種有機(jī)磷酸酯類的代表藥有很強(qiáng)的降解作用。
pRL-B1工程菌脫毒功能的表達(dá)鑒定共做了三批實(shí)驗(yàn)，兩批含重組質(zhì)粒pRL-B1，一批含質(zhì)粒pRL-439作為對照。
第一批菌種含重組質(zhì)粒pRL-B1的大腸桿菌的HB 101菌液初始OD600-1.2000表1．pRL-B1組(一)不同細(xì)胞濃度對脫毒的影響及測定結(jié)果瓶號 1 2 3 4 5初始菌液(ml) 1.01.21.51.82.0磷酸緩沖液(ml) 1.51.31.00.70.5對照組OD6000.7618 0.9001 0.8573 1.0736 1.2679A組OD600 1.2088 2.3202 2.7945 3.6483 3.8914(A組-對照組)OD600 0.4480 1.4201 1.9372 2.5747 2.6235對照組OD5550.8565 1.0093 0.9685 1.2049 1.4055B組OD555 1.1039 2.2928 2.9039 4.5000 4.5000B組OD555(B組-對照組)OD555 0.2474 1.2835 1.9354 3.2951 3.0945第二批菌種含重組質(zhì)粒pRL-B1的大腸桿菌HB 101菌液初始OD600=0.6523
表2．pRL-B1組(二)不同細(xì)胞濃度對脫毒的影響及測定結(jié)果瓶號1 2 3 4 5 6初始菌液(ml)0.81.01.21.51.82.0磷酸緩沖液(ml) 1.71.51.31.00.70.5對照組OD600 0.3071 0.3360 0.3590 0.3707 0.2834 0.3371A組OD6001.1213 1.2609 1.4065 1.5113 1.8535 2.1926(A組-對照組)OD600 0.8142 0.9249 1.0475 0.8043 0.5701 1.8555對照組OD555 0.3715 0.4116 0.4431 0.4627 0.3824 0.2899B組OD5551.8826 2.0617 2.2691 2.2518 2.8801 3.2323(B組-對照組)OD555 1.5111 1.6501 1.8260 1.7891 1.4977 2.9424第三批菌種含重組質(zhì)粒pRL-439的大腸桿菌HB 101菌液初始OD600=1.4920表3．pRL-439組不同細(xì)胞濃度對脫毒的影響及測定結(jié)果瓶號 1 2 3 4 5 6初始菌液(ml) 0.81.01.21.41.61.8磷酸緩沖液(ml) 1.71.51.31.10.90.7對照組OD600 0.8806 1.0046 1.1769 1.2737 1.3611 1.4579A組OD600 1.1430 1.2897 1.4921 1.7130 1.7684 1.8951(A組-對照組)OD6000.2624 0.2851 0.3152 0.4393 0.4073 0.4372對照組OD555 1.0072 1.1494 1.3348 1.4410 1.5452 1.6362B組OD555 1.2745 1.4376 1.6069 1.7261 1.8150 1.9649(B組-對照組)OD5550.2673 0.2882 0.2721 0.2851 0.2698 0.3287由以上三組數(shù)據(jù)，作OD-菌液濃度曲線由表1、2、3及圖1，我們可以看出以下兩點(diǎn)其一，pRL-B1組的吸收顯著高于pRL-439組其二，隨著菌液濃度的增加，pRL-B1組的吸收增加明顯，而pRL-439組曲線近于平坦。由此，我們可以判斷在本次實(shí)驗(yàn)中pRL-B1組萘酸生成量顯著，且隨著菌濃度增高生成量明顯增加，而pRL-439組萘酸生成量極少或沒有。由于質(zhì)粒pRL-B1和pRL-439的差別僅在于一個(gè)酯酶B1基因。因此，結(jié)論為萘酸的大量產(chǎn)生是由于脫毒酶B1基因的存在，即該B1基因的表達(dá)明顯促進(jìn)α(β)-乙酸萘酯的分解。由于α(β)-乙酸萘酯是有機(jī)磷、氨基酸酯和有機(jī)氯類酯化合物特征化合物，所以由此可知，新構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRL-B1轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，對有機(jī)磷，氨基酸酯，有機(jī)氯類酯化合物有降解作用，是一種脫毒工程菌，該脫毒上程菌于1997年2月4日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其登記入冊編號CGMCC NO.0290，微生物(株)Escherichia Coli pRL-B1，分類命名Escherichia Coli。重組質(zhì)粒pRL-B1可表達(dá)酯酶B1，并且該酯酶表達(dá)量高，脫毒功能顯著。


附圖1為重組質(zhì)粒pRL-B1的構(gòu)建示意圖。
附圖2為重組質(zhì)粒pRL-B1脫毒功能分析示意圖。
附圖3為脂酶B-I基因片段的全序列。其中橫坐標(biāo)表示初始菌液的體積，單位為ml。
縱坐標(biāo)表示OD的吸收值。
圖中-----表示(A組-對照組)OD600圖中--+--表示(B組-對照組)OD555圖2中的2-1表示第一批含重組質(zhì)粒pRL-B1的大腸桿菌HB101(OD600=1.2000)的不同細(xì)胞濃度對脫毒的影響；2-2表示第二批含重組質(zhì)粒pRL-B1的大腸桿菌HB101(OD600=0.6523)的不同細(xì)胞濃度對脫毒的影響。
2-3表示含pRL-439(對照組)的大腸桿菌HB101(OD600=1.4920)的不同濃度細(xì)胞對脫毒的影響。
權(quán)利要求
1．一種脫毒工程菌，其特征在于它是將酯酶B1基因片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101菌株得到的。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫毒工程菌，其特征在于它保藏于中國微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏登記入冊編號CGMCCNo.0290，微生物(株)Escherichia Coli pRL-B1，分類命名Escherichia Coli。
3．一種權(quán)利要求1所述的脫毒工程菌的應(yīng)用，其特征在于它可用于降解有機(jī)磷、氨基酸酯、有機(jī)氯酯類化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域的一種脫毒工程菌:從對殺蟲藥劑有抗性的蚊蟲中分離到的擴(kuò)增500—800倍的酯酶基因,即酯酶B1,1.3Kb片段,并將其克隆到pRL－439質(zhì)粒中,構(gòu)建pRL－B1重組質(zhì)粒,再用新構(gòu)建的pRL－B1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E,ColiHB101),并在大腸桿菌中大量表達(dá),制得帶有含該重組體的酯酶基因的細(xì)菌,即對有機(jī)磷,氨基甲酸酯,有機(jī)氯類酯化合物有降解作用的脫毒工程菌,其酯酶表達(dá)量高,脫毒功能顯著。
文檔編號C12N15/55GK1211618SQ97100018
公開日1999年3月24日 申請日期1997年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月18日
發(fā)明者喬傳令, 閻艷春 申請人:中國科學(xué)院動(dòng)物研究所