專利名稱：獲得雄性不育小麥的方法及其專用質(zhì)粒與功能核苷酸片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種獲得雄性不育小麥的方法，實現(xiàn)該方法所用的專用質(zhì)粒與用該方法抑制表達(dá)的目的功能基因。
背景技術(shù)：
雜種優(yōu)勢是生物界的一種普遍現(xiàn)象。利用雜種優(yōu)勢可以顯著提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。作物雄性不育系的選育是雜種優(yōu)勢利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但利用常規(guī)的育種方法來選育不育系存在周期長、見效慢，不育基因單一，對環(huán)境因素影響敏感等問題，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的需要。近年來，通過基因工程創(chuàng)造植物雄性不育系已在一些作物上獲得了成功，為作物雜種優(yōu)勢的利用開創(chuàng)了新的前景。目前利用基因工程創(chuàng)造雄性不育的策略主要是利用花粉發(fā)育的特異啟動子與外源基因嵌合，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物來阻斷花粉發(fā)育的過程從而達(dá)到雄性不育的目的(張愛民等，2000，中國科學(xué)基金3，132-136；Clarke et al.，1991，Plant Cell 3，431-433)。例如利用絨氈層特異啟動子在作物花藥中表達(dá)Barnase基因(汪迎春等，2000，生物工程進(jìn)展3，132-136；Mascarenhas，1990，Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.41，317-338)，破壞花粉絨氈層；轉(zhuǎn)化與致病性相關(guān)基因破壞胼砥質(zhì)壁(Curtis et al.，1996，Plant Science 113，113-119)以及利用反義基因技術(shù)轉(zhuǎn)化絨氈層酶類基因(閻隆飛等，1999，科學(xué)通報 44，2471-2475；Meer et al.，1990，Plant Biol.15，95-109)等。但是，上述技術(shù)都存在著穩(wěn)定性差，對溫度敏感等缺點。
近年來，在植物減數(shù)分裂研究中取得了較大進(jìn)展。Ming等人(Ming Y et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，11416-11421)證實了擬南芥中ASK1基因的缺失會使花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中同源染色體異常分離，最后導(dǎo)致花粉敗育，從客觀上造成了植株的雄性不育，然而該基因的缺失并不影響到大孢子的發(fā)育。該基因在包括擬南芥在內(nèi)的生物中屬于同一個基因家族skp1，其編碼蛋白參與了多種生物中泛素蛋白連接酶復(fù)合體E3的形成(Feldman et al.，1997，Cell 91，221-230；Skowyra et al.，1997，Cell 91，209-219)。
RNA干擾(RNAi)技術(shù)是近年來興起的一種用于研究基因功能的有效手段，其主要原理在于利用在生物體內(nèi)摻入或表達(dá)雙鏈RNA(ds-RNA)，使生物體內(nèi)內(nèi)源的與雙鏈RNA核苷酸序列同源的特異mRNA降解，從而獲得目的基因功能缺失(loss-of-function)后的表型(Scott et al.，2001，Nature 2，110-119；Phillip，2001，Genes &Development 15，485-490；Bryan，2002，Nature Immunology 3，597-599；Fagard etal.，2000，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol 51，167-194)。該技術(shù)與篩選插入失活(gene knock-out)的突變體相比，具有簡便易行，工作量小的特點；而與單純表達(dá)反義RNA相比，又具有對目的基因表達(dá)抑制顯著，獲得的轉(zhuǎn)化個體往往可以呈現(xiàn)出與突變體一致的表型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個與小麥花粉發(fā)育有關(guān)的基因的cDNA 3’端片段及其編碼的多肽。
本發(fā)明所提供的與小麥花粉發(fā)育有關(guān)基因的cDNA片段命名為WSK1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列的非編碼區(qū)具有80％以上同源性的DNA序列。
與小麥花粉發(fā)育有關(guān)的蛋白WSK1，是包含序列表中序列2氨基酸序列的多肽，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的多肽。
序列表中序列1的DNA序列由528個堿基組成，其中前面的第3～236個堿基編碼序列表中序列2的多肽，序列2由78個氨基酸組成。序列1的237位以后的292個堿基為該cDNA的非編碼區(qū)。含有序列表中SEQ ID №1的質(zhì)粒及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用RNAi技術(shù)獲得雄性不育小麥中所應(yīng)用的新質(zhì)粒。
本發(fā)明所提供的質(zhì)粒為RNAi雙元表達(dá)載體，含有玉米泛素蛋白(Ubiquitin)基因的啟動子、WSK1正義序列-內(nèi)含子-WSK1反義序列、終止子。
為了使轉(zhuǎn)化體便于篩選，所述質(zhì)粒上還含有抗生素篩選標(biāo)記和/或報告基因。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種有效、方便地獲得雄性不育小麥的方法。
一種獲得雄性不育小麥的方法，是將RNAi雙元表達(dá)載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，T-DNA插入并整合到小麥染色體上，獲得轉(zhuǎn)化體。
所述RNAi雙元表達(dá)載體含有玉米泛素蛋白基因的啟動子、WSK1正義序列-內(nèi)含子-WSK1反義序列、終止子。
用本發(fā)明的方法，當(dāng)RNAi表達(dá)載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，T-DNA插入并整合到小麥染色體上之后，小麥體內(nèi)可穩(wěn)定的產(chǎn)生與WSK1序列一致的ds-RNA，從而引導(dǎo)植物固有的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS，Post-Transcriptional Gene Silencing)，使小麥內(nèi)源編碼WSK1的mRNA降解，得到由于減數(shù)分裂異常而造成的可穩(wěn)定遺傳的小麥雄性不育突變體。在培育小麥育種必需的不育品系中將得到廣泛應(yīng)用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。


圖1為RNAi植物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)圖譜具體實施方式
本發(fā)明的試驗材料均為冬小麥京冬一號。
實施例1.WSK1cDNA片段的克隆以溫室種植的小麥京冬1號(Triticum aestivum L. cv Jingdong No 1)為材料，待幼穗長2.1cm時，鏡檢顯示生活史處于減數(shù)分裂期。取這一時期的小花為材料構(gòu)建小麥減數(shù)分裂期cDNA文庫。文庫構(gòu)建選用CLONTECH公司的SMART cDNA Library ConstructionKit(Catalog#k1051-1)，按照試劑盒說明書進(jìn)行。該試劑盒最終將雙鏈cDNA插入在載體pTriplEx2之上。
利用已得到的W3712片段為探針在文庫中做雜交篩選，得到3’完整的長度為528bp的cDNA片段，序列為序列表中的序列1。將此cDNA的基因命名為WSK1。
實施例2.RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建利用已得到的WSKlcDNA序列，設(shè)計兩條引物引物I(5’-ATC GAT GGT ACCACC TCAAGA ACT GGG ACG CCG A-3’)和引物II(5’-TCT AGA CTC GAGTAA ACA AGC AAA GCATTC CAC T-3’)并在這兩條引物的5’端分別加上了ClaI/KpnI和XbaI/XhoI位點(劃線部分)，以含有WSK1片段的質(zhì)粒為模板按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃ 4min；94℃ 1min，61℃ 30s，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 10min。
回收PCR產(chǎn)物后，經(jīng)雙酶切消化分別以正義和反義的方式插入到質(zhì)粒pHANNIBAL的兩個多克隆位點上。再用XhoI將包含有“正義-內(nèi)含子-反義”結(jié)構(gòu)的片段切下，插入中間載體pTriplEx2質(zhì)粒的XhoI位點上，采用部分酶切的方法獲得帶有KpnI和SacI粘性末端的“WSK1正義-內(nèi)含子-WSK1反義”片段，最終將此片斷插入到玉米泛素蛋白啟動子Ubi的下游，構(gòu)建完成了Ubi∷sense-intron-antisense的植物表達(dá)載體，命名為pUNiwsk，結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示。
實施例3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化用電轉(zhuǎn)化的方式將質(zhì)粒pUNiwsk轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，借助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織，經(jīng)在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選初步得到抗性愈傷組織，經(jīng)在分化培養(yǎng)基上繼代分化出組培苗，通過GUS報告基因檢測得到小麥陽性苗，移栽后從中篩選到減數(shù)分裂異常、不結(jié)實的轉(zhuǎn)化體。
序列表<160>2<210>1<211>528<212>DNA<213>小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)<400>1acctcaagaa ctgggacgcc gagttcgtca aggtcgacca ggccaccctc ttcgacccca 60tcctggctgc caactacctg aacatcaagg ggctgctgga cctgacctgc cagactgttg120ctgacatgat caagggcaag accccagagg agatccgcaa gactttcaac atcaagaacg180actttacgcc cgaggaggag gaggagatcc gcagggagaa ccagtgggcc tttgagtaga240ggagcatcta ggcaggcgat gccgccgccg cgttgaatga acgaacaacg cttagtattc300gtcatgtctg catttcagcg ctcttcttta tgtctgtcgt aatgggttgt aattatcctg360gagtctatga ggtggtgtcg gtgaacatgt tcggtcagtg gttatgtttg cgacaacaag420aaaaacctat cgtggtcagt ggtcatcact tgtcaaactg aatcttaatc gtcaagtgga480atgctttgct tgtttaccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 528<210>2<211>78<212>PRT<213>小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)<400>2Leu Lys Asn Trp Asp Ala Glu Phe Val Lys Val Asp Gln Ala Thr1 5 10 15Leu Phe Asp Pro Ile Leu Ala Ala Asn Tyr Leu Asn Ile Lys Gly20 25 30Leu Leu Asp Leu Thr Cys Gln Thr Val Ala Asp Met Ile Lys Gly35 40 45
Lys Thr Pro Glu Glu Ile Arg Lys Thr Phe Asn Ile Lys Asn Asp50 55 60Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ile Arg Arg Glu Asn Gln Trp65 70 75Ala Phe Glu78
權(quán)利要求
1.與小麥花粉發(fā)育有關(guān)基因的cDNA片段WSK1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列的非編碼區(qū)具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA片段，其特征在于所述與小麥花粉發(fā)育有關(guān)的基因WSK1之cDNA片段是序列表中序列1的DNA序列。
3.與小麥花粉發(fā)育有關(guān)的蛋白WSK1，是包含序列表中序列2氨基酸殘基序列的多肽，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的包含由序列2衍生的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其特征在于它是包含序列表中序列2氨基酸殘基序列的多肽。
5.含有權(quán)利要求1所述cDNA片段的表達(dá)載體pUNiwsk。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述載體為RNAi雙元表達(dá)載體，含有玉米泛素蛋白基因啟動子、WSK1正義序列-內(nèi)含子-WSK1反義序列、終止子。
7.一種獲得雄性不育小麥的方法，是將RNAi雙元表達(dá)載體pUNiwsk經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，T-DNA插入并整合到小麥染色體上，獲得轉(zhuǎn)化體。
8.含有權(quán)利要求3所述基因的細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了獲得雄性不育小麥的方法及其專用質(zhì)粒與功能核苷酸片段，首要目的是提供一個與小麥花粉發(fā)育有關(guān)的cDNA片段及其編碼的多肽序列。本發(fā)明所提供的與小麥花粉發(fā)育有關(guān)的cDNA片段命名為WSK1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQID №2多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列的非編碼區(qū)具有80％以上同源性的DNA序列。本發(fā)明的第二個目的是提供一種獲得雄性不育小麥的方法，該方法是將RNAi雙元表達(dá)載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，T－DNA插入并整合到小麥染色體上，獲得轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的方法在培育小麥育種必需的不育品種中有重要應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/29GK1548539SQ03130630
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月6日
發(fā)明者種康, 李馳峻, 姜榮錫, 許智宏, 譚克輝, 種 康 申請人:中國科學(xué)院植物研究所