專利名稱：一種檢測鑒定支原體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物的檢測鑒定方法，特別是支原體的檢測鑒定方法，具體涉及使用新的支原體種特異性探針結合反向線點雜交(Reverse Line Blot Hybridisation)方法檢測和鑒定十種常見細胞污染和致病支原體。

背景技術：
支原體污染是細胞培養(yǎng)實驗、制藥工業(yè)和生物制劑生產(chǎn)中常見的問題，它能導致實驗的失敗和生物產(chǎn)品質量下降。在不同實驗室的報道中，15％-85％的細胞培養(yǎng)中存在支原體污染。在目前已知的20多種細胞污染支原體中，精氨酸支原體(Mycoplasma arginin)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)、豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)，口腔支原體(Mycoplasma orale)和萊氏無膽甾原體(Acholeplasma laidlawii)是最常見的。在細胞培養(yǎng)中，95％以上的支原體污染是由這五種支原體污染所致。生殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)、人型支原體(Mycoplasma hominis)、微小脲原體(Ureaplasma parvum)、解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)是五種臨床常見的致病支原體。生殖道支原體、人型支原體、微小脲原體和解脲脲原體寄生于人體泌尿道和生殖道，在臨床上它們能導致非淋菌性尿道炎、宮頸炎、不孕和不育等一系列疾病。肺炎支原體是導致人類尤其是兒童肺炎的病原體之一。由于支原體形態(tài)微小和生長緩慢，它們的感染不易在臨床和實驗室中被早期診斷、鑒定。且支原體種類繁多，約120多種。傳統(tǒng)的支原體診斷方法主要有支原體培養(yǎng)、支原體DNA熒光染色、核酸分子雜交和支原體種特異多聚合酶鏈式擴增(PCR)等方法。PCR方法是目前最常用的診斷方法(參考文獻Kong，F(xiàn).等2001.Species-specific PCR for identification of commoncontaminant mollicutes in cell culture.Appl.Environ.Microbiol.673195-3200)，但使用PCR檢測、鑒定多種支原體存在耗時長、重復步驟多的缺點。目前沒有一個快速的、同時檢測多種支原體，且靈敏、特異性高和成本低的方法。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的檢測鑒定支原體的方法，使其具有能同時檢測鑒定多種支原體，且具有快速、靈敏、特異性高和成本低等特點，以克服現(xiàn)有技術的不足。
本發(fā)明提供的檢測鑒定支原體的方法，包括下列步驟 (1)提取待測樣品的DNA； (2)使用經(jīng)標記的支原體通用引物，以PCR方法擴增待測樣品之DNA； (3)將PCR擴增產(chǎn)物與定位標記在尼龍膜上的支原體種特異性探針雜交； (4)顯示和判別雜交結果。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案，包括設計出診斷支原體種的特異性探針和反向線點雜交。
在支原體屬中，它們的16S-23S rRNA間隔區(qū)的核酸序列是目前已知的最具支原體種間差異的核酸序列(參考文獻Harasawa，R.等.2000.Comparison of the 16S-23S rRNAintergenic spacer regions among strains of the Mycoplasma mycoides cluster，and reassessmentof the taxonomic position of Mycoplasma sp.bovine group 7.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.50 Pt31325-1329)。目前國內外文獻報道中，尚無人在這一區(qū)域設計診斷支原體種的特異性探針。
反向線點雜交是建立在DNA多聚合酶鏈式擴增(PCR)基礎上的雜交鑒定方法。此方法最早應用于結核的分種鑒定中(參考文獻Aranaz，A等.1996.Spoligotyping ofMycobacterium biovis strains from cattleand other animalsa tool for epidemiology oftuberculosis.J.Clin.Microbiol.342734-2740.)。它的優(yōu)點在于能靈敏、快速進行微生物的分種、分型鑒定。因此我們設計支原體新的種特異性探針并結合反向線點雜交方法，建立一種新的、快速檢測鑒定多種支原體方法，為實驗室和臨床工作提供有力的幫助，以彌補現(xiàn)有技術的不足。
在支原體16S-23S rRNA間隔區(qū)設計、合成不同支原體種的特異性探針，5’端氨基酸標記，將特異性探針標記在尼龍膜上。再設計、合成前述常見十種支原體的16S-23S rRNA間隔區(qū)公共引物，5’端生物素標記。使用標記有生物素的公共引物擴增十種常見的支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA。將PCR產(chǎn)物與定位標記在尼龍膜上的支原體種特異性探針結合。在尼龍膜上加入顯影劑，顯影劑和PCR產(chǎn)物上標記的生物素結合，激發(fā)熒光，使x光底片曝光，如有黑點，表示結果為陽性，并通過底片上不同位置顯現(xiàn)的黑點鑒定支原體種；如無黑點，表示結果為陰性。
本發(fā)明提供的檢測鑒定支原體的方法，能敏感、快速檢測鑒定支原體，在2天時間內可同時檢測、鑒定多種支原體。這種方法的敏感性和特異性不低于目前常用的支原體PCR檢測方法，且一次可同時檢測多達45個樣本，而探針標記的尼龍膜可反復使用20次左右，即一張?zhí)结槝擞浀哪猃埬た勺銐驒z測900個樣本，從而大大降低每一個樣本的檢測成本。
本發(fā)明的另一個任務是提供一種檢測鑒定支原體的試劑盒，其特征在于它含有 容器； 本發(fā)明提供的用于擴增支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA的通用引物； 至少一種具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述堿基序列的支原體種特異性探針； 以及使用說明。
該試劑盒還可含有PCR反應所需要的試劑。



圖1為本發(fā)明支原體檢測鑒定方法底片暴光顯色結果。

具體實施例方式 實施例 使用的儀器有-20℃和4℃冰箱，常溫高速離心機(Eppendorf公司，德國)，PCR儀(Eppendorf公司，德國)，Miniblotter(Immunetic公司，美國)，雜交箱(Thermo公司，美國)，暗盒。
使用的試劑有羅氏呼吸道標本DNA提取試劑盒(羅氏診斷試劑公司，美國)，Taq酶，dNTP，10×PCR buffer，超凈水，0.5M NAHCO3(PH8.4)，0.1M NaOH，16％w/v 1Ethyl-3-(3 Dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDAC)(Sigma公司，美國)，20×SSPE(0.2MNa2HPO4，3.6M NaCl，20mMEDTA，PH7.4)，2×SSPE/0.1％SDS，2×SSPE/0.5％SDS，2×SSPE，1％SDS，20mM EDTA，Biodyne C尼龍膜(Immunetic公司，美國)，Streptavidin-peroxidase conjugate(羅氏診斷試劑公司，美國)，Enhancedchemiluminescence(ECL)顯影劑(Amersham公司，英國)，X光片(Amersham公司，英國)。
操作步驟 一、使用羅氏呼吸道標本DNA提取試劑盒提取DNA 將待測樣品在常溫下以13000轉/分離心10分鐘，去除上清液，保留10μl液體，加入500μl洗液(由羅氏呼吸道標本DNA提取試劑盒配備)，混勻；再以13000轉/分離心10分鐘，去除上清液，加入50μl，在60℃孵育45分鐘，最后加入50μl平衡液(由羅氏呼吸道標本DNA提取試劑盒配備)，混勻，將DNA提取液保存于-20℃，備用。
二、使用巢式PCR擴增支原體16S-23S rRNA間隔區(qū) 本發(fā)明設計了兩對通用引物，即SPS1，SPA2；SPS2，SPA1，擴增十種支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)。SPS1，SPA2為外引物；SPS2，SPA1為內引物。SPS2和SPA1的5’端給予生物素標記，如使用羧基丁二亞酰胺酯(biotinyl N hydroxy succinimide ester，BNHS)標記。該引物由Sigma公司合成，其序列如下 外引物 SPS15’-CCCTACGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCT-3’(SEQ ID NO1) SPA25’-CSDDGCWTWTCGSWGDTWRDYVCGTCCTTCATCG-3’(SEQ IDNO4) 內引物 SPS25’-CGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCTTTC-3’(SEQ ID NO2) SPA15’-CGTCCTTCATCGMCTNTYYDGWSCCAAGGCATYCAC-3’(SEQ IDNO3) PCR方案是第一次擴增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、65℃10秒、74℃1分鐘，30個循環(huán)；第二次擴增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、70℃10秒、74℃1分鐘，30個循環(huán)。取20μl PCR擴增產(chǎn)物用于反向線點雜交實驗。
三、反向線點雜交實驗 (一)標記探針 使用的十種支原體種特異性探針序列如下，5’端給予hexylamino標記，由Sigma公司合成 發(fā)酵支原體1A 5’-CCC ATA AAA AAG CCA CAT AAC-3’(SEQ ID NO5) 發(fā)酵支原體2S 5’-CAT CAT AAC AAA CTA TAA CAA TAG GAA-3’(SEQ ID NO6) 精氨酸支原體1A5’-AAA GAA CAA ATT GAG AGA TAG GTC-3’(SEQ ID NO 7) 精氨酸支原體2S5’-CAA TAG GTC TTA TAC TAC TAT TAA ACA AGA T-3’(SEQ ID NO8) 口腔支原體1A 5’-GAA TAT TGG GCC ATT AAC TAT TT-3’(SEQ ID NO9) 口腔支原體2S 5’-CAA TAG GTC AAA AAT ACT TAT ACG TAA-3’(SEQ ID NO10) 豬鼻支原體1A 5’-CTA GAC ACG AAT CGA TTA TGT AAT-3’(SEQ ID NO 11) 豬鼻支原體2S 5’-AAC GAT CTT TTT TAT AAC CGA G-3’(SEQ ID NO12) 人型支原體1A 5’-CAA AGA ACC GAG AGA TAA ATC T-3’(SEQ ID NO13) 人型支原體2S 5’-CAA TAG GTC ATA CAA TTA ACA AAA C-3’(SEQ ID NO14) 肺炎支原體1A 5’-ACC GAT AAA TAA ATG GAT TTT G-3’(SEQ ID NO15) 肺炎支原體2S 5’-ACA TTT CCG CTT CTT TCA A-3’(SEQ ID NO16) 生殖道支原體1A5’-CAC CGA AAA AAT TAA TGG G-3’(SEQ ID NO17) 生殖道支原體2S5’-AAG AAT GTT TTT GAA CAG TTC TTT-3’(SEQ ID NO 18) 解脲脲原體1A 5’-GGC TAA TAT TCA CAT GGA TTT TTA TA-3’(SEQ ID NO19) 解脲脲原體2S 5’-AAA TAT TTC AAA AGT TCA TAT GGT C-3’(SEQ ID NO20) 萊氏無膽甾原體1A 5’-AAG TGT TAG TTA GCC TTT CTC CT-3’(SEQ ID NO21) 萊氏無膽甾原體2S 5’-AAA TGA TGT CTG AAA AGA AAT AAG-3’(SEQ ID NO 22) 微小脲原體1A 5’-GGC TTA TAT TCA TAT GGA TTT TAA TA-3’(SEQ ID NO23) 微小脲原體2S 5’-TAT TTT TAA AAA TTC ATA TGG TCG-3’(SEQ ID NO 24) 1.使用0.5M NaHCO3(PH8.4)分別稀釋上述十種支原體種特異性探針至適宜濃度，(稀釋和適宜濃度的確定方法參見Vinje J，Koopmans MP.Simultaneous detectionand genotyping of″Norwalk-like viruses″by oligonucleotide array ina reverse line blot hybridization format.J Clin Microbiol.2000Jul；38(7)2595-601.)； 2.將Biodyne C尼龍膜裁剪為15×15厘米大??； 3.室溫下，16％w/v 1 Ethyl-3-(3 Dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDAC)孵育BiodyneC尼龍膜10分鐘； 4.去離子水漂洗Biodyne C尼龍膜1分鐘； 5.將Biodyne C尼龍膜放入Miniblotter中，蓋緊，吸除尼龍膜表面液體； 6.將十種己稀釋的支原體探針各取150μl分別依次加入Miniblotter槽的不同槽中，室溫下孵育5分鐘； 7.吸除尼龍膜表面液體； 8.打開Miniblotter，取出尼龍膜，將尼龍膜放入0.1M NaOH液中滅活9分鐘； 9.100ml 2×SSPE漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘； 10.使用60℃2×SSPE/0.5％SDS液漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘； 11.在室溫下用200ml 20mM EDTA液清洗Biodyne C尼龍膜20分鐘； 12.將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，密封保存于4℃冰箱中，備用。
(二)反向線點雜交 1.將每一樣本的20μl PCR擴增產(chǎn)物和150μl 2×SSPE/0.1％SDS混勻加入EP管中，加熱至100℃10分鐘，將EP管快速放置于冰上； 2.用250ml 60℃2×SSPE/0.1％SDS液漂洗已標記探針的Biodyne C尼龍膜5分鐘； 3.將洗后的Biodyne C尼龍膜放置于Miniblotter中，吸除尼龍膜表面液體； 4.在Miniblotter槽中分別依次加入150μl PCR擴增產(chǎn)物和2×SSPE/0.1％SDS混液(其方向與探針方向垂直)，放入60℃雜交箱雜交60分鐘； 5.吸除Biodyne C尼龍膜表面液體； 6.從Miniblotter中取出Biodyne C尼龍膜。用250ml 60℃2×SSPE/0.5％SDS液洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次10分鐘； 7.將洗后的Biodyne C尼龍膜放入滾筒中，加入10ml 2×SSPE/0.5％SDS和1/5000Streptavidin-peroxidase conjugate混合液，在42℃雜交45分鐘； 8.用250ml 42℃2×SSPE/0.5％SDS液洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次10分鐘； 9.室溫下用250ml 2×SSPE液洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次5分鐘； 10.加入20ml Enhanced chemiluminescence(ECL)顯影劑于Biodyne C尼龍膜上，室溫孵育1分鐘； 11.將Biodyne C尼龍膜放入暗盒中，在暗盒中放入X光片，曝光5分鐘，洗片，觀察結果相應探針區(qū)域顯現(xiàn)黑色圓點為陽性，說明有與探針相應的支原體；如果相應探針區(qū)域不顯現(xiàn)色則為陰性，說明沒有與探針相應的支原體。
將Biodyne C尼龍膜用80℃250ml 1％SDS洗兩次，每次30分鐘，再用200ml 20mMEDTA液清洗Biodyne C尼龍膜15分鐘，將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，密封保存于4℃冰箱中，可備下次使用。
用本發(fā)明支原體反向線點雜交方法檢測19株支原體ATCC標準株，包括M.hyorhinisATCC 17981，發(fā)酵支原體ATCC 19989，萊氏無膽甾原體ATCC 23206，肺炎支原體ATCC 29342(M129)，生殖器支原體ATCC 33530，14株微小脲原體和解脲脲原體ATCC標準株。同時也檢測了分別從澳大利亞和北京分離的精氨酸支原體、口腔支原體、人型支原體各一株。結果顯示使用支原體反向線點雜交方法能準確的檢測19株支原體ATCC標準株及精氨酸支原體、口腔支原體、人型支原體各一分離株。(見附圖，在附圖中，對于微小脲原體和解脲脲原體，僅顯示微小脲原體以血清型3及解脲脲原體血清型8檢測結果)。
用支原體種PCR和用本發(fā)明支原體反向線點雜交方法同時檢測180個臨床樣本，包括80個細胞培養(yǎng)物樣本，86個泌尿、生殖道分泌物樣本，14個呼吸道分泌物樣本(表1、表2)，比較兩種方法檢測結果。結果顯示在臨床樣本檢測中，用支原體種特異性PCR和用本發(fā)明支原體反向線點雜交檢測方法的檢測結果是一致的。
表1細胞培養(yǎng)物中使用兩種方法檢測支原體結果比較 物種名稱及例數(shù)反向線點雜交檢測結果種特異性PCR檢測結果發(fā)酵支原體13例精氨酸支原體24例口腔支原體9例豬鼻支原體16例發(fā)酵支原體和精氨酸支原體5例發(fā)酵支原體、精氨酸支原體和口腔支原體2例精氨酸支原體和口腔支原體4例口腔支原體和豬鼻支原體7例總計 13例陽性 24例陽性 9例陽性 16例陽性 5例陽性 2例陽性 4例陽性 7例陽性 80例陽性 13例陽性 24例陽性 9例陽性 16例陽性 5例陽性 2例陽性 4例陽性 7例陽性 80例陽性 表2泌尿、生殖道、呼吸道分泌物樣本中使用兩種方法檢測支原體結果比較物種名稱及例數(shù) 反向線點雜交檢測結果 種特異性PCR檢測結果肺炎支原體14例14例陽性14例陽性生殖道支原體6例微小脲原體60例解脲脲原體20例總計6例陽性60例陽性20例陽性100例陽性6例陽性60例陽性20例陽性100例陽性 通過支原體種特異性PCR檢測方法和支原體反向線點雜交方法檢測臨床樣本的結果比較可以看出，本發(fā)明方法及所設計的支原體種特異性探針能靈敏、特異的檢測和鑒定支原體。本發(fā)明支原體反向線點雜交方法敏感性和特異性與支原體種特異性PCR檢測方法是相同的，此方法的優(yōu)勢在于能在短時間內(2天)同時檢測多種支原體，而PCR方法則需要反復多次才能確定每一種支原體，說明本發(fā)明是一種具有能同時檢測鑒定多種支原體，且具有快速、靈敏、特異性高和成本低的支原體檢測方法。
序列表
<110>武漢市第一醫(yī)院
<120>一種支原體的檢測鑒定方法
<130>
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>1
ccctacgrga acgtggggvt ggawyacctc ct32
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>2
cgrgaacgtg gggvtggawy acctcctttc 30
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>合成的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>n＝a或g或c或t
<400>3
cgtccttcat cgmctntyyd gwsccaaggc atycac36
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>4
csddgcwtwt cgswgdtwrd yvcgtccttc atcg 34
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)
<400>5
cccataaaaa agccacataa c21
<210>6
<211>52
<212>DNA
<213>發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)
<400>6
catcataaca aactataaca ataggaa 27
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)
<400>7
aaagaacaaa ttgagagata ggtc 24
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)
<400>8
caataggtct tatactacta ttaaacaaga t 31
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>口腔支原體(Mycoplasma orale)
<400>9
gaatattggg ccattaacta ttt 23
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>口腔支原體(Mycoplasma orale)
<400>10
caataggtca aaaatactta tacgtaa 27
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)
<400>11
ctagacacga atcgattatg taat 24
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)
<400>12
aacgatcttt tttataaccg ag 22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人型支原體(Mycoplasma hominis)
<400>13
caaagaaccg agagataaat ct 22
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人型支原體(Mycoplasma hominis)
<400>14
caataggtca tacaattaac aaaac25
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)
<400>15
accgataaat aaatggattt tg 22
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)
<400>16
acatttccgc ttctttcaa 19
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)
<400>17
caccgaaaaa attaatggg 19
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)
<400>18
aagaatgttt ttgaacagtt cttt 24
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)
<400>19
ggctaatatt cacatggatt tttata 26
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)
<400>20
aaatatttca aaagttcata tggtc25
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>萊氏無膽甾原體(Acholeplasma laidlawii)
<400>21
aagtgttagt tagcctttct cct 23
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>萊氏無膽甾原體(Acholeplasma laidlawii)
<400>22
aaatgatgtc tgaaaagaaa taag 24
<210>23
<211>26
<212>DNA
<213>微小脲原體(Ureaplasma parvum)
<400>23
ggcttatatt catatggatt ttaata 26
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>微小脲原體(Ureaplasma parvum)
<400>24
tatttttaaa aattcatatg gtcg 2權利要求
1.一種支原體的檢測鑒定方法，其特征在于包括下列步驟
(1)提取待測樣品的DNA；
(2)使用經(jīng)標記的支原體通用引物，以PCR方法擴增待測樣品之DNA；
(3)將PCR擴增產(chǎn)物與定位標記在尼龍膜上的支原體種特異性探針雜交；
(4)洗去尼龍膜上未雜交的PCR擴增產(chǎn)物；
(5)顯示雜交結果。
2.根據(jù)權利要求1所述的支原體的檢測鑒定方法，其特征在于所述的支原體種特異性探針是具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述堿基序列的探針中的一種或數(shù)種或全部。
3.根據(jù)權利要求1所述的支原體的檢測鑒定方法，其特征在于所述的支原體通用引物包括
外引物
SPS15’-CCCTACGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCT-3’(SEQ ID NO1)
SPA25’-CSDDGCWTWTCGSWGDTWRDYVCGTCCTTCATCG-3’(SEQ IDNO4)；
內引物
SPS25’-CGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCTTTC-3’(SEQ ID NO2)
SPA15’-CGTCCTTCATCGMCTNTYYDGWSCCAAGGCATYCAC-3’(SEQ IDNO3)。
4.根據(jù)權利要求1所述的支原體的檢測鑒定方法，其特征在于以生物素標記所述的支原體通用引物。
5.根據(jù)權利要求1所述的支原體的檢測鑒定方法，其特征在于所述的顯示雜交結果的方法是在尼龍膜上加入顯影劑，顯影劑和PCR產(chǎn)物上標記的生物素結合，激發(fā)熒光，使x光底片曝光。
6.用于檢測鑒定支原體的基因探針，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO5至SEQID NO24所述堿基序列中的任一堿基序列。
7.用于擴增支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA的通用引物，其特征在于包括具有序列表中SEQ ID NO1所述堿基序列的外引物SPS1、具有序列表中SEQ ID NO4所述堿基序列的外引物SPA2、具有序列表中SEQ ID NO2所述堿基序列的內引物SPS2和具有序列表中SEQ ID NO3所述堿基序列的內引物SPA1。
8.根據(jù)權利要求1所述的支原體的檢測鑒定方法，其特征在于PCR反應條件是第一次擴增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、65℃10秒、74℃1分鐘，30個循環(huán)；第二次擴增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、70℃10秒、74℃1分鐘，30個循環(huán)。
9.一種檢測鑒定支原體試劑盒，其特征在于它含有
容器；
用于擴增支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA的通用引物；
至少一種具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述堿基序列的支原體種特異性探針；
以及使用說明。
10、根據(jù)權利要求9所述的檢測鑒定支原體試劑盒，其特征在于該試劑盒還含有PCR反應所需要的試劑。
全文摘要
一種支原體的檢測鑒定方法，包括提取待測樣品的DNA、使用經(jīng)標記的支原體通用引物以PCR方法擴增待測樣品之DNA、將PCR擴增產(chǎn)物與定位標記在尼龍膜上的支原體種特異性探針雜交、洗去尼龍膜上未雜交的PCR擴增產(chǎn)物、顯示雜交結果等步驟，同時，本發(fā)明還提供了支原體通用引物和支原體種特異性探針及檢測鑒定支原體試劑盒。本發(fā)明方法及所設計的支原體種特異性探針能靈敏、特異的檢測和鑒定支原體，具有快速、靈敏、特異性高和成本低的特點。
文檔編號C12Q1/68GK1676612SQ200410012940
公開日2005年10月5日 申請日期2004年3月29日 優(yōu)先權日2004年3月29日
發(fā)明者王輝, 孔繁榮, 琳·吉爾伯特 申請人:武漢市第一醫(yī)院