專利名稱：黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制備方法及其專用工程菌及發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中質(zhì)粒DNA疫苗的制備方法及其專用工程菌及高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，特別是涉及一種黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制備方法及其專用工程菌及高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒DNA疫苗是近年來經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男乱呙?，從上世紀(jì)九十年代初期質(zhì)粒DNA疫苗受到了科學(xué)家的關(guān)注，到現(xiàn)在發(fā)展近三十年，已經(jīng)有了長足的發(fā)展。質(zhì)粒DNA疫苗具有高安全性、無載體免疫原性和易于生產(chǎn)等特點(diǎn)，因此，同活病毒和病毒基礎(chǔ)的疫苗相比，其具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。數(shù)百項(xiàng)疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，目前已有4種動(dòng)物用質(zhì)粒 DNA 疫苗及產(chǎn)品上市(Michele AK, David BW.DNA vaccines:ready for primetime Nature Reviews Genetics, 2008，9:776-788.)，人用質(zhì)粒 DNA 疫苗及產(chǎn)品呼之欲出。因此，隨著質(zhì)粒DNA疫苗及產(chǎn)品的快速發(fā)展，建立符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)平臺(tái)成為一個(gè)重大的研究課題。本發(fā)明針對(duì)質(zhì)粒DNA疫苗的發(fā)酵工藝進(jìn)行探索，是質(zhì)粒DNA疫苗大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)展中的基石，其重要性不言而喻。在質(zhì)粒DNA疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中，建立穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA (或簡稱質(zhì)粒)的種子庫非常關(guān)鍵，由于質(zhì)粒DNA (pSVK-CAVA)的分子量比較大，達(dá)到15kb左右，對(duì)于宿主菌是一種沉重的負(fù)擔(dān)，在宿主菌的生長過程中，極易造成質(zhì)粒DNA的不穩(wěn)定性。質(zhì)粒DNA的不穩(wěn)定性，是指工程菌在生長過程中質(zhì)粒DNA發(fā)生變化，結(jié)果不呈現(xiàn)原有的表型特征。質(zhì)粒DNA的不穩(wěn)定可分為兩類:分離不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性(Filomena AQ, Fernanda OIPlasmid DNAfermentation stratagies:1nfluence on plasmid stability and cell physiology.Applied Microbial Biotechnology, 2012，93:2571-2580.)。分離不穩(wěn)定是指在細(xì)胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部質(zhì)粒DNA的丟失；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定則是由于質(zhì)粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，質(zhì)粒DNA的分配不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的結(jié)果都將使我們得不到預(yù)期的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量和質(zhì)量。如果發(fā)生質(zhì)粒DNA的分離不穩(wěn)定，由于部分質(zhì)粒DNA的丟失，工程菌的發(fā)酵過程實(shí)際上是工程菌和不含有質(zhì)粒DNA的宿主菌的混合培養(yǎng)(ClarenceMO，Raelene P，Diane Wj et al.Cultivation of E.coli carrying a plasmid-basedMeasles vaccine construct(4.2kbp pcDNA3F)employing medium optimisation andpH-temperature induction techniques.Microbial Cell Factories,2011， 10:16.do1: 10.1186/1475-2859-10-16.)，在非選擇性條件下，含有質(zhì)粒DNA的工程菌的比生長速率(μ+)往往小于宿主細(xì)胞的比生長速率(μ _)，經(jīng)過25代后，培養(yǎng)液中幾乎都是無質(zhì)粒DNA的細(xì)胞。由此可見，設(shè)計(jì)和篩選一種合適的工程菌來提高質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)率是非常重要的。培養(yǎng)基對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性和質(zhì)粒質(zhì)量也起著非常重要的作用，Silva (Silva, Filomena, Passarinha Lj et al.1nfluence of growth conditions onplasmid DNA production.Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，19(11) :1408-1414.)研究表明質(zhì)粒在以葡萄糖作為碳源時(shí)的丟失頻率大于以淀粉為碳源的培養(yǎng)基。FDA認(rèn)為開環(huán)和線性化質(zhì)粒DNA的治療效果不如超螺旋質(zhì)粒DNA(Food andDrug Administration(FDA), Guidance for industry: considerations for plasmiddeoxyribonucleic acid vaccines for infectious disease indications, 2007, http://www. fda. gov/cber/gdlns/plasdnavac. htm.),然而質(zhì)粒DNA的幾種形態(tài)在純化的過程中很難分開，所以在發(fā)酵過程中應(yīng)該在如何得到高比例的超螺旋質(zhì)粒DNA方面進(jìn)行優(yōu)化(Ying C，Rodriguez S，Hebel H. DNA vaccine manufacture: scale and quality. ExpertReviews Vaccines, 2009, 8 (9) : 1277-1291.)。由此可見,設(shè)計(jì)和篩選一種合適的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基來提高質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)率是至關(guān)重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一個(gè)穩(wěn)定性高、能多次傳代的用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌。本發(fā)明所提供的用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是轉(zhuǎn)化有黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA pSVK-CAVA (或稱PSCK_2PFcGB)的大腸桿菌XLIO-Gold，命名為 E.coli XLIO-Gold/CAVA。將黑色素瘤治療性pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold得到轉(zhuǎn)化菌XLlO-Gold,轉(zhuǎn)化方法包括但不限于Hananhan法、Inoue法、氯化I丐法和電擊轉(zhuǎn)化法。將轉(zhuǎn)化菌XLlO-Gold涂布于LB固體平板培養(yǎng)基，在37°C、200rpm下培養(yǎng)15小時(shí)后挑取單克隆菌落；將單克隆菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后按照1:100進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，12小時(shí)轉(zhuǎn)接傳代I次，可連續(xù)傳代30代；單克隆菌株以及傳代30代以內(nèi)歷次傳代菌株均為轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌。用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌，轉(zhuǎn)化方法為將-70 V保存的100 μ I感受態(tài)細(xì)胞XLlO-Gold于`冰浴中解凍10分鐘，然后加入pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA25-50ng,輕柔混勻后,置冰浴中30分鐘；冰浴結(jié)束后，于42°C水浴中熱擊90秒，后迅速置于冰浴中冷卻3-5分鐘，加入800 μ I無抗性的LB液體培養(yǎng)基，混勻后于37 °C，200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)，得到pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化菌XLIO-Gold。本發(fā)明另一目的是提供一種用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的
高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基。該制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的發(fā)酵培養(yǎng)基ITB，每IL培養(yǎng)基含酪蛋白胨 10_14g，酵母提取物 16-20g，甘油 2. 4-4mL, NH4Cl 0. 75_lg，0. 17moI/LKH2PO4和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO4 O. 168-0. 216g，微量元素 0. 75-lmL。較佳的，每IL培養(yǎng)基含酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3. 05mL，NH4ClIg, 0. 17mol/L KH2PO4 和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 IOOmLjMgSO4 0. 185g，微量元素 ImL0所述發(fā)酵培養(yǎng)基ITB中，微量元素包括=FeCl3 · 6H20 27g/L、ZnCl2 2g/L、CoCl2 · 6H202g/L、Na2MoO4 · 2H20 2g/L、CaCl2 · 2H20 lg/L,或無水 CaCl2 0. 76g/L、CuCl2 · 2H201. 27g/L、H3BO3 0. 5g/L，溶于 I. 2mol/L HCl。所述發(fā)酵培養(yǎng)基ITB中，K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配制方法為用90mL去離子水溶解2. 31g KH2PO4和12. 54g K2HPO4，完全溶解后，用去離子水定容至100mL。
本發(fā)明還一目的是提供一種行之有效的用上述工程菌和發(fā)酵培養(yǎng)基來進(jìn)行黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA生產(chǎn)的方法。本發(fā)明提供的黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產(chǎn)方法，是復(fù)蘇一支所述工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按體積比1:100比例接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)，按照1:100再轉(zhuǎn)接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)左右，得到種子液；將種子液按體積比1:100的量接種于含3L所述發(fā)酵培養(yǎng)基ITB的5L發(fā)酵罐內(nèi)，pH值控制在7.0±0.1，培養(yǎng)溫度為37 °C，溶解氧控制在30%左右，發(fā)酵培養(yǎng)6h ;之后按照lmL/min的流速補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基ITB，總共補(bǔ)加500mL，發(fā)酵15小時(shí)后，結(jié)束發(fā)酵，收菌，提取質(zhì)粒，得到黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA。本發(fā)明還一目的是提供生產(chǎn)黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA種子庫的構(gòu)建方法及種子庫產(chǎn)品。該種子庫的構(gòu)建包括:·
I)制備原始種子庫:將所述工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA菌液0.5mL擴(kuò)大至IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)，加入30%甘油，分裝50管并凍存于-70°C冰箱，得到原始種子庫；2)制備主種子庫:復(fù)蘇一支原始種子接種于12管LB液體培養(yǎng)基中，2次傳代后小提質(zhì)粒，選取質(zhì)粒含量最高的菌液擴(kuò)大至IOOmL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后加入30%甘油，并分裝50管得到主種子庫，凍存于-70°C冰箱，得到主種子庫；3)制備工作種子庫:從主種子庫中取I管菌種，接種于12管LB液體培養(yǎng)基中，2次傳代后小提質(zhì)粒，選取質(zhì)粒含量最高的菌液擴(kuò)大至IOOmL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后加入30%甘油，分裝50管并凍存于-70°C冰箱，得到工作種子庫；每支工作種子庫中的菌種限傳5代用于權(quán)利要求9黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產(chǎn)。以上構(gòu)建得到的包括原始種子、主種子以及工作種子在內(nèi)的種子庫及各種子均為本發(fā)明內(nèi)容。質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性和工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基是影響質(zhì)粒產(chǎn)量的重要因素，本發(fā)明為了能提供一個(gè)穩(wěn)定性高、能多次傳代的用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌以滿足中試工藝的需求，首先通過實(shí)驗(yàn)對(duì)宿主菌進(jìn)行了優(yōu)化篩選，最終發(fā)現(xiàn)大腸桿菌XLlO-Gold是一個(gè)更利于該質(zhì)粒DNA擴(kuò)增的宿主菌，將攜帶質(zhì)粒pSVK-CAVA的工程菌命名為E.coli XLIO-Gold/CAVA，質(zhì)粒pSVK-CAVA以大腸桿菌XLlO-Gold為宿主菌時(shí)，表現(xiàn)出了同常規(guī)質(zhì)粒DNA類似的穩(wěn)定性，能轉(zhuǎn)接傳代30次也未發(fā)生重組或片段丟失，這可能與大腸桿菌XLlO-Gold的特性有關(guān)系，因?yàn)樵摼哂幸粋€(gè)大分子量質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)化基因；除了保持質(zhì)粒DNA在宿主菌中的穩(wěn)定傳代以外，質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝中極為重要的一個(gè)方面是質(zhì)粒DNA的高產(chǎn)量問題，想要得到較高的產(chǎn)品量，必須使攜帶質(zhì)粒的工程菌具有較高的菌體量，一般要經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)基的成分和特殊的發(fā)酵(補(bǔ)料分批發(fā)酵)策略來實(shí)現(xiàn)，而理想的發(fā)酵培養(yǎng)基是獲得高產(chǎn)量的首要條件，因此，分別用單次單因子法和響應(yīng)面法對(duì)其最適培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，單次單因子法優(yōu)化結(jié)果顯示，TB培養(yǎng)基是其最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基，質(zhì)粒的容積產(chǎn)率為9.9mg/L,明顯高于LB和M9培養(yǎng)基；最適碳源和氮源分別是甘油和酪蛋白胨；PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響質(zhì)粒產(chǎn)量的3個(gè)主要影響因子為酵母提取物、甘油、MgSO4，最后經(jīng)過最陡爬坡和CXD優(yōu)化后，確定了工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA發(fā)酵培養(yǎng)基ITB的成份和水平，在500mL搖瓶的發(fā)酵規(guī)模下，質(zhì)粒的容積產(chǎn)率達(dá)到12.38mg/L,是基礎(chǔ)培養(yǎng)基LB發(fā)酵產(chǎn)量的2倍以上。綜上所述，本發(fā)明的工程菌及培養(yǎng)基將在黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA連續(xù)傳代30代，每隔5代抽提質(zhì)粒，用PVU I進(jìn)行單酶切，用PVU I和Spe I進(jìn)行雙酶切的酶切鑒定結(jié)果圖2為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA連續(xù)傳代30代，每隔5代抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖3為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA的平板點(diǎn)種結(jié)果圖4為工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果圖5為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在生化檢測(cè)培養(yǎng)基中的生長情況圖6A為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在4種培養(yǎng)基中隨培養(yǎng)時(shí)間菌密度的變化情況圖6B為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在4種培養(yǎng)基生長的工程菌中質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖7為不同碳源對(duì)工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA質(zhì)粒產(chǎn)量(容積產(chǎn)率)影響的柱狀8為不同氮源對(duì)工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA質(zhì)粒產(chǎn)量(容積產(chǎn)率)影響的柱狀9為三個(gè)顯著影響因子交互作用對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量(容積產(chǎn)率)影響的曲面圖和等值線圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的發(fā)明人前期經(jīng)研究獲得了具有突出原創(chuàng)性的基于甲病毒復(fù)制子載體的新型黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA (參見文獻(xiàn):張亮，閻瑾琦，王越，等.可復(fù)制型抗腫瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的構(gòu)建及體內(nèi)外表達(dá)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,3(6):937-942.該文獻(xiàn)中命名“PSCK_2PFcGB”的可復(fù)制型抗腫瘤DNA疫苗即為本發(fā)明黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA，發(fā)明人為商業(yè)推廣在本發(fā)明中對(duì)該疫苗進(jìn)行了重新命名)，初步藥效學(xué)研究顯示，該疫苗可以有效地誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)特異的細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，能夠有效地抑制移植瘤的生長。目前正在進(jìn)行該疫苗的中試工藝及質(zhì)量控制體系的建立，以促進(jìn)該新型黑色素瘤治療性疫苗的進(jìn)一步發(fā)展?；诩撞《緩?fù)制子載體的質(zhì)粒DNA疫苗一般分子量都較大，能達(dá)到14kb以上，而黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA分子量接近15kb，分子量如此大的質(zhì)粒DNA (命名為“pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA”或“質(zhì)粒DNA pSVK-CAVA”)無論是在上游的設(shè)計(jì)和構(gòu)建，還是到下游的提取和工藝研究，都具有較大的挑戰(zhàn)性。前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在以大腸桿菌DH5ci為宿主菌時(shí)，隨著傳代次數(shù)的增加，該質(zhì)粒DNA疫苗會(huì)發(fā)生分子量變小的情況，代數(shù)越多變小的情況越嚴(yán)重，到最后提取的質(zhì)粒已經(jīng)不是所需要的目的質(zhì)粒，這對(duì)于后續(xù)的中試工藝研究以及產(chǎn)品的發(fā)展極為不利。發(fā)明人進(jìn)一步分析研究，由于質(zhì)粒在宿主菌里發(fā)生了重組或丟失，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于宿主菌本身負(fù)荷過大的問題，也可能是質(zhì)粒分子量過大或由于其源于甲病毒，易發(fā)生重組或片段丟失等自身原因造成的。造成宿主菌里質(zhì)粒發(fā)生重組或片段丟失與質(zhì)粒本身的特性以及宿主菌等都有一定的關(guān)聯(lián)，首先黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA是一種基于病毒的載體，比常規(guī)的質(zhì)粒DNA更易發(fā)生重組或片段丟失；另外，由于該質(zhì)粒pSVK-CAVA自身相對(duì)分子質(zhì)量將近15kb，在宿主菌里復(fù)制時(shí)會(huì)給菌體造成嚴(yán)重的負(fù)荷，從而引發(fā)質(zhì)粒的不穩(wěn)定性增加，產(chǎn)生上述截短質(zhì)粒的情況。想要解決上述問題，發(fā)明人提出篩選質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的最適宜宿主菌，并進(jìn)行培養(yǎng)基成分的優(yōu)化。因此，第一方面，本發(fā)明提供一種用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，其是轉(zhuǎn)化有黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA pSVK-CAVA的大腸桿菌XLIO-Gold，命名為 E. coli XLIO-Gold/CAVA。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)，將黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA pSVK-CAVA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold,轉(zhuǎn)化方法包括但不限于Hananhan法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)87-92頁)、Inoue法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)93-96頁)、氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)96-99頁)、電擊轉(zhuǎn)化法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)99-102頁)。另一方面，本發(fā)明還提供一種用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基(ITB)。每IL該培養(yǎng)基中含酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3. 05mL, NH4Cl Ig, O. 17mol/L KH2PO4 和 O. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 lOOmL，Mg2SO4O. 185g，微量元素 lmL，微量元素包括 FeCl3 · 6H20 27g/L, ZnCl2 2g/L、CoCl2 · 6H202g/L、Na2MoO4 · 2H202g/L、CaCl2 · 2H20 lg/L 或無水 CaCl2 0. 76g/L、CuCl2 · 2H20 I. 27g/L、H3BO3 0. 5g/L，溶于I. 2mol/L HCl ;所述K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配制方法是用90mL去離子水溶解2. 31gKH2PO4和12. 54g K2HPO4，完全溶`解后，用去離子水定容至lOOmL。還一方面，本發(fā)明還提供一種用上述工程菌和高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法。該方法是I)種子液的制備從_70°C復(fù)蘇一支E. coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按1:100接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)。按照1:100再轉(zhuǎn)接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)左右，此時(shí)得到種子液；2)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按照1:100的量種于5L發(fā)酵罐(中試生產(chǎn))內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐內(nèi)含有高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基ITB的量為3L，pH值控制在7. 0±0. I (通過發(fā)酵罐自動(dòng)補(bǔ)入H2SO4和NH3. H2O來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值)，培養(yǎng)溫度為37°C，溶解氧控制在30%左右(當(dāng)溶解氧降低到該值時(shí)，通過補(bǔ)充純氧和提高攪拌速度來調(diào)節(jié))。發(fā)酵培養(yǎng)6h后，按照ImL/min的流速補(bǔ)加高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基ITB，總共補(bǔ)加500mL。發(fā)酵15小時(shí)后，結(jié)束發(fā)酵，收菌，提取質(zhì)粒，得到黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA。本發(fā)明還構(gòu)建多級(jí)種子庫，所述E. coli XLIO-Gold/CAVA工作種子來源于該種子庫。種子庫的構(gòu)建過程包括I)制備原始種子庫JfE. coli XLIO-Gold/CAVA工程菌菌液0. 5mL擴(kuò)大至IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)，加入30%甘油，分裝50管并凍存于-70°C冰箱，得到原始種子庫；2)制備主種子庫:復(fù)蘇一支原始種子接種于12管LB液體培養(yǎng)基中，2次傳代后小提質(zhì)粒，選取質(zhì)粒含量最高的菌液擴(kuò)大至IOOmL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后加入30%甘油，并分裝50管得到主種子庫，凍存于-70°C冰箱，得到主種子庫；3)制備工作種子庫:從主種子庫中取I管菌種，接種于12管LB液體培養(yǎng)基中，2次傳代后小提質(zhì)粒，選取質(zhì)粒含量最高的菌液擴(kuò)大至IOOmL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后加入30%甘油，分裝50管并凍存于-70°C冰箱，得到工作種子庫，每支工作種子庫中的菌種限傳5代，用于黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產(chǎn)。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見:《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.,Russell,David W.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/體積(mg/100ml)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。實(shí)施例中描述到的的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。 實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。 實(shí)施例1、黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高穩(wěn)定性宿主菌的篩選及穩(wěn)定性檢測(cè)將黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)化不同基因型的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ,DHlO β ,ToplO和XL10_Gold，轉(zhuǎn)化方法為Hananhan法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)87-92頁)、Inoue法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)93-96頁)、氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)96-99頁)、電擊轉(zhuǎn)化法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)99-102頁)。以氯化鈣法轉(zhuǎn)化XLlO-Gold為例進(jìn)行示例性說明:pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA的獲得參見文獻(xiàn)(張亮，閻瑾琦，王越，等.可復(fù)制型抗腫瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的構(gòu)建及體內(nèi)外表達(dá)[J],南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，3 (6):937-942.)。該文獻(xiàn)中命名“PSCK-2PFcGB”的可復(fù)制型抗腫瘤DNA疫苗即為本發(fā)明黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗“pSVK-CAVA”，發(fā)明人為商業(yè)推廣在本發(fā)明中對(duì)其進(jìn)行了重新命名。本發(fā)明中pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA即為文獻(xiàn)中介紹的PSCK_2PFcGB質(zhì)粒。從_70°C冰箱中取100 μ I感受態(tài)細(xì)胞XLlO-Gold,立即于冰浴中解凍10分鐘，然后加入pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA25-50ng，輕柔混勻后，置冰浴中30分鐘。冰浴結(jié)束后，于42°C水浴中熱擊90秒，后迅速置于冰浴中冷卻3-5分鐘，向管中加入800 μ I無抗性的LB液體培養(yǎng)基，混勻后于37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因，此時(shí)得到pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化菌XL10_Gold。將轉(zhuǎn)化菌XLlO-Gold涂布于LB(Luria_bertani Medium)固體平板培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g, NaCl 10g,加入蒸懼水溶解，5mol/LNa0H調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至lOOOmL，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆?。LB固體平板培養(yǎng)基則是在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂(15g/L)，高壓滅菌，當(dāng)溫度降至50°C時(shí)加入硫酸卡那霉素至終濃度為20 μ g/mL,以下培養(yǎng)基均為此抗性水平)，在37°C、200rpm下培養(yǎng)15小時(shí)后挑取單克隆菌落，接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后按照1:100進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)(12小時(shí)轉(zhuǎn)接傳代I次)，傳代之前取ImL菌液抽提質(zhì)粒，通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的形態(tài)以及超螺旋比例，紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度，聯(lián)合連續(xù)傳代法(每12小時(shí)轉(zhuǎn)接I代)對(duì)工程菌的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)化有pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA的大腸桿菌XLlO-Gold工程菌連續(xù)傳代30代，每隔5代抽提質(zhì)粒，用PVU I進(jìn)行單酶切，用PVU I和Spe I進(jìn)行雙酶切，酶切鑒定結(jié)果如圖1所示(M:DL15000Marker ；1:質(zhì)粒 pSVK-CAVA ；2:PVU I 單酶切片段；3:PVU I 和 Spe I 雙酶切片段)，用PVU I單切得到14748bp線性化質(zhì)粒片段，用PVU I和Spe I雙酶切得到12751bp和1997bp兩個(gè)DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好。轉(zhuǎn)化有pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA的大腸桿菌XLlO-Gold工程菌連續(xù)傳代30代，每隔5代抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示(1:原代；2:5代；3:10代；4:15代；5:20代；6:25代；7:30代；M:DL15000Marker)，工程 菌表現(xiàn)出良好地遺傳穩(wěn)定性，質(zhì)粒拷貝數(shù)基本保持穩(wěn)定，同時(shí)保持了較高的超螺旋比例。本實(shí)施例用示例的方法對(duì)4種備選宿主菌進(jìn)行篩選，結(jié)果都能成功生長單克??；挑取單克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中大腸桿菌DH5a、DHlO β , Τ0Ρ10在傳代2次以后均出現(xiàn)不同程度的質(zhì)粒重組和丟失，而且往下繼續(xù)傳代，這種重組和丟失情況變得更加嚴(yán)重，傳代5次之后就幾乎沒有原質(zhì)粒了。但是大腸桿菌XL10-G0LD能夠很好的保持質(zhì)粒進(jìn)行穩(wěn)定的拷貝，傳代30代后依然很穩(wěn)定，非常適合作為高達(dá)15kb之大的黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌，解決了大質(zhì)粒容易發(fā)生重組和丟失這一難題。本發(fā)明將該轉(zhuǎn)化有pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA的大腸桿菌XL10_Gold，命名為“黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA”。經(jīng)鑒定(參見實(shí)施例2)，該工程菌表現(xiàn)出良好地遺傳穩(wěn)定性，質(zhì)?？截悢?shù)基本保持穩(wěn)定，同時(shí)保持了較高的超螺旋比例。利用該工程菌建立三級(jí)種子庫，可將E.coli XLIO-Gold/CAVA菌液擴(kuò)大至IOOmLLB液體培養(yǎng)基(配方:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g, NaCl 10g,加入蒸懼水溶解,5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至IOOOmL,高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?培養(yǎng)，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)，加入30%甘油，分裝50管并凍存于_70°C冰箱，得到原始種子庫。復(fù)蘇一支原始種子接種于12管LB液體培養(yǎng)基中，2次傳代后小提質(zhì)粒，選取質(zhì)粒含量最高的菌液擴(kuò)大至IOOmL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后加入30%甘油，并分裝50管作為主種子庫，凍存于-70°C冰箱。從主種子庫中取I管菌種，按上述方法操作，凍存50管作為工作種子庫，用于常規(guī)生產(chǎn)。每支工作種子庫中的菌種限傳5代。實(shí)施例2、黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coliXL10-Gold/CAVA的鑒定—、工作種子庫遺傳穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測(cè)37°C水浴加熱復(fù)蘇I支工作種子，按接種于5mL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后1:100傳代，以此方法連續(xù)傳代30代，選原代、5代、10代、15代、20代、25代、30代菌液抽提質(zhì)粒，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳及酶切檢測(cè)工作種子庫的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。結(jié)果工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA連續(xù)傳代30代，每隔5代抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜(見圖2)表明工程菌表現(xiàn)出良好地遺傳穩(wěn)定性，質(zhì)?？截悢?shù)基本保持穩(wěn)定，同時(shí)保持了較高的超螺旋比例；此外，用PVUl單切得到14748bp線性化質(zhì)粒片段，用PVU I和Spe I雙酶切得到12751bp和1997bp兩個(gè)DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好。二、工作種子庫的質(zhì)粒丟失率檢測(cè)對(duì)第30代菌液檢測(cè)質(zhì)粒丟失率，取第30代菌液稀釋后鋪于不含卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，選取100個(gè)單克隆點(diǎn)種于含20iig/mL卡那霉素的LB平板上，在37°C、200rpm下培養(yǎng)15個(gè)小時(shí),計(jì)數(shù)生長的單克隆菌落數(shù),計(jì)算質(zhì)粒丟失率質(zhì)粒丟失率=(100-在平板上長出的菌落數(shù))/100 X 100 %。結(jié)果如圖3所示,生長了 100個(gè)點(diǎn),質(zhì)粒丟失率為0,表明該質(zhì)粒在宿主菌中具有良好的分離穩(wěn)定性，傳代30代后依然保持穩(wěn)定。二、細(xì)菌形態(tài)和革蘭氏染色特征及其生化特征工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA的革蘭氏染色鏡檢圖如圖4 (放大倍數(shù)1000倍)所示，根據(jù)鏡檢顯示，工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA為桿菌，革蘭氏染色為紅色(圖中顯示為深色)，說明是革蘭氏陰性菌。還考察了工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA在含葡萄糖、乳糖、甘露醇三種不同糖類培養(yǎng)基中的生長情況，方法為將工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA以穿刺的方法接種在生化檢測(cè)培養(yǎng)基[配方用鄧亨氏(Dunham)蛋白胨水溶液(蛋白胨lg，氯化鈉0. 5g，水lOOmL，pH7. 6)，每IOOmL加入I. 2mL的0. 2 %溴麝香草酚藍(lán)作指示劑。在培養(yǎng)基中加入瓊脂達(dá)0. 5-0. 7%，分裝于試管，高壓滅菌10分鐘。0. 2%溴麝香草酚藍(lán)溶液配法溴磨香草酹藍(lán)0. 2g, 0. lmol/L Na0H5mL,蒸懼水95mL。
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在37°C、200rpm下培養(yǎng)24小時(shí)，觀測(cè)其發(fā)酵和產(chǎn)氣情況，分析生化特征。結(jié)果如圖5所示，工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA在葡萄糖和甘露醇培養(yǎng)基中出現(xiàn)黃色(圖中淺色部分)，在乳糖培養(yǎng)基中未出現(xiàn)黃色，試管溶液顯示為藍(lán)色(圖中深色部分)，說明工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA能夠發(fā)酵葡萄糖、甘露醇，不能發(fā)酵乳糖，兩種變黃的培養(yǎng)基中都沒有氣泡的產(chǎn)生，說明工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA發(fā)酵過程中不產(chǎn)氣。實(shí)施例3、不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA生長和質(zhì)粒產(chǎn)量(容積廣率)的影響為了找出適合工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA生長和質(zhì)粒生產(chǎn)的培養(yǎng)基，將工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA在四種不同的細(xì)菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)LB——配方胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入蒸餾水溶解，5N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，定容至IOOOmL,高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩B——配方酪蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，加入蒸餾水溶解，定容至900mL，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆?。?dāng)溶液冷卻至50°C時(shí)加入IOOmL無菌的0. 17mol/LKH2PO4,0. 72mol/L K2HPO4溶液。該溶液的配制方法是用90mL去離子水溶解2. 31g KH2PO4和12. 54g K2HPO4,完全溶解后,用去離子水定容至IOOmL并高壓滅菌20min。M9 (葡萄糖)-配方5XM9 鹽溶液 200mL, lmol/LMgS04 2mL, 20 %葡萄糖溶液
20mL, lmol/LCaCl2 0. ImL,滅菌的蒸懼水定容至1000mL。5XM9鹽溶液的配制方法用蒸懼水溶解下列鹽類，終體積為 IL =Na2HPO4.7H20 64g，KHPO4 15g，NaCl 2.5g, NH4Cl 5.0g，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆?。M9 (甘油)--配方:5XM9 鹽溶液 200mL，ImoI/LMgSO4 2mL，20%甘油溶液 20mL，
ImoVLCaCl2 0.lmL，滅菌的蒸餾水定容至lOOOmL。5XM9鹽溶液的配置方法:用蒸餾水溶解下列鹽類，終體積為 IL =Na2HPO4.7H20 64g，KHPO4 15g，NaCl 2.5g, NH4Cl 5.0g，高壓滅菌
后4 C保存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)方法為:復(fù)蘇一支E.coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按1:100接種于5mLLB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，1:100傳代一次后接種于IOOmL上述四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每隔3h取ImL菌夜，一部分用于測(cè)定菌體密度(采用分光光度計(jì)測(cè)定600nm波長的A值一0D600)監(jiān)測(cè)菌體生長情況，一部分用于小量提取質(zhì)粒并測(cè)定質(zhì)粒濃度，發(fā)酵結(jié)束后取IOmL菌液離心洗滌后，烘干并測(cè)菌體干重。菌體的干重通過分析天秤進(jìn)行測(cè)定，具體操作:干燥的EP管，準(zhǔn)確稱重(Gl)，取大腸桿菌發(fā)酵液5mL，8000rmp離心lOmin，棄上清，沉淀用PBS洗滌兩次，將沉淀連同離心管置于烘箱中，80°C干燥至恒重(約24h)，在干燥器中冷卻至室溫，準(zhǔn)確稱重(G2)，菌體干重為G2-G1。最終取每個(gè)發(fā)酵菌液3次平行樣品測(cè)量結(jié)果的平均值。選擇菌體生長情況最佳、質(zhì)粒容積產(chǎn)率最高和質(zhì)粒特異性產(chǎn)率最好的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。在不同培養(yǎng)基中的菌體密度測(cè)定結(jié)果如圖6A所示，菌體生物量、質(zhì)粒容積產(chǎn)率和特異性產(chǎn)率如表I所示，可以看到工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在TB培養(yǎng)基體現(xiàn)出了明顯的生長優(yōu)勢(shì)，特別是容積產(chǎn)率，比LB培養(yǎng)基有了較大的提升。在不同培養(yǎng)基生長的工程菌中質(zhì)粒的I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖6B (M:DL 15000Marker ；1:LB培養(yǎng)基；2:TB培養(yǎng)基；3:M9 (甘油)培養(yǎng)基；4:M9 (葡萄糖)培養(yǎng)基)所示，2號(hào)泳道(TB培養(yǎng)基)的質(zhì)粒濃度和超螺旋的比例均優(yōu)于其它泳道的質(zhì)粒，在質(zhì)粒抽提過程中，用同樣體積的洗脫液進(jìn)行洗脫，即說明了用TB培養(yǎng)基發(fā)酵能夠得到更高的質(zhì)粒產(chǎn)量以及更高的超螺旋比例。因此，選擇TB作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。表I菌體生物量、質(zhì)粒容積產(chǎn)率和特異性產(chǎn)率
權(quán)利要求
1.用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是轉(zhuǎn)化有黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA pSVK-CAVA (或稱PSCK_2PFcGB)的大腸桿菌XLIO-Gold，命名為E. coliXLIO-Gold/CAVA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工程菌，其特征在于是將黑色素瘤治療性pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold得到，包括但不限于使用Hananhan法、Inoue法、氯化I丐法和電擊轉(zhuǎn)化法得到轉(zhuǎn)化菌XLlO-Gold ;再將轉(zhuǎn)化菌XLlO-Gold涂布于LB固體平板培養(yǎng)基，在37°C、200rpm下培養(yǎng)15小時(shí)后挑取單克隆菌落；將單克隆菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后按照1:100進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，12小時(shí)轉(zhuǎn)接傳代I次，可連續(xù)傳代30代；單克隆菌株以及傳代30代以內(nèi)歷次傳代菌株均為轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工程菌，其特征在于為用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌，轉(zhuǎn)化方法包括將_70°C保存的100 ill感受態(tài)細(xì)胞XLlO-Gold于冰浴中解凍10分鐘，然后加入pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA25-50ng，輕柔混勻后，置冰浴中30分鐘；冰浴結(jié)束后，于42°C水浴中熱擊90秒，后迅速置于冰浴中冷卻3-5分鐘，加入800 U I無抗性的LB液體培養(yǎng)基，混勻后于37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)，得到pSVK-CAVA質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化菌XLlO-Gold0
4.一種用于制備黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的發(fā)酵培養(yǎng)基ITB，每IL培養(yǎng)基含酪蛋白胨 10_14g，酵母提取物 16-20g，甘油 2. 4-4mL, NH4Cl 0. 75_lg，0. 17mol/LKH2PO4 和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO4 0. 168-0. 216g，微量元素 0. 75-lmL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基ITB，其特征在于，每IL培養(yǎng)基含酪蛋白胨12g，酵母提取物 16. 61g,甘油 3. 05mL, NH4Cl Ig, 0. 17mol/L KH2PO4 和 0. 72mol/LK2HP04 混合溶液 IOOmL, MgSO4 0. 185g，微量元素 ImL0
6.根據(jù)權(quán)利要求4`或5所述發(fā)酵培養(yǎng)基ITB，其特征在于，微量元素包括=FeCl3 6H2027g/L、ZnCl2 2g/L、CoCl2 6H20 2g/L、Na2MoO4 2H20 2g/L、CaCl2 2H201g/L，或無水 CaCl20. 76g/L、CuCl2 2H20 I. 27g/L、H3BO3 0. 5g/L，溶于 I. 2mol/LHCl。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的發(fā)酵培養(yǎng)基ITB，其特征在于=K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配制方法為用90mL去離子水溶解2. 31g KH2PO4和12. 54g K2HPO4，完全溶解后，用去離子水定容至lOOmL。
8.—種黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產(chǎn)方法，是復(fù)蘇一支權(quán)利要求I或2或3所述工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按體積比1:100比例接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)，按照1:100再轉(zhuǎn)接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)左右，得到種子液； 將種子液按體積比1:100的量接種于含3L權(quán)利要求4或5或6或7所述發(fā)酵培養(yǎng)基ITB的5L發(fā)酵罐內(nèi)，pH值控制在7. 0±0. I，培養(yǎng)溫度為37°C，溶解氧控制在30%左右，發(fā)酵培養(yǎng)6h ;之后按照lmL/min的流速補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基ITB,總共補(bǔ)加500mL,發(fā)酵15小時(shí)后，結(jié)束發(fā)酵，收菌，提取質(zhì)粒，得到黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA。
9.工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA種子庫的構(gòu)建方法，包括 I)制備原始種子庫將權(quán)利要求I或2或3所述工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA菌液`0.5mL擴(kuò)大至IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)，加入30%甘油，分裝50管并凍存于-70°C冰箱，得到原始種子庫； 2)制備主種子庫:復(fù)蘇一支原始種子接種于12管LB液體培養(yǎng)基中，2次傳代后小提質(zhì)粒，選取質(zhì)粒含量最高的菌液擴(kuò)大至IOOmL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后加入30%甘油，并分裝50管得到主種子庫，凍存于-70°C冰箱，得到主種子庫； 3)制備工作種子庫:從主種子庫中取I管菌種，接種于12管LB液體培養(yǎng)基中，2次傳代后小提質(zhì)粒，選取質(zhì)粒含量最高的菌液擴(kuò)大至IOOmL LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后加入30%甘油，分裝50管并凍存于-70°C冰箱，得到工作種子庫；每支工作種子庫中的菌種限傳5代用于權(quán)利要求9黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產(chǎn)。
10.權(quán)利要求9所述方法構(gòu)建得到的工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA種子庫，包括原始種子、主種子及工作種子。·
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制備方法及其專用工程菌及高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述工程菌是轉(zhuǎn)化有黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA pSVK-CAVA的大腸桿菌XL10-Gold，命名為E.coli XL10-Gold/CAVA。每1L高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基含酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH4Cl 1g，0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/L K2HPO4混合溶液100mL，MgSO4 0.185g，微量元素1mL。本發(fā)明的工程菌穩(wěn)定性高、能連續(xù)傳代30次以上，能滿足質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA中試工藝的需要，利用高產(chǎn)培養(yǎng)基發(fā)酵后獲得的質(zhì)粒容積產(chǎn)率高，可用在黑色素瘤治療性DNA疫苗pSVK-CAVA的發(fā)酵生產(chǎn)中。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103215216SQ20131013156
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者于繼云, 閻瑾琦, 王宇, 徐元基, 張巍, 吳昊, 張亮, 朱曉明 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所