專利名稱：一種含有雙價抗蟲基因的重組桿狀病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有蝎神經(jīng)毒素(簡稱BmkIT)和幾丁質(zhì)酶(簡稱Chi)雙價抗蟲基因的重組桿狀病毒，該病毒的構(gòu)建方法，以及含有該病毒的殺蟲劑在農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
昆蟲桿狀病毒作為無公害生物殺蟲劑近年來備受關(guān)注，并得到廣泛應(yīng)用。桿狀病毒是一類昆蟲特異性病毒，應(yīng)用桿狀病毒防治害蟲有許多明顯優(yōu)點。桿狀病毒對脊椎動物和所有植物均無病原性，而且不能進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞核內(nèi)，桿狀病毒是自然界本來存在的，特別是桿狀病毒對牡蠣、蚌、蟹沒有致病性，對兩棲類、魚類、鳥類及哺乳動物亦無任何毒性、致病性或異常變態(tài)反應(yīng)。對有益生物及非靶有機(jī)體沒有不良影響。應(yīng)用桿狀病毒在環(huán)境中不遺留有害殘毒，不會污染環(huán)境，對人畜安全。使用昆蟲病毒后，不僅病蟲本身就是病毒生產(chǎn)的“小工廠”，而且有些情況下，病毒還可經(jīng)卵傳染，殺滅次代害蟲，并在田間存活，殺滅次年生的害蟲，這是化學(xué)農(nóng)藥所無法相比的。
苜蓿銀紋夜蛾核型多角體桿狀病毒在害蟲防治中特別引人注目。它至少能侵染玉米夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、棉鈴蟲、紅鈴蟲、印度谷螟等39種農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲。因而這種桿狀病毒在農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用上有重要意義。
但如何能進(jìn)一步提高桿狀病毒毒力、縮短殺蟲時間是應(yīng)用桿狀病毒防治害蟲所面臨的重大課題。在野生型桿狀病毒基因組內(nèi)插入具有殺蟲活性的外源基因被認(rèn)為是解決該問題的有效途徑之一。
蝎毒是一種富含生物活性的多肽物質(zhì)，蝎毒中有一類神經(jīng)毒素專一作用于昆蟲而對哺乳動物無害或毒性很小，因此可利用此類昆蟲特異性的蝎神經(jīng)毒素來研制新型生物殺蟲劑。幾丁質(zhì)是N-乙酰氨基葡萄糖線性同聚物，是組成昆蟲外骨骼和消化道的主要成分，昆蟲在蛻皮時分泌幾丁質(zhì)酶以分解幾丁質(zhì)，并蛻掉舊皮。但如果昆蟲長時間暴露于幾丁質(zhì)酶下，含幾丁質(zhì)的一些主要結(jié)構(gòu)如圍食膜、消化道等就會受到嚴(yán)重影響而失去正常功能，換言之則可達(dá)到殺死昆蟲的目的。
近幾年已有重組單價抗蟲基因桿狀病毒的報道，但具有各自作用單一、昆蟲易產(chǎn)生耐藥性等缺陷。本發(fā)明與已有技術(shù)相比主要是在野生型苜蓿銀紋夜蛾核型多角體桿狀病毒基因組中引入兩個外源抗蟲基因。重組具有不同抗蟲機(jī)理的抗蟲基因能夠改善、提高桿狀病毒的殺蟲效率并拓寬其殺蟲譜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的重組桿狀病毒；提供一種該重組桿狀病毒的構(gòu)建方法；提供一種構(gòu)建用于重組桿狀病毒的中間載體的方法；提供該重組桿狀病毒的用途在于該病毒與農(nóng)藥載體的組合物具有殺蟲作用。
根據(jù)本發(fā)明的目的，提供一種新的重組桿狀病毒，該病毒產(chǎn)生的多角體由蝎神經(jīng)毒素、昆蟲幾丁質(zhì)酶和桿狀病毒多角體蛋白構(gòu)成。其中選用的桿狀病毒多角體蛋白為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體蛋白。提供一種該重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，主要是將蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因與具有廣譜抗蟲作用的幾丁質(zhì)酶基因容納在同一個載體上，進(jìn)而整合到多角體桿狀病毒基因組上，優(yōu)選使用野生型苜蓿銀紋夜蛾核型多角體桿狀病毒基因組，形成一種含有雙價抗蟲基因的新的重組桿狀病毒。提供一種用于構(gòu)建重組桿狀病毒的中間載體；該載體由氨芐抗性基因Ampr、多角體蛋白基因、昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmkIT)和一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)構(gòu)成；本發(fā)明提供的含雙價抗蟲基因的重組桿狀病毒及其獲得方法可用于生物殺蟲劑的開發(fā)。兩種抗蟲蛋白同時表達(dá)，通過幾丁質(zhì)酶的作用，破壞害蟲消化道和外表皮，抑制昆蟲發(fā)育，與此同時，使得蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素作用于神經(jīng)系統(tǒng)，通過兩種蛋白的協(xié)同作用，從而大大提高桿狀病毒的殺蟲效率和拓寬其殺蟲譜。
本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)利用PCR方法將蝎昆蟲毒素基因(BmkIT)和幾丁質(zhì)酶基因(Chi)分別從含有該基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增出來，并克隆到一個可轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞的中間載體pAcPDIE1中獲得含雙價抗蟲基因的重組質(zhì)粒pAcPDIE1-BmkIT-Chi。含蝎昆蟲毒素基因的載體由本課題組構(gòu)建，發(fā)表于高技術(shù)通訊[梁愛華，李曉玲，蘇智廣Cloning and Sequencing of an Excitatory Insect-Selective Neurotox in BmKIT cDNAfrom Buthus martensii Karsch.高技術(shù)通訊，1999，9(6)12-15]，蝎昆蟲毒素基因登錄號Y17050，含幾丁質(zhì)酶基因的載體pBI101-chitinase由張志云等構(gòu)建[張志云，張虎生，孫毅，梁愛華，雙價抗蟲基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建，西北植物學(xué)報，2004，接收發(fā)表]，幾丁質(zhì)酶基因基因登錄號U02270。
將該重組質(zhì)粒pAcPDIE1-BmkIT-Chi與線性化的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV基因組DNA(已商品化)共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞sf9(已商品化)中，篩選出重組桿狀病毒AcNPV-BmkIT-Chi。該重組桿狀病毒現(xiàn)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏號CGMCC No.1191)。


圖1A中間載體椎pAP建DIE1-BmkIT-Chi的結(jié)構(gòu)示意圖。
該載體由氨芐抗性基因Ampr、多角體蛋白基因polh、以及在兩個方向相反的IE1啟動子下分別連接有昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmkIT)與一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)構(gòu)成，該載體的大小為10.58Kb。
圖1B東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch)昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmkIT)及其氨基酸序列。
圖1C煙草夜蛾(Manduca sexta)昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)及其氨基酸序列。
圖2重組桿狀病毒中兩個外源基因的CR檢測電泳圖。MDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1幾丁質(zhì)酶基因CR產(chǎn)物，1700bp；3蝎毒基因CR產(chǎn)物300bp。
圖3利用浸泡了病毒液的棉花葉飼養(yǎng)棉鈴蟲檢測重組桿狀病毒的殺蟲效果。左圖浸泡了重組桿狀病毒液的棉花葉；中圖浸泡了野生型桿狀病毒液的棉花葉；浸泡了水的棉花葉。
圖4將野生型和重組型病毒拌入棉鈴蟲的飼料中飼養(yǎng)棉鈴蟲檢測重組桿狀病毒的殺蟲效果。W野生型；r重組型。
本發(fā)明的具體內(nèi)容通過附圖與實例加以說明利用CR方法將蝎昆蟲毒素基因(BmkIT)和幾丁質(zhì)酶基因(Chi)分別從含有該基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增出來，并克隆到一個可轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞的中間載體pAP DIE1中獲得含雙價抗蟲基因的重組質(zhì)粒pAP DIE1-BmkIT-Chi。將中間載體pAP DIE1-BmkIT-Chi與線性化的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒APN V基因組DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞sf9中；篩選出重組桿狀病毒APN V-BmkIT-Chi。用此新的重組桿狀病毒飼喂棉鈴蟲，結(jié)果表明該重組病毒既能抑制棉鈴蟲生長，又有神經(jīng)毒素作用，殺蟲效果好于重組蝎昆蟲毒素基因或重組幾丁質(zhì)酶基因單價抗蟲基因的重組桿狀病毒和野生型病毒。
中間載體的構(gòu)建利用CR方法將蝎昆蟲毒素基因(BmkIT)和幾丁質(zhì)酶基因(Chi)分別從含有該基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增出來(來源見上文)，并克隆到一個可轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞的中間載體pAP DIE1中獲得含雙價抗蟲基因的重組質(zhì)粒pAP DIE1-BmkIT-Chi。擴(kuò)增蝎毒素基因所用引物為(BglII-sP-F5’-CGCGAG ATCTATG AAA TTT TTC CTT AT A-3’；BglII-sP-FR5’-CGCGAG ATCTTTA ACC AAT TAT TTG G AC-3’)其中劃線部分為BglII酶切位點.擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因的引物為(Chit-SaPII-F5’-CGGCCGCGGATG CG AGCG ACA CTG GCG-3’；Chit-SaPII-RCGGCCG CGGTTA GGG TTG TTG AC ATTC-3’)其中劃線部分為SacII酶切位點。中間載體pAP DIE1-BmkIT-Chi由氨芐抗性基因Ampr、多角體蛋白基因、昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmkIT)和一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)構(gòu)成，圖1A是中間載體pAP DIE1-BmkIT-Chi的結(jié)構(gòu)示意圖，該載體的大小為10.58Kb。在該載體原始質(zhì)粒pAP IE1上又插入一個IE1啟動子，便于兩個外源基因的克隆。昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmkIT)和昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)序列分別見圖1B和圖1C。
重組桿狀病毒的獲得接種昆蟲細(xì)胞于平皿中，內(nèi)裝含血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，貼壁生長，除去培養(yǎng)基，用無血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液洗兩次，再加無血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液放置，棄去培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物(含無血清的GraPe’s培養(yǎng)基，線狀A(yù)PN V DNA和重組中間質(zhì)粒pAP DIE1-BmkIT-Chi，Tfx-20)輕輕加到上述含細(xì)胞的平皿中培養(yǎng)后，添加含血清的GraPe’s培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。收集病毒顆粒及多角體，進(jìn)行空斑純化。重組病毒感染細(xì)胞后，逐天觀察細(xì)胞中的變化，待細(xì)胞中出現(xiàn)大量多角體后，離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于SDS中溫育，細(xì)胞破碎，釋放出多角體桿狀病毒。裂解液再次離心，洗沉淀多次，最后懸浮于水中，獲得重組桿狀病毒。
本發(fā)明實施的具體條件是接種sf9細(xì)胞于直徑為36mm平皿中，內(nèi)裝2ml含血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，貼壁生長30分鐘，除去培養(yǎng)基，用無血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液洗兩次，再加2ml無血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，放置30分鐘，棄去培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物(含1ml無血清的GraPe’s培養(yǎng)基，500ng線狀A(yù)PN V DN A和500ng重組中間質(zhì)粒pAP DIE1-BmkIT-Chi，4.5ul Tfx-20)輕輕加到上述含細(xì)胞的平皿中，25℃培養(yǎng)2h以后，添加1ml含血清的GraPe’s培養(yǎng)基，25℃繼續(xù)培養(yǎng)5天。收集病毒顆粒及多角體，進(jìn)行空斑純化。
重組病毒感染sf9細(xì)胞后，逐天觀察細(xì)胞中的變化，待細(xì)胞中出現(xiàn)大量多角體后，11500轉(zhuǎn)離心10min收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于50ml 0.5％SDS中，溫育15分鐘，細(xì)胞破碎，釋放出多角體桿狀病毒。裂解液再次同上離心，用水洗沉淀多次以除去SDS，最后懸浮于1-2ml水中，獲得重組桿狀病毒。
重組桿狀病毒的檢測利用病毒提取試劑盒提取桿狀病毒的DNA，以提取的病毒DNA為模板，用CR方法擴(kuò)增蝎昆蟲毒素基因片段和幾丁質(zhì)酶基因片段。
本發(fā)明實施的具體條件是將病毒懸浮液20ul移入1.5ml離心管中，離心10秒后棄上清，加入450ul D液(消化液)，20ul RNase A和25ul roteinase K，迅速震蕩混勻，置65℃溫浴15分鐘，期間來回顛倒離心管數(shù)次。加入350ul DL液(裂解液)，混勻后，高速離心5分鐘，將上清移入另一個離心管中。加入350ul無水乙醇，混勻后，取700ul樣品液至吸附柱中，離心30秒，棄去收集管中的液體將吸附柱放入同一個收集管中并將剩余的藥品液全部移入吸附柱中，離心30秒，棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。加入400ulW1液(洗滌液)，靜置1分鐘后，離心30秒，棄掉收集管中的液體。將吸附柱放入另一個干凈的收集管中加入500ul W1液，離心15秒，棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中，離心1分鐘，將吸附柱放入另一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50-100ul T1液(洗脫液)，55℃靜置5分鐘后，離心1分鐘，將1.5ml離心管(DNA)-20℃保存。
以提取的病毒DNA為模板，用CR方法擴(kuò)增蝎昆蟲毒素基因片段和幾丁質(zhì)酶基因片段。擴(kuò)增所用引物同上(見中間載體構(gòu)建部分)。擴(kuò)增得到1700bp幾丁質(zhì)酶基因和300bp蝎毒基因條帶，從而證明此桿狀病毒含有上述兩種基因。如圖2。
殺蟲活性測定本發(fā)明的重組桿狀病毒的殺蟲效果明顯好于野生型病毒，既可以單獨用作殺蟲劑，又可與常用的農(nóng)藥載體形成組合物共同使用。
農(nóng)藥用載體包括液體和固體溶解物，如塵土、懸液、濁液及其類似物，殺蟲劑的劑型可以是粉劑、水劑、顆粒等。合適的載體包括但不限制于，水、醇、烴或其它有機(jī)溶劑，或者為礦物油、動物油或植物油，或者可以為粉末，例如滑石粉、粘土、硅酸鹽或硅藻土，還可以包括濕潤劑、涂布劑、紫外保護(hù)劑、分散劑和粘著劑。
本發(fā)明的組合物還可以包含一種或多種化學(xué)殺蟲劑?；瘜W(xué)殺蟲劑包括但不限于擬除蟲菊酯類、吡唑啉類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、甲脒類和吡咯類，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，這些殺蟲劑和本發(fā)明的重組桿狀病毒配合使用，可以使不同殺蟲劑的優(yōu)點都得以體現(xiàn)。
所述的重組桿狀病毒單獨使用，或和其它的農(nóng)用載體或其它的殺蟲劑共同使用可防治棉鈴蟲、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、菜青蟲、小菜蛾、煙青蟲、蚜蟲、潛葉蠅、紅蜘蛛、茶毛蟲、煙青蟲、紅鈴蟲、印度谷螟等多種農(nóng)業(yè)、林業(yè)、蔬菜、和倉儲害蟲。
本發(fā)明的實施中，采用了兩種方法對重組型桿狀病毒殺蟲效果進(jìn)行檢測。表明重組型桿狀病毒殺蟲效果為野生型病毒APN V的100倍，半致死時間縮短2天。另外，即使是存活的昆蟲，其發(fā)育受到嚴(yán)重抑制，個頭瘦小，行動遲鈍，取食極不活躍，化蛹率和成蛾率低。
采用的兩種檢測方法為一是在浸泡了病毒水溶液(每升水溶液中含2×108個病毒，10克白碳，10克蔗糖，50克聚已稀醇，1mlTriton X-100)的棉花葉片上放上同等數(shù)量的棉鈴蟲，觀察棉花葉片被取食情況。
二是將野生型與重組型多角體病毒拌入人工飼料中，檢測病毒對中國棉鈴蟲的致死作用。人工飼料中配方為玉米面1200g、黃豆面600g、各種維生素40g、酵母粉540g、瓊脂100g、白糖300g、防腐劑山梨酸11g、對羥基苯甲酸甲酯11g、甲醛30ml。受試蟲為中國棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)，購于中國農(nóng)科院植保所。幼蟲孵化后移入裝有1mm3大小人工飼料的玻璃瓶中，每瓶一頭。實驗共設(shè)4個多角體濃度，分別為108，107，106，105多角體/頭蟲，每組30頭蟲。實驗組在飼料中滴加相應(yīng)濃度的野生型或重組型多角體，對照組滴加蒸餾水，逐天記錄棉鈴蟲存活情況。
圖3是利用浸泡了病毒液的棉花葉飼養(yǎng)棉鈴蟲檢測重組桿狀病毒的殺蟲效果。左圖浸泡了重組桿狀病毒液的棉花葉；中圖浸泡了野生型桿狀病毒液的棉花葉；右圖浸泡了水的棉花葉。可以看出，浸泡了重組桿狀病毒液的棉花葉被棉鈴蟲咬食的最少，浸泡了野生型桿狀病毒液的棉花葉被棉鈴蟲取食的次之，而浸泡了水的棉花葉被棉鈴蟲取食的最多。結(jié)果表明重組型病毒抗蟲效果明顯好于野生型病毒。
圖4是將野生型和重組型病毒拌入棉鈴蟲的飼料中飼養(yǎng)棉鈴蟲檢測重組桿狀病毒的殺蟲效果。W野生型；r重組型?？梢钥闯鲋亟M型病毒抗蟲效果明顯好于野生型病毒。
具體實施例方式
實施例1、含雙價抗蟲基因的中間載體pAP DIE1-BmkIT-Chi的構(gòu)建利用CR方法分別從質(zhì)粒pExSeP1-BmkIT和pBI101-Phitinase中擴(kuò)增得到蝎昆蟲毒素基因片段和幾丁質(zhì)酶基因片段。兩個重組質(zhì)粒均由本室構(gòu)建(見前面說明書部分)。擴(kuò)增蝎毒素基因所用引物為(BglII-sP-F5’-CGCGAG ATCTATG AAA TTT TTCCTT ATA-3’；BglII-sP-FR5’-CGCGAGA ATCTTTA ACC AAT TAT TTG G AC-3’)其中劃線部分為BglII酶切位點.擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因的引物為(Chit-SaPII-F5’-CGGCCGCGGATG CG AGCG AC A CTG GCG-3’；Chit-SaPII-RCGGCCG CGGTTA GGGTTG TTG AC A TTC-3’)其中劃線部分為SacII酶切位點。將擴(kuò)增的蝎毒基因片段用BglII消化后，連接于用BglII消化過的pAP DIE1中，利用載體上啟動子序列與蝎毒基因下游引物進(jìn)行CR擴(kuò)增，從轉(zhuǎn)化子中篩選正向連接的重組質(zhì)粒，獲得pAP DIE1-BmkIT。用SacII消化擴(kuò)增出的幾丁質(zhì)基因片段，連于用SacII消化過的pAP DIE1-BmkIT質(zhì)粒中，獲得含雙價抗蟲基因的中間載體pAP DIE1-BmkIT-Chi.酶切消化、片段回收、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提等按常規(guī)方法進(jìn)行。擴(kuò)增蝎毒基因片段的條件是94℃熱變性4min后，94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，30個循環(huán)后72℃延伸10min.擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因片段的條件基本同上，退火溫度改為50℃。
實施例2、中間載體pAP DIE1-BmkIT-Chi及線狀的APN V DNA共轉(zhuǎn)染接種sf9細(xì)胞于直徑為36mm平皿中，內(nèi)裝2ml含血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，貼壁生長30分鐘，除去培養(yǎng)基，用無血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液洗兩次，再加2ml無血清的GraPe’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，放置30分鐘，棄去培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物(含1ml無血清的GraPe’s培養(yǎng)基，500ng線狀A(yù)PN V DNA和500ng重組中間質(zhì)粒pAP DIE1-BmkIT-Chi，4.5ul Tfx-20)輕輕加到上述含細(xì)胞的平皿中，25℃培養(yǎng)2h以后，添加1ml含血清的GraPe’s培養(yǎng)基，25℃繼續(xù)培養(yǎng)5天。收集病毒顆粒及多角體，進(jìn)行空斑純化。
實施例3、重組桿狀病毒的分離重組病毒感染sf9細(xì)胞后，逐天觀察細(xì)胞中的變化，待細(xì)胞中出現(xiàn)大量多角體后，11500轉(zhuǎn)離心10min收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于50ml 0.5％SDS中，溫育15分鐘，細(xì)胞破碎，釋放出多角體。裂解液再次同上離心，用水洗沉淀多次以除去SDS，最后將多角體懸浮于1-2ml水中，用血球計數(shù)器計其濃度。
實施例4、重組桿狀病毒的鑒定首先利用試劑盒提取桿狀病毒的DNA，將病毒懸浮液20ul移入1.5ml離心管中，離心10秒后棄上清，加入450ul D液(消化液)，20ul RNase A和25ul roteinase K，迅速震蕩混勻，置65溫浴15分鐘，期間來回顛倒離心管數(shù)次。加入350ul DL液(裂解液)，混勻后，高速離心5分鐘，將上清移入另一個離心管中。加入350ul無水乙醇，混勻后，取700ul樣品液至吸附柱中，離心30秒，棄去收集管中的液體將吸附柱放入同一個收集管中將剩余的藥品液全部移入吸附柱中，離心30秒，棄去收集管中的液體將吸附柱放入同一個收集管中。加入400ul W1液(洗滌液)，靜置1分鐘后，離心30秒，棄掉收集管中的液體。將吸附柱放入另一個干凈的收集管中加入500ul W1液，離心15秒，棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中，離心1分鐘，將吸附柱放入另一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50-100ulT1液(洗脫液)，55℃靜置5分鐘后，離心1分鐘，將1.5ml離心管(DNA)-20℃保存。
以提取的病毒DNA為模板，用CR方法擴(kuò)增蝎昆蟲毒素基因片段和幾丁質(zhì)酶基因片段。擴(kuò)增所用引物與條件同實施例1。
實施例5、殺蟲活性測定采用兩種方法對野生型與重組型多角體病毒殺蟲效果進(jìn)行檢測。
一是在浸泡了病毒液的棉花葉片上放上同等數(shù)量的棉鈴蟲，觀察棉花葉片被取食情況。
二是將野生型與重組型多角體病毒拌入人工飼料中，檢測病毒對中國棉鈴蟲的致死作用。人工飼料中配方為玉米面1200g、黃豆面600g、各種維生素40g、酵母粉540g、瓊脂100g、白糖300g、防腐劑山梨酸11g、對羥基苯甲酸甲酯11g、甲醛30ml。受試蟲為中國棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)，購于中國農(nóng)科院植保所。幼蟲孵化后移入裝有1mm3大小人工飼料的玻璃瓶中，每瓶一頭。實驗共設(shè)4個多角體濃度，分別為108，107，106，105多角體/頭蟲，每組30頭蟲。實驗組在飼料中滴加相應(yīng)濃度的野生型或重組型多角體，對照組滴加水，逐天記錄棉鈴蟲存活情況。
分析結(jié)果表明，重組型桿狀病毒明顯好于野生型病毒。重組型桿狀病毒殺蟲效果為野生型病毒APN V的100倍，半致死時間縮短2天。另外，即使是存活的昆蟲，其發(fā)育受到嚴(yán)重抑制，個頭瘦小，行動遲鈍，取食極不活躍，化蛹率和羽化率降低。
優(yōu)點及效果利用此重組桿狀病毒開發(fā)新型生物殺蟲劑的抗蟲譜寬，能殺死用可防治棉鈴蟲、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、菜青蟲、小菜蛾、煙青蟲、蚜蟲、潛葉蠅、紅蜘蛛、茶毛蟲、煙青蟲、紅鈴蟲、印度谷螟等多種農(nóng)業(yè)、林業(yè)、蔬菜、和倉儲害蟲。兩種外源抗蟲蛋白的協(xié)同作用，可顯著提高殺蟲效果，重組桿狀病毒對環(huán)境無污染。
序列表.SEQ序列表<110>山西大學(xué)<120>一種含有雙價抗蟲基因的重組桿狀病毒<160>4<210>1<211>210<212>DNA<213>東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch)<220>
<221>CDS<222>(1)...(210)<400>1aag aag aat gga tac gct gtc gat agt agt ggt aaa gtt agt gaa tgt48Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Cys1 5 10 15ttg tta aac aat tac tgc aac aac ata tgc aca aaa gta tat tat gct96Leu Leu Asn Asn Tyr Cys Asn Asn Ile Cys Thr Lys Val Tyr Tyr Ala20 25 30acg agc gga tat tgc tgc tta cta tca tgt tat tgc ttc ggt cta gat 144Thr Ser Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asp35 40 45gac gat aaa gca gtt ttg aag atc aag gac gcg acc aaa tct tat tgc 192Asp Asp Lys Ala Val Leu Lys Ile Lys Asp Ala Thr Lys Ser Tyr Cys50 55 60gac gtc caa atc aac taa 210Asp Val Gln Ile Asn65<210>2<211>69<212>PRT<213>東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch)<400>2Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Cys1 5 10 15Leu Leu Asn Asn Tyr Cys Asn Asn Ile Cys Thr Lys Val Tyr Tyr Ala20 25 30Thr Ser Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asp35 40 45
序列表.SEQAsp Asp Lys Ala Val Leu Lys Ile Lys Asp Ala Thr Lys Ser Tyr Cys50 55 60Asp Val Gln Ile Asn65<210>3<211>1665<212>DNA<213>煙草夜蛾(Manduca sexta)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1665)<400>3atg cga gcg aca ctg gcg acg ttg gct gtc ctg gcc tta gcg acg gcg48Met Arg Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu Ala Thr Ala1 5 10 15gtt caa tcg gac agc aga gcg cgc ata gta tgc tac ttc agc aat tgg96Val Gln Ser Asp Ser Arg Ala Arg Ile Val Cys Tyr Phe Ser Asn Trp20 25 30gcg gtg tat cgg cct ggt gta ggg cgg tac ggc atc gag gac att cca 144Ala Val Tyr Arg Pro Gly Val Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Ile Pro35 40 45gtg gag aag tgt acc cac atc att tac tcc ttc att ggc gtc act gag 192Val Glu Lys Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ile Gly Val Thr Glu50 55 60ggc aac agc gaa gta ctt atc att gat cct gag ttg gat gta gat aag 240Gly Asn Ser Glu Val Leu Ile Ile Asp Pro Glu Leu Asp Val Asp Lys65 70 75 80aat ggt ttc cgc aac ttt aca tcg ctt cgg tct tcg cat ccc agc gtc 288Asn Gly Phe Arg Asn Phe Thr Ser Leu Arg Ser Ser His Pro Ser Val85 90 95aag ttc atg gta gcg gtg ggc ggc tgg gct gaa ggc agt tcg aag tac 336Lys Phe Met Val Ala Val Gly Gly Trp Ala Glu Gly Ser Ser Lys Tyr100 105 110tct cat atg gtt gca cag aag agc acc cgc atg tct ttt atc agg agc 384Ser His Met Val Ala Gln Lys Ser Thr Arg Met Ser Phe Ile Arg Ser115 120 125
序列表.SEQgtt gtc agt ttt ctc aag aag tac gac ttc gac ggt cta gac ctt gat 432Val Val Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Asp Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp130 135 140tgg gag tac cca gga gcc gct gat cgt ggc ggc tct ttt tct gac aag 480Trp Glu Tyr Pro Gly Ala Ala Asp Arg Gly Gly Ser Phe Ser Asp Lys145 150 155 160gac aaa ttc tta tac tta gtg caa gag ctg cgg aga gca ttc atc agg 528Asp Lys Phe Leu Tyr Leu Val Gln Glu Leu Arg Arg Ala Phe Ile Arg165 170 175gtt ggt aaa gga tgg gaa ctg act gct gcc gta cca ctg gct aac ttc 576Val Gly Lys Gly Trp Glu Leu Thr Ala Ala Val Pro Leu Ala Asn Phe180 185 190aga tta atg gag ggt tat cat gtc cct gaa ctc tgt cag gaa tta gac 624Arg Leu Met Glu Gly Tyr His Val Pro Glu Leu Cys Gln Glu Leu Asp195 200 205gct atc cac gta atg tcg tac gat ctt cgt ggt aac tgg gct ggg ttt 672Ala Ile His Val Met Ser Tyr Asp Leu Arg Gly Asn Trp Ala Gly Phe210 215 220gcc gat gtg cac tcg cct tta tac aaa cgt cct cac gac cag tgg gct 720Ala Asp Val His Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Pro His Asp Gln Trp Ala225 230 235 240tat gag aaa ctt aac gtg aat gat ggt ctc cat ctt tgg gaa gag aag 768Tyr Glu Lys Leu Asn Val Asn Asp Gly Leu His Leu Trp Glu Glu Lys245 250 255ggt tgt ccc tca aac aag ctg gtc gtc ggt att cca ttc tac ggt cga 816Gly Cys Pro Ser Asn Lys Leu Val Val Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Arg260 265 270tct ttc acc cta tct gct ggc aac aac aac tac ggt ctc ggc acc ttc 864Ser Phe Thr Leu Ser Ala Gly Asn Asn Asn Tyr Gly Leu Gly Thr Phe275 280 285atc aac aag gaa gca ggc ggc ggt gac cct gcg cca tac acc aat gct 912Ile Asn Lys Glu Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Thr Asn Ala290 295 300aca gga ttt tgg gct tat tat gag atc tgt aca gaa gta gac aag gat 960Thr Gly Phe Trp Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Thr Glu Val Asp Lys Asp305 310 315 320gac tcc ggc tgg acg aag aaa tgg gac gag caa ggc aag tgc ccc tat 1008
序列表 SEQAsp Ser Gly Trp Thr Lys Lys Trp Asp Glu Gln Gly Lys Cys Pro Tyr325 330 335gcc tac aag ggc acc cag tgg gtt gga tac gaa gac cct cgc agc gtg 1056Ala Tyr Lys Gly Thr Gln Trp Val Gly Tyr Glu Asp Pro Arg Ser Val340 345 350gag atc aag atg aac tgg att aaa cag aag gga tac ctt gga gcc atg 1104Glu Ile Lys Met Asn Trp Ile Lys Gln Lys Gly Tyr Leu Gly Ala Met355 360 365act tgg gct atc gac atg gat gac ttc caa gga ctg tgt gga gag aag 1152Thr Trp Ala Ile Asp Met Asp Asp Phe Gln Gly Leu Cys Gly Glu Lys370 375380aac cca ttg atc aag att ctt cat aag cac atg agc tct tac aca gtg 1200Asn Pro Leu Ile Lys Ile Leu His Lys His Met Ser Ser Tyr Thr Val385 390 395 400ccg cct cct cat aca gag aac acc aca ccg act cct gaa tgg gcc cgt 1248Pro Pro Pro His Thr Glu Asn Thr Thr Pro Thr Pro Glu Trp Ala Arg405 410 415cca ccg tca acc cct tcg gat cct tca gaa gga gat ccg atc cct acc 1296Pro Pro Ser Thr Pro Ser Asp Pro Ser Glu Gly Asp Pro Ile Pro Thr420 425 430acc acc aca gct aag cca gct tct acc acc aaa acg acc gtg aag act 1344Thr Thr Thr Ala Lys Pro Ala Ser Thr Thr Lys Thr Thr Val Lys Thr435 440 445act acc act acc aca gca aaa cca cct cag agc gtc att gat gaa gag 1392Thr Thr Thr Thr Thr Ala Lys Pro Pro Gln Ser Val Ile Asp Glu Glu450 455 460aat gat att aat gtg agg cct gaa cca aaa ccc gaa cct caa cca gag 1440Asn Asp Ile Asn Val Arg Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Gln Pro Glu465 470 475 480cct gaa gtt gaa gtg cct cct act gaa aat gaa gtc gat ggt agc gaa 1488Pro Glu Val Glu Val Pro Pro Thr Glu Asn Glu Val Asp Gly Ser Glu485 490 495atc tgc aac tca gac caa gat tat ata ccc gat aag aaa cac tgt gat 1536Ile Cys Asn Ser Asp Gln Asp Tyr Ile Pro Asp Lys Lys His Cys Asp500 505 510aag tac tgg cga tgc gtc aat ggg gaa gca atg cag ttc tct tgt caa 1584Lys Tyr Trp Arg Cys Val Asn Gly Glu Ala Met Gln Phe Ser Cys Gln
序列表 SEQ515 520 525cac gga acg gta ttc aat gtg gaa ctg aac gtg tgt gac tgg cct agc 1632His Gly Thr Val Phe Asn Val Glu Leu Asn Val Cys Asp Trp Pro Ser530 535 540aat gca aca cgt cgc gaa tgt caa caa ccc taa 1665Asn Ala Thr Arg Arg Glu Cys Gln Gln Pro ***545 550<210>4<211>554<212>PRT<213>煙草夜蛾(Manduca sexta)<400>4Met Arg Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu Ala Thr Ala1 5 10 15Val Gln Ser Asp Ser Arg Ala Arg Ile Val Cys Tyr Phe Ser Asn Trp20 25 3Ala Val Tyr Arg Pro Gly Val Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Ile Pro35 40 45Val Glu Lys Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ile Gly Val Thr Glu50 55 60Gly Asn Ser Glu Val Leu Ile Ile Asp Pro Glu Leu Asp Val Asp Lys65 70 75 80Asn Gly Phe Arg Asn Phe Thr Ser Leu Arg Ser Ser His Pro Ser Val85 90 95Lys Phe Met Val Ala Val Gly Gly Trp Ala Glu Gly Ser Ser Lys Tyr100 105 110Ser His Met Val Ala Gln Lys Ser Thr Arg Met Ser Phe Ile Arg Ser115 120 125Val Val Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Asp Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp130 135 140Trp Glu Tyr Pro Gly Ala Ala Asp Arg Gly Gly Ser Phe Ser Asp Lys145 150 155 160Asp Lys Phe Leu Tyr Leu Val Gln Glu Leu Arg Arg Ala Phe Ile Arg165 170 175Val Gly Lys Gly Trp Glu Leu Thr Ala Ala Val Pro Leu Ala Asn Phe180185 190Arg Leu Met Glu Gly Tyr His Val Pro Glu Leu Cys Gln Glu Leu Asp195 200 205Ala Ile His Val Met Ser Tyr Asp Leu Arg Gly Asn Trp Ala Gly Phe210 215 220Ala Asp Val His Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Pro His Asp Gln Trp Ala225 230 235 240Tyr Glu Lys Leu Asn Val Asn Asp Gly Leu His Leu Trp Glu Glu Lys245 250 255
序列表SEQGly Cys Pro Ser Asn Lys Leu Val Val Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Arg260 265 270Ser Phe Thr Leu Ser Ala Gly Asn Asn Asn Tyr Gly Leu Gly Thr Phe275 280 285Ile Asn Lys Glu Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Thr Asn Ala290 295 300Thr Gly Phe Trp Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Thr Glu Val Asp Lys Asp305 310 315 320Asp Ser Gly Trp Thr Lys Lys Trp Asp Glu Gln Gly Lys Cys Pro Tyr325 330 335Ala Tyr Lys Gly Thr Gln Trp Val Gly Tyr Glu Asp Pro Arg Ser Val340 345 350Glu Ile Lys Met Asn Trp Ile Lys Gln Lys Gly Tyr Leu Gly Ala Met355 360 365Thr Trp Ala Ile Asp Met Asp Asp Phe Gln Gly Leu Cys Gly Glu Lys370 375 380Asn Pro Leu Ile Lys Ile Leu His Lys His Met Ser Ser Tyr Thr Val385 390 395 400Pro Pro Pro His Thr Glu Asn Thr Thr Pro Thr Pro Glu Trp Ala Arg405 410 415Pro Pro Ser Thr Pro Ser Asp Pro Ser Glu Gly Asp Pro Ile Pro Thr420 425 430Thr Thr Thr Ala Lys Pro Ala Ser Thr Thr Lys Thr Thr Val Lys Thr435440 445Thr Thr Thr Thr Thr Ala Lys Pro Pro Gln Ser Val Ile Asp Glu Glu450 455 460Asn Asp Ile Asn Val Arg Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Gln Pro Glu465 470 475 480Pro Glu Val Glu Val Pro Pro Thr Glu Asn Glu Val Asp Gly Ser Glu485 490 495Ile Cys Asn Ser Asp Gln Asp Tyr Ile Pro Asp Lys Lys His Cys Asp500 505 510Lys Tyr Trp Arg Cys Val Asn Gly Glu Ala Met Gln Phe Ser Cys Gln515 520 525His Gly Thr Val Phe Asn Val Glu Leu Asn Val Cys Asp Trp Pro Ser530 535 540Asn Ala Thr Arg Arg Glu Cys Gln Gln Pro545 550
權(quán)利要求
1.一種重組桿狀病毒，其特征在于，所述病毒產(chǎn)生的多角體由蝎神經(jīng)毒素、昆蟲幾丁質(zhì)酶和桿狀病毒多角體蛋白構(gòu)成。
2.權(quán)利要求1的重組桿狀病毒，其中多角體蛋白為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法產(chǎn)生一種含外源蛋白質(zhì)的重組多角體，所述方法步驟a)構(gòu)建含有東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素與昆蟲幾丁質(zhì)酶雙價抗蟲基因的中間載體pAcPDIE1-BmkIT-Chib)將中間載體pAcPDIE1-BmkIT-Chi與多角體病毒AcNPV基因組DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞sf9中；c)篩選出重組桿狀病毒AcNPV-BmkIT-Chi。
4.權(quán)利要求2中的重組多角體為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
5.構(gòu)建如權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒的中間載體，其特征在于，將兩種外源基因蝎神經(jīng)毒素基因(BmkIT)和幾丁質(zhì)酶基因(Chi)位于同一載體上，所述載體pAcPDIE1-BmkIT-Chi由氨芐抗性基因Ampr、多角體蛋白基因、昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmkIT)和一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)構(gòu)成；
6.一種殺蟲組合物，其特征在于，所述組合物含權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒和農(nóng)藥可用的載體。
7.權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒在防治棉鈴蟲、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、紅鈴蟲、印度谷螟等鱗翅目農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲方面的應(yīng)用。
全文摘要
東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmkIT)與一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)被克隆到一個可轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞的中間載體pAcPDIE1中獲得含雙價抗蟲基因的重組質(zhì)粒pAcPDIE1－BmkIT－Chi，并將該重組質(zhì)粒與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV基因組DNA共轉(zhuǎn)染到sf9細(xì)胞中，獲得含雙價抗蟲基因的重組桿狀病毒AcNPV－BmKIT－Chi。昆蟲神經(jīng)毒素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用，提高了病毒對棉鈴蟲等多種鱗翅目害蟲的毒殺作用，在新型生物殺蟲劑的開發(fā)利用方面有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N7/01GK1597938SQ20041001254
公開日2005年3月23日 申請日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者梁愛華, 孫毅, 王偉, 柴寶峰, 付月君, 郝嬋娟 申請人:山西大學(xué)