專利名稱：尼可霉素x組分高產(chǎn)工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素基因工程領(lǐng)域。具體地講涉及從一株圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)CGMCC 4.321克隆了尼可霉素生物合成基因sanU，使sanU基因與黒色素生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子(Pmel)連接，之后克隆在單拷貝整合型質(zhì)粒pSET152的多克隆位點(diǎn)上，然后轉(zhuǎn)化野生型圈卷產(chǎn)色鏈霉菌CGMCC 4.321原生質(zhì)體，得到的重組工程菌的尼可霉素X組分產(chǎn)量比野生型菌株高2倍左右。該高產(chǎn)工程菌可在制備抗生素藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)CGMCC 4.321是從我國(guó)東北土壤中分離到的尼可霉素產(chǎn)生菌。尼可霉素是一類核苷肽類抗生素，因其結(jié)構(gòu)與幾丁質(zhì)合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺相類似，竟?fàn)幮砸种茙锥≠|(zhì)合成，從而具有殺真菌、昆蟲、螨蟲的效果。又因其在自然界中易分解及對(duì)哺乳動(dòng)物、植物低毒或無(wú)毒，故是一種理想的農(nóng)用和醫(yī)用抗生素。
尼可霉素生物合成途徑尚未研究清楚。現(xiàn)有研究表明，在圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)中，有近30個(gè)基因參與尼可霉素的生物合成。對(duì)這些基因的研究不僅有助于弄清尼可霉素生物合成途徑，而且可能獲得高產(chǎn)和定向組分的工程菌，為下一步尼可霉素組合生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株通過基因工程改造的高產(chǎn)尼可霉素X組分的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)以及構(gòu)建該重組工程菌的方法。利用本發(fā)明的工程菌可使尼可霉素X組分產(chǎn)量比野生菌株高2倍左右。本發(fā)明所使用的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌是由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的，其原保藏號(hào)為CGMCC 4.321。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種使圈卷產(chǎn)色鏈霉菌高產(chǎn)尼可霉素X組分的如SEQ ID No.1(或

圖1)所示的sanU基因；和一種含有該基因所構(gòu)建的尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌重組質(zhì)粒；并由該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)原生質(zhì)體獲得重組工程菌。本發(fā)明的最終目的還在于使該高產(chǎn)工程菌在制備抗生素藥物中的應(yīng)用，以顯示本發(fā)明獲得的顯著進(jìn)步。
為了達(dá)到本發(fā)明的上述目的，涉及如下技術(shù)步驟(1)利用包括部分sanO基因序列的1.35kb BamHI-ApaI片段(聶麗平，張集慧，譚華榮，微生物學(xué)報(bào)，41(1)59-64，2001)為探針，從圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)的cosmid文庫(kù)中克隆到10.6kbPstI片段。
(2)繪制該10.6kb PstI片段的物理圖譜，對(duì)此片段進(jìn)行亞克隆、序、拼接。
(3)用軟件FramePlot2.3.1對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行開放閱讀框分析，找到一個(gè)468bp的開放閱讀框，命名為sanU基因。
(4)采取基因阻斷的方法對(duì)sanU基因的功能進(jìn)行研究。把能在鏈霉菌中表達(dá)的卡那霉素抗性基因通過合適的酶切位點(diǎn)連接在sanU基因內(nèi)部，而后克隆到溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKC1139，構(gòu)建用于阻斷sanU基因的重組質(zhì)粒。
(5)把上述重組質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入圈卷產(chǎn)色鏈霉菌中，經(jīng)溫敏試驗(yàn)、抗性篩選、Southern雜交驗(yàn)證后，選擇正確的sanU基因破壞菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測(cè)定發(fā)現(xiàn)，sanU基因破壞菌株的尼可霉素產(chǎn)量大大降低。說(shuō)明sanU基因是圈卷產(chǎn)色鏈霉菌尼可霉素生物合成的重要基因。
(6)構(gòu)建尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌。把sanU基因連接到黒色素生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子(Pmel)下，然后克隆在單拷貝整合型質(zhì)粒pSET152的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化野生型圈卷產(chǎn)色鏈霉菌原生質(zhì)體，經(jīng)抗性篩選、Southern雜交驗(yàn)證，選擇正確的工程菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)HPLC分析。發(fā)現(xiàn)工程菌的尼可霉素X組分產(chǎn)量比野生菌株高2倍左右。
(7)抑菌試驗(yàn)表明，尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌具有更強(qiáng)的抑菌能力。
以上所述技術(shù)步驟，是本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)技術(shù)人員都能理解和實(shí)現(xiàn)的。
為了便于理解本發(fā)明，通過附圖予以進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1sanU基因的核苷酸序列圖2根據(jù)sanU基因的核苷酸序列推測(cè)的氨基酸序列圖3用于阻斷sanU基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建示意4用于構(gòu)建尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌重組質(zhì)粒示意5尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析(A為野生菌株，B為尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌)圖6尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)煙草赤星灰霉的抑制作用(中間為野生菌株，周圍為尼可霉素高產(chǎn)工程菌)具體實(shí)施方案通過以下實(shí)施列，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施列1圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)sanU基因的克隆及其功能和尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建(1)sanU基因的克隆A、圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)基因組文庫(kù)中的cosmid1、2、3經(jīng)PstI酶切后，和包括部分sanO基因序列的1.35kb BamHI-ApaI片段(聶麗平，張集慧，譚華榮，微生物學(xué)報(bào)，41(1)59-64，2001)進(jìn)行雜交，根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)回收cosmid3中10.6kb PstI片段，然后克隆在質(zhì)粒M13-的PstI位點(diǎn)。
B、利用不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)10.6kb PstI片段進(jìn)行酶切，選擇合適的酶繪制酶切圖譜。并進(jìn)行亞克隆、測(cè)序、拼接，用軟件FramePlot2.3.1對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行開放閱讀框分析，找到一個(gè)468bp開放閱讀框如SEQ IDNo.1以及圖1所示，其推測(cè)的氨基酸序列和谷氨酸變位酶的S亞基具有23％的一致性。
(2)sanU基因的阻斷A、用限制性內(nèi)切酶XhoI把含sanU基因的1.3kb片段從重組質(zhì)粒pLY001切下，然后克隆在M13-的XhoI上，得重組質(zhì)粒pLY002。利用M13-多克隆位點(diǎn)上的HindIII/KpnI位點(diǎn)把含sanU基因片段克隆到pUC18的相同位點(diǎn)上，得重組質(zhì)粒pLY003。BamHI/KpnI卡那霉素抗性基因片段經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平后連接在上述重組質(zhì)粒sanU基因內(nèi)部經(jīng)補(bǔ)平的BamHI位點(diǎn)，得重組質(zhì)粒pLY004。以HindIII/EcoRI從重組質(zhì)粒pLY004切下外源片段，克隆到溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKC1139，構(gòu)建成用以阻斷sanU基因的重組質(zhì)粒pLY101如圖3所示。
B、質(zhì)粒pLY101轉(zhuǎn)化E.coli ET12567感受態(tài)細(xì)胞，再?gòu)闹刑崛≠|(zhì)粒pLY101，而后轉(zhuǎn)化圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)原生質(zhì)體，利用阿普霉素篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢子，收集孢子，42℃條件下進(jìn)行溫敏試驗(yàn)。質(zhì)粒pKC1139在42℃不能自主復(fù)制，因此，在42℃條件下，只有質(zhì)粒pLY101上sanU基因及其兩側(cè)序列和圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)染色體相應(yīng)序列發(fā)生同源交換的菌株才能在含卡那霉素的平板上生長(zhǎng)。利用阿普霉素來(lái)選擇發(fā)生同源雙交換的菌株，在含卡那霉素的平板上能生長(zhǎng)而在含阿普霉素的平板上不能生長(zhǎng)的菌株可能為發(fā)生雙交換的sanU基因阻斷突變株。
C、提取sanU基因阻斷突變株的總DNA及野生菌株的總DNA，以XhoI酶切，地高辛標(biāo)記的含sanU基因的XhoI片段為探針。雜交后野生菌株出現(xiàn)1.2kb左右雜交帶，阻斷突變株在2.2kb處有雜交帶。
(3)尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建A、黒色素生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子(Pmel)片段被克隆在pUC18的SmaI位點(diǎn)上，得重組質(zhì)粒pUC18-Pmel(-)?；厥蘸瑂anU基因的SalI片段，連接在黒色素生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子(Pmel)下游的Sa/I位點(diǎn)，得重組質(zhì)粒pUC18-Pmel(-)∷sanU。用PvuII從上述重組質(zhì)粒切下外源片段，然后克隆在單拷貝整合型質(zhì)粒pSET152的EcoRV位點(diǎn)上，得重組質(zhì)粒pLY102，如圖4所示。
B、重組質(zhì)粒pLY102轉(zhuǎn)化E.coli ET12567感受態(tài)細(xì)胞，再?gòu)闹刑崛≠|(zhì)粒pLY102，而后轉(zhuǎn)化圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)原生質(zhì)體，利用質(zhì)粒pSET152的阿普霉素抗性來(lái)選擇。
C、提取工程菌株的總DNA，用BamHI酶切，以質(zhì)粒pSETl52整合位點(diǎn)附近的HindIII片段為探針，進(jìn)行雜交驗(yàn)證。
(4)sanU基因阻斷突變株及尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌HPLC分析，結(jié)果如圖5所示。
將上述兩種菌株接種在YEME(0.3％酵母提取物，0.5％蛋白胨，1％葡萄糖，34％蔗糖，0.5％甘氨酸，0.3％麥芽糖提取物，5mM氯化鎂)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別轉(zhuǎn)接同量的菌體到50ml(250ml三角瓶)SP培養(yǎng)基(3％甘露醇，1％淀粉，0.75％酵母提取物，0.5％中性大豆蛋白胨，pH6.0)發(fā)酵5天，過濾菌體，取上清液進(jìn)行HPLC分析。HPLC分析的條件流動(dòng)相A每升溶液中含10mM庚烷磺酸鈉、2ml乙酸；流動(dòng)相B水∶乙腈(6∶4)中含10mM己烷磺酸鈉、2ml乙酸。25分針內(nèi)，流動(dòng)相A從87％到55％再到87％；RPC-18。HPLC分析結(jié)果sanU基因阻斷突變株尼可霉素產(chǎn)量不到作為對(duì)照的野生型菌株產(chǎn)量的10％，而尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌產(chǎn)量是野生型菌株產(chǎn)量的2倍。顯然，尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建成功不僅有理論意義，更重要的是具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)施列2尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌對(duì)煙草赤星灰霉的抑制效果煙草赤星灰霉接種PDA液體培養(yǎng)基(20％土豆汁，2％葡萄糖)中，28℃、220rpm培養(yǎng)6天；培養(yǎng)好的菌液用勻漿機(jī)打勻，按20％的比例和溶化的固體PDA液體培養(yǎng)基(20％土豆汁，2％葡萄糖，0.8％瓊脂)混勻，取100ml混合物倒于直徑15cm的平板中，用打孔器將R2YE(Okanishiet al.，1974；Hopwood and Wright，1978)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6天的野生型菌株及尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌的菌塊分別放在上述培養(yǎng)皿中進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，尼可霉素X組分高產(chǎn)工程菌的抑菌能力明顯比野生型菌株強(qiáng)，如圖6所示。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>尼克霉素X組分高產(chǎn)工程菌及其應(yīng)用<130>譚華榮2003<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>468<212>DNA<213>Streptomyces anschromogenes<400>1gtgaattctg tttgccgtgg aaacggcagg acattcgtcg tgaccagtgt gtcgtcggat 60tcccacatgt ggaacctcgt ttttctccag ttgctgctcg aggagaacgg cgggaacgtg120atcaacctcg gcgcgtgcac tccggacgaa ctggtcatgt ccgaatgcct cagaatccgg180ccggacgcct tggtcatcag cacggtcaac gggcacggcc atatcgacgg cctacggctg240atcagaaaga ttcgcgggca ttcggtgctc gcctccatga aagtcgtcat cggcggaaag300ctcggcgtcc acggttcccg gcaggcggga tcccgggcgg aactggtcgc gaacggcttt360gacgcggtgt tcgaggcgga cgccgatctc gaccggttcc tcgactgcct cggactgggc420acgcccgcgc cgcaacgcgt cgcccctacg gaaatccgga gcacctga 468<210>2<211>155<212>PRT<213>Streptomyces anschromogenes<400>2Val Asn Ser Val Cys Arg Gly Asn Gly Arg Thr Phe Val Val Thr Ser1 5 10 15Val Ser Ser Asp Ser His Met Trp Asn Leu Val Phe Leu Gln Leu Leu20 25 30Leu Glu Glu Asn Gly Gly Asn Val Ile Asn Leu Gly Ala Cys Thr Pro35 40 45Asp Glu Leu Val Met Ser Glu Cys Leu Arg Ile Arg Pro Asp Ala Leu50 55 60Val Ile Ser Thr Val Asn Gly His Gly His Ile Asp Gly Leu Arg Leu65 70 75 80Ile Arg Lys Ile Arg Gly His Ser Val Leu Ala Ser Met Lys Val Val85 90 95Ile Gly Gly Lys Leu Gly Val His Gly Ser Arg Gln Ala Gly Ser Arg100 105 110Ala Glu Leu Val Ala Asn Gly Phe Asp Ala Val Phe Glu Ala Asp Ala115 120 125Asp Leu Asp Arg Phe Leu Asp Cys Leu Gly Leu Gly Thr Pro Ala Pro130 135 140
Gln Arg Val Ala Pro Thr Glu Ile Arg Ser Thr145 150 15權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)尼可霉素X組分的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesansochromogenes)(CGMCC 4.321)重組工程菌，其特征是由含sanU基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(CGMCC 4.321)原生質(zhì)體，得到的一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)(CGMCC4.321)重組工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的sanU基因，它具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，編碼如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有sanU基因的重組質(zhì)粒，其特征是使sanU基因與黑色素生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子(Pmel)連接，然后克隆在單拷貝整合型質(zhì)粒pSET152的多克隆位點(diǎn)上得到的一種含有sanU基因重組質(zhì)粒pLY102。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesansochromogenes)(CGMCC 4.321)重組工程菌在制備尼可霉素X組分藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的sanU基因，在制備尼可霉素X組分藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，在制備尼可霉素X組分藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于抗生素基因工程領(lǐng)域。具體地講涉及從一株圈卷產(chǎn)色鏈霉菌7100(Streptomycesansochromogenes)CGMCC 4.321克隆了尼可霉素生物合成基因sanU，把sanU基因與黒色素生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子(Pmel)連接，之后克隆在單拷貝整合型質(zhì)粒pSET152的多克隆位點(diǎn)上，然后轉(zhuǎn)化野生型圈卷產(chǎn)色鏈霉菌7100 CGMCC 4.321原生質(zhì)體，得到的重組工程菌的尼可霉素X組分產(chǎn)量比野生型菌株高2倍左右。該高產(chǎn)工程菌可在制備抗生素藥物中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1548526SQ0313068
公開日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2003年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月7日
發(fā)明者譚化榮, 李毅榮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所