專利名稱：藍(lán)舌病毒的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藍(lán)舌病毒的檢測方法，同時本發(fā)明還涉及藍(lán)舌病毒的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
我國是養(yǎng)羊養(yǎng)牛大國，牛和羊是極其重要的經(jīng)濟(jì)動物，而且牛還是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。藍(lán)舌病毒嚴(yán)重危害和制約我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)耕牛的飼養(yǎng)。我國一直認(rèn)為無此病毒流行，只是在1980年前后才發(fā)現(xiàn)有此病毒所致的藍(lán)舌病。嗣后，該病迅速蔓延，形成全國范圍的動物疫病，并造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。故，自二十世紀(jì)八十年代初，我國政府十分重視藍(lán)舌病的防治?！吨袊M(jìn)出口動物檢疫規(guī)范》把藍(lán)舌病作為我國第一類傳染病，納入檢疫。
動物藍(lán)舌病的病原體藍(lán)舌病毒是一種含有10分子雙鏈RNA(dsRNA)的病毒，每一分子dsRNA編排著一個基因，每一個基因編碼一個蛋白多肽。10分子dsRNA根據(jù)分子大小劃分為大(L)、中(M)、小(S)三個組，并依次命名為L1、L2、L3；M4、M5、M6；S7、S8、S9、S10。其中，L2和L5基因分別編碼型特異性抗原VP2和VP5。藍(lán)舌病毒有25個血清型，每一個血清型藍(lán)舌病毒的VP2和VP5不同，也就是說其L2和L5不同。所以，用不同藍(lán)舌病毒的VP2和VP5作免疫診斷，或用L2和L5作分子診斷不能含蓋25個血清型的藍(lán)舌病毒，只能檢測本血清型的藍(lán)舌病毒。所以，VP2和VP5、L2和L5只能用于藍(lán)舌病毒的定型。S7基因是群特異性抗原VP7的編碼基因，用VP7抗原作免疫學(xué)診斷和用S7作分子診斷則能檢測所有25個血清型的藍(lán)舌病毒。這就是說，藍(lán)舌病毒的S7基因是保守的，也就是說，所有25個血清型的藍(lán)舌病毒的S7基因是相同或基本相同的。所以，欲發(fā)展藍(lán)舌病毒診斷技術(shù)則需針對VP7和S7開展研究。
藍(lán)舌病毒的每一個dsRNA分子由編碼區(qū)和編碼區(qū)兩側(cè)的非編碼區(qū)(NCR)所組成；dsRNA分子5′端的非編碼區(qū)稱之為5′非編碼區(qū)(5′-NCR)；相對應(yīng)的，dsRNA分子3′端的非編碼區(qū)稱之為3′非編碼區(qū)(3′-NCR)。藍(lán)舌病毒的每一個dsRNA分子的5′-NCR和3′-NCR不同；但是，所有血清型的藍(lán)舌病毒S7基因的5′-NCR是相同的，并且非常穩(wěn)定。所以，選擇藍(lán)舌病毒S75′-NCR作分子檢測是非常可靠的。
至今，國內(nèi)外BTV常用的方法仍然是血清學(xué)方法。由于尚無理想的BTV檢測方法用于生產(chǎn)實踐，所以，動物體內(nèi)特異性血清抗體的檢測則成為主要的BTV流行病學(xué)、海關(guān)檢疫和畜牧業(yè)生產(chǎn)中的通用技術(shù)。由于抗體實驗的敏感性較差，該方法只用于比較分析恢復(fù)期和急性期血清樣本的抗體效價，當(dāng)動物恢復(fù)期血清抗體有明顯的增長幅度時才有診斷意義。動物體內(nèi)BTV抗體的存在，只能表明該動物以前感染過BTV，并不能表明當(dāng)前感染。而且，由于BTV抗體與BTV病毒符合物在特定條件下解開后，仍可釋放出活性病毒粒子。盡管存在上述缺點(diǎn)，血清學(xué)試驗仍在用于藍(lán)舌病的診斷、流行病學(xué)研究和海關(guān)檢疫，其中，瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(AGID)、微效價血清中和反應(yīng)(MTSN)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)應(yīng)用最為廣泛。瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗和微效價血清中和反應(yīng)這些方法不僅操作煩瑣、耗時、易受各種因素影響，而且不能檢測低水平存在的BTV。另外，用ELISA方法時，如果在缺少高敏感性和強(qiáng)特異性的BTV抗原的情況下，這些血清學(xué)技術(shù)不能夠直接地檢測到血液中的病毒。競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(c-ELISA)是較為廣泛采用，但是，這種方法不僅操作煩瑣、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、成本高，而且有一定的生物安全隱患。所以，采用瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗和ELISA等基本的免疫學(xué)方法檢測動物體內(nèi)的藍(lán)舌病毒血清抗體，通常難以把住國門和支持畜牧業(yè)生產(chǎn)。
由于在缺少高敏感性和強(qiáng)特異性的BTV抗原的情況下，這些血清學(xué)技術(shù)方法用于血液中BTV抗體的檢測的敏感性很低，所以，目前，有科學(xué)工作者希望應(yīng)用基因重組技術(shù)為檢測動物BTV血清抗體和制備抗BTV抗體而發(fā)展重組BTV VP7抗原。但是，利用基因工程在原核系統(tǒng)中表達(dá)的VP7蛋白抗原性很差；在真核系統(tǒng)中表達(dá)了VP7蛋白則提取抗原不僅工藝煩瑣，而且成本很高。所以，重組基因工程蛋白多肽用于BTV診斷難以成型。
任何病毒的診斷莫過于直接病原學(xué)檢測，其方法有病毒的分離，電鏡下尋找病毒顆粒和病毒核酸的直接檢測。病毒的分離，電鏡下檢測病毒顆粒這些方法耗時、工作煩瑣而且耗費(fèi)昂貴，并且需要一定的病毒濃度，難以達(dá)到病毒早期診斷，更無法推廣應(yīng)用。
所以檢測病毒的特異性核酸序列已成為全世界共同追求的方法，一旦某種病毒的核酸技術(shù)成熟，就具有準(zhǔn)確、早期和快速的特點(diǎn)。病毒核酸檢測技術(shù)主要有兩種，一為核酸分子雜交技術(shù)，另一為PCR技術(shù)。根據(jù)多年的應(yīng)用情況看來，前者明顯沒有后者優(yōu)越，諸如操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，被檢樣品需要提純，難以普及應(yīng)用。所以已讓位于PCR技術(shù)及其延伸的RT-PCR技術(shù)。
隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，人們把發(fā)展早期、準(zhǔn)確診斷和檢測藍(lán)舌病毒的技術(shù)聚焦到分子診斷技術(shù)和方法上。人們正在努力發(fā)展BTV分子診斷技術(shù)和方法，首推是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)。但是，有兩個矛盾一直沒有解決，一是目標(biāo)序列的選擇和引物的設(shè)計，因為要求既要有特異性，又要有敏感性；二是雙鏈RNA(dsRNA)分子的解鏈，因為dsRNA分子被解鏈成單鏈RNA(ssRNA)分子后容易降解，否則，便解鏈不全。所以，國外實驗室常規(guī)采用羥甲基汞解鏈。但是，這種羥甲基汞需要現(xiàn)用現(xiàn)配制，以至該方法在國際上僅在實驗室采用，無法作常規(guī)臨床或現(xiàn)場使用。然而，在我國，即使在實驗室里，用此方法解鏈都有很大困難。
通過藍(lán)舌病毒核酸檢測技術(shù)檢測BTV病原，包括特異性核酸探針與待檢樣品的核酸分子雜交技術(shù)和PCR技術(shù)等。實驗證明，在籃舌病毒標(biāo)準(zhǔn)核酸探針的敏感性值為0.1-10pg。在感染的發(fā)熱期，病毒粒子和模板RNA的水平達(dá)不到這種標(biāo)準(zhǔn)。另外，用這種方法也無法檢測到樣品中低水平存在的BTV或是在組織培養(yǎng)、動物體內(nèi)不能正常增殖的BTV。所以，核酸探針技術(shù)不適用于籃舌病的檢疫，只能作為籃舌病毒的一種研究室鑒定方法。
很明顯，人們把發(fā)展理想的藍(lán)舌病毒診斷技術(shù)和方法已主要集中在逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)上，只要尋找到理想而能推廣的dsRNA分子解鏈方法，優(yōu)選到穩(wěn)定而可靠的藍(lán)舌病毒基因組靶標(biāo)序列，設(shè)計出特異性的RT-PCR引物，解決好dsRNA模板制備系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)和PCR反應(yīng)系統(tǒng)等，就有希望發(fā)展出全新的普遍實用的科技含量高的藍(lán)舌病毒分子檢測技術(shù)，并形成藍(lán)舌病毒分子診斷試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種藍(lán)舌病毒的檢測方法，該方法檢測藍(lán)舌病毒具有準(zhǔn)確、敏感、廉價、安全，并且設(shè)備簡短、操作方便、易于推廣等特征。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測藍(lán)舌病毒的試劑盒，使用該試劑盒，可對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性或定量檢測。本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)A.一對特異性引物根據(jù)已報道的BTV-10的S7片段序列，采用美國PREMIER Biosoft Interna-tional公司的引物設(shè)計軟件Primer Premier 5設(shè)計了一對特異性引物，覆蓋了BTV S7片段5’非編碼區(qū)290bp的片段。由上海生物工程公司合成。各引物干粉用雙蒸水配置成25μmol/L的溶液，備用。引物序列如下正義引物P15′-AGC CAT ATG TTG AGT ATT-3′反義引物P25′-TAG AGA TGG ACA CTA TGG C-3′上述BTV-10是自美國分離的BTV標(biāo)準(zhǔn)株(美國國家獸醫(yī)服務(wù)實驗室NVSL；Maclachlan NJ and Fuller FJ，Genetic Stability in Calves of a Single Strainof Bluetongue Virus[J]，Am J Vet Res，1986，47(4)762-4)。BTV-10株的S7片段序列見論文Timothy FK and Li J KK，Bluetongue Virus Evolution，Sequence Analysis of the Genomic S7 Segment and Major Core Protein VP7[J]Virology，1991，181749-755。
B.dsRNA的解鏈方法為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實驗研究，選擇S7基因5′非編碼區(qū)(5′-NCR)的一段序列作為靶標(biāo)序列，凝練了一對特異性引物，大幅度地將dsRNA解鏈溫度提高到94℃-96℃7-9分鐘(一般是3-5分鐘)，形成了操作簡單的dsRNART-PCR技術(shù)和藍(lán)舌病毒分子診斷試劑盒，可用于藍(lán)舌病毒感染的早期診斷和環(huán)境中藍(lán)舌病毒的檢測。
C.陽性對照重組pUCm-T-BTV-S7質(zhì)粒構(gòu)建了本檢測技術(shù)的陽性對照物重組pUCm-T-BTV-S7質(zhì)粒及其大腸桿菌TGl菌株轉(zhuǎn)化子，以空載pUCm-T質(zhì)粒為陰性對照物。陽性對照重組pUCm-T-BTV-S7質(zhì)粒構(gòu)建見后。所用pUCm-T載體購自Promega公司。
本發(fā)明的檢測方法和操作程序步驟如下
(1)細(xì)胞的培養(yǎng)及病毒的增殖采用含有10％的小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素、10μl/ml谷氨酰胺MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞。待細(xì)胞單層覆蓋達(dá)80％培養(yǎng)瓶底時，棄去培養(yǎng)液，用pH7.2的PBS洗滌。接種病毒懸液。28-37℃吸附1h，棄去病毒懸液。加入6-8ml含有0-2％小牛血清的MEM維持培養(yǎng)基，其他成分與培養(yǎng)基相同。28-37℃培養(yǎng)，出現(xiàn)90％以上細(xì)胞病變(CPE)時，收獲病毒，用于BTV dsRNA基因擴(kuò)增模板的制備。
(2)待測樣品PCR模板的制備采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病毒基因組dsRNA。
讓待測樣品通過7種樣品處理液處理，成為待檢模板。
(A)來自動物待檢樣品BTV dsRNA模板的制備a.取待檢肝素抗凝全血3ml加入樣品處理溶液I，輕柔懸浮血細(xì)胞。1200-1600r/min離心10分鐘，沉淀用樣品處理溶液I再洗滌一次。
b.收集沉淀，于沉淀中分別加入400μl樣品處理溶液II，混勻至液體清亮。
c.加入等體積的樣品處理溶液III，蕩8-12秒，冰浴15分鐘。
d.4℃，11000-13000r/min離心20分鐘，取上清至另一管中。
e.于上清液加入等體積樣品處理溶液IV和1/10體積樣品處理液V，-20℃放置30分鐘。
f.4℃，12000-15000r/min離心10分鐘。沉淀用樣品處理溶液VI洗滌一次，4℃，12000-15000r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl的樣品處理溶液VII，即為待檢模板，用于RT-PCR擴(kuò)增。
(B)來自細(xì)胞培養(yǎng)BTV dsRNA模板的制備a.培養(yǎng)20-36hr的帶毒單層細(xì)胞加入裂解液，及樣品處理溶液II1ml，待溶液清亮后，吸取并移至Ep管中。
b.等體積的樣品處理溶液III，充分混勻，冰浴15分鐘。
c.4℃，11000-13000r/min離心20分鐘，取上層水相，移入一新的Ep管中。
d.加入等體積的樣品處理溶液IV和1/10體積的樣品處理溶液V，-20℃沉淀30分鐘，4℃，12000-15000r/min離心10分鐘，棄上清。
e.用預(yù)冷的樣品處理溶液VI洗滌沉淀一次，4℃，12000-15000r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀自然干燥。沉淀用樣品處理溶液VII10μl溶解，-20℃保存，備著RT-PCR用模板。
(3)待檢樣品dsRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA1.5ml反應(yīng)試管分別加入待檢病毒樣品模板dsRNA提取液3μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液I8.5μl，94-96℃變性7-9分鐘，冰浴5分鐘；向混合物中管內(nèi)加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液II8.5μl，混勻，37℃孵育60-80分鐘，72℃2-4分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；-20℃保存。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液I含有正義引物P1和反義引物P2，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液II含有10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，dNTP，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)試管中依次加入10×PCR緩沖液 2.5μl25mmol/LMgCl21.5μl25μmol/LP1 1.0μl25μmol/LP2 1.0μl10mmol/LdNTPs 0.5μlcDNA 1.0μl無菌水17.0μlTaq DNA聚合酶 0.5μl(5u/μl)總體積為25.0μl混勻反應(yīng)體系，瞬時離心后，覆蓋滅菌液體石蠟20μl；反應(yīng)管放入DNA擴(kuò)增儀中，預(yù)變性94-96℃2-4分鐘，變性94-96℃28-32秒，退火50℃28-32秒，延伸72℃42-46秒，共30-36個循環(huán)。最后，產(chǎn)物DNA延伸補(bǔ)齊72℃7-9分鐘。
陽性對照試管和陰性對照試管處理同上。
陽性對照物含有BTV-10S75′-NCR片段的pUCm-T-BTV-S7重組質(zhì)粒；陰性對照物pUCm-T質(zhì)?？蛰d。
pUCm-T載體購自Promega公司。
(5)檢測結(jié)果的判定(A)TAE用少量雙蒸水溶解后定溶至500ml，取40ml于一燒杯，加入瓊脂糖，加熱使之溶解并澆制電泳平板，剩余液體用作電泳緩沖液。
(B)吸取反應(yīng)管中的下層液體10μl，點(diǎn)樣；按5V/cm電壓降電泳15-30分鐘，在紫外燈下觀察分析結(jié)果，出現(xiàn)與陽性對照平齊的DNA帶即為陽性，否則為陰性。
本發(fā)明藍(lán)舌病毒分子檢測試劑盒之組成該試劑盒由樣品處理液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、PCR反應(yīng)體系、陰性與陽性對照物、液體石蠟、電泳緩沖液、含EB瓊脂糖組成。
(1)7種樣品處理液樣品處理液IPBS溶液；樣品處理液II6mol/L異硫氰酸胍，pH7.0的7.5mol/L檸檬酸鈉，0.75％十二烷基磺酸鈉，0.15mol/Lβ-巰基乙醇；樣品處理液III苯酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1；樣品處理液IV異丙醇；樣品處理液V3mol/L NaAc樣品處理液VI75％乙醇；樣品處理液VIIDEPC處理的雙蒸水；(2)2種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液I含有25μmol/L的正義引物P1，25μmol/L的反義引物P2，焦碳酸二乙酯處理雙蒸水，正義引物P15′-AGC CAT ATG TTG AGT ATT-3′反義引物P25′-TAG AGA TGG ACA CTA TGG C-3′逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液II含有10×RT緩沖液，10mmol/LdNTP，200u/μlM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；(3)PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 25mmol/L MgCl225μmol/L P125μmol/LP2 10mmol/L dNTPscDNA無菌水Taq DNA聚合酶
(4)陽性與陰性對照物為陽性對照物含有BTV-10S75′-NCR片段的pUCm-T-BTV-S7重組質(zhì)粒；陰性對照物pUCm-T質(zhì)?？蛰d，pUCm-T載體購自Promega公司。
(5)液體石蠟商業(yè)化的實驗用液體石蠟(6)電泳緩沖液50倍的TAE電泳緩沖液含有Tris堿242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/L EDTA，pH8.0(7)含EB瓊脂糖含EB染料的商業(yè)化實驗用瓊脂糖。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果至今，國內(nèi)外BTV診斷常用的方法仍然是血清學(xué)方法。由于尚無成熟的BTV檢測方法用于生產(chǎn)實踐，動物體內(nèi)特異性血清抗體的檢測則成為主要的BTV流行病學(xué)、海關(guān)檢疫和畜牧業(yè)生產(chǎn)中的通用技術(shù)。
為此，本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實驗研究，實現(xiàn)了靶標(biāo)序列的選擇，一對特異性引物的凝練，找到了簡單的dsRNA分子的解鏈技術(shù)，從而形成了操作簡單的dsRNART-PCR技術(shù)和藍(lán)舌病毒分子診斷試劑盒。
很明顯，本發(fā)明克服了現(xiàn)有藍(lán)舌病毒檢測和診斷技術(shù)和方法的缺點(diǎn)，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果(1)RT-PCR技術(shù)直接檢測BTV病原體，所以結(jié)果特異、準(zhǔn)確；(2)RT-PCR技術(shù)檢測病毒核酸，所以可進(jìn)行藍(lán)舌病早期診斷；(3)檢測的把物質(zhì)是病毒的dsRNA核酸，所以安全；(4)由于本發(fā)明的技術(shù)形成了檢測藥盒，所以使用方便；(5)由于找到了dsRNA分子解鏈的簡單技術(shù)，以及陽性對照物已通過基因重組技術(shù)克隆到質(zhì)粒載體中，所以檢測藥盒價格低廉；(6)易于推廣，用作常規(guī)現(xiàn)場和臨床使用，亦可用于實驗室研究工作。


圖1.BTV-10型S75′-NCR序列重組質(zhì)粒pUCm-T-BTV-10-S7 PCR及酶切鑒定A.PCR Marker，B.BTV-10 S75′-NCR 序列 RT-PCR 產(chǎn)物，C.pUCm-T-BTV-10-S7酶切產(chǎn)物(BamHI/HindIII)，Marker1000bp，900bp，
800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp圖2.本發(fā)明技術(shù)和檢測藥盒應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的效果MMarker，P陽性對照，1-12可疑藍(lán)舌病綿羊血液樣品圖3.藍(lán)舌病毒HbC3和10型標(biāo)準(zhǔn)株S75′NCR序列RT-PCR產(chǎn)物A.BTV-HbC3，B.BTV-10，C.PCR MarkerMarker1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp具體實施方式
以下結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明實施例1陽性對照物的制備A.連接反應(yīng)將BTV-10S75′-NCR片段的RT-PCR dsDNA產(chǎn)物低熔點(diǎn)瓊脂糖回收，與pUCm-T載體做連接反應(yīng)，總體積為10μl的反應(yīng)體系中分別加入T4DNA連接酶 1.0μlS7PCR回收產(chǎn)物 1.0μlPEG4000 1.0μlpUCm-T載體 1.0μl無菌水 6.0μl混勻，于16℃水浴2hrB.重組pUCm-T-BTV-S7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1菌株，并在其中擴(kuò)增(A)感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)將20μl、25％甘油保存的大腸桿菌TG1菌株接種到20ml(1∶1000)含Amp(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(2)第二天從培養(yǎng)的菌液中吸取1ml的菌體培養(yǎng)物到20mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)2hr，至菌體濃度A＝0.4-0.6。
(3)將菌體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，冰浴10min，使之冷卻到0℃。
(4)3000rpm離心10分鐘，回收菌體，將離心管倒置以去凈培養(yǎng)液。
(5)每管加入2.5ml冰預(yù)冷的50mmol/L CaCl2重懸后，冰浴30min。
(6)3000rpm離心10min回收菌體，將離心管倒置以去凈液體部分。
(7)用總共1ml的冰預(yù)冷的50mmol/LCaCl2重懸菌體，置4℃冰浴1hr，保持2-4hr或過夜再用。
(B)轉(zhuǎn)化(1)新鮮制備或-70℃下保存的100μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕地將細(xì)胞均勻懸浮。
(2)加入10μl pUCm-T-S7連接液，輕輕混勻。
(3)冰上放置30min。
(4)42℃水浴90sec(熱休克)。
(5)冰上放置2分鐘。
(6)加入400mlLB液體培養(yǎng)基，37℃，250rpm蕩培養(yǎng)1hr，復(fù)蘇細(xì)菌。
(7)室溫4000rpm離心5min，吸掉400μl上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞均勻懸浮。
(8)將細(xì)菌涂布于含Amp(50μg/ml)的90mmLB平板上。平板在37℃正向放置1hr以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)板過夜。
(C)篩選從LB平板上挑選可疑的單個菌落，接種到5ml含Amp(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床、200rpm下震蕩培養(yǎng)過夜。
(D)堿裂解法提抽質(zhì)粒DNA(1)將LB液體培養(yǎng)基中生長的菌體各吸取0.5ml，加入等體積的50％甘油，混勻后置于-20℃保存；將剩余的菌體倒入1.5mlEp管中，12000rpm離心5min沉淀菌體。去上清，涼干沉淀。
(2)加入BufferI100μl，懸浮菌體，震蕩器充分震蕩，使之均勻分散。
(3)加入臨時配制的BufferII200μl，上下顛倒混勻，直至透明。
(4)加入BufferIII150μl，上下顛倒混勻，冰浴10min。
(5)12000rpm離心15min，吸取上清。
(6)加入等體積的苯酚，混勻提抽DNA，12000rpm離心15min，吸取上清。
(7)上清用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提抽一次，12000rpm離心15min，吸取上清。
(8)上清再用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)提抽一次，12000rpm離心15min，吸取上清。
(9)加入1/10體積的3mol/l冰醋酸和2倍體積的無水乙醇，混勻后置于-20℃沉淀過夜。
(11)次日取出，12000rpm離心15min，去除上清。
(12)DNA沉淀用75％乙醇漂洗一次，12000rpm離心5min，去除上清。
(13)DNA沉淀于37℃稍干燥，保存于-20℃。
C.藍(lán)舌病毒S7片段的重組pUCm-T-BTV-S7質(zhì)粒的鑒定(1)取BTV-10標(biāo)準(zhǔn)株的RT-PCR產(chǎn)物10μl于1％瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物為290bp的BTVS7 cDNA片斷，與預(yù)先設(shè)計的大小相符。
BTV-10標(biāo)準(zhǔn)株是自美國分離的BTV標(biāo)準(zhǔn)株(美國國家獸醫(yī)服務(wù)實驗室NVSL；Maclachlan NJ and Fuller FJ，Genetic Stability in Calves of a Single Strainof Bluetongue Virus[J]，Am J Vet Res，1986，47〔4〕762-4)。
(2)對提抽的菌落質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在樣品BTV-10的11個菌落中有9個也擴(kuò)增出290bp特異性帶。對PCR陽性的重組質(zhì)粒DNA用BamHI和HindIII雙酶切，結(jié)果皆切出了1條與RT-PCR產(chǎn)物大小一致的小片段。PCR鑒定與酶切分析結(jié)果相一致，表明BTV-10毒株S1基因片段均已克隆到載體質(zhì)粒中。(見圖1)(3)經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析，PCR檢測確認(rèn)有藍(lán)舌病毒VP7基因插入的純化質(zhì)粒pUCm-T-BTV-10-S7，以通用測序引物在ABI PRISM370型自動分析儀上雙向測序，得到290bp的BTVS7基因5′-NCR的序列片段(見PCR擴(kuò)增靶序列表)。
實施例2各種溶液的配制工具酶M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，BamHI和HindIII為Promega公司產(chǎn)品。
Taq DNA聚合酶為生工生物工程公司產(chǎn)品。
RNAsin為華美生物工程公司產(chǎn)品。
主要化學(xué)藥品DEPC為GIBCO公司產(chǎn)品。
瓊脂糖為華美生物工程公司產(chǎn)品。
低熔點(diǎn)瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品。
pUCm-T載體為Promega公司產(chǎn)品。
TG1工程大腸桿菌為Sigma公司產(chǎn)品。
RNA提取所用試劑及溶液裂解液配方6mol/L異硫氰酸胍，7.5mol/L檸檬酸鈉(pH7.0)，0.75％(W/V)十二烷基磺酸鈉，0.15mol/Lβ-巰基乙醇(2-ME)水飽和酚用DEPC處理過的雙蒸水飽和(pH4.0)3mol/LNaAc(pH4.0)氯仿∶異戊醇(24∶1)100％異丙醇75％乙醇(用DEPC處理過的雙蒸水配置)常用緩沖液(1)TAE電泳緩沖液(50×)Tris堿242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/LEDTA(pH8.0)。
(2)凝膠加樣緩沖液(6×)0.25％溴酚蘭，40％蔗糖水溶液。
實施例3檢測試劑的組成物樣品處理液IPBS溶液樣品處理液II6mol/l異硫氰酸胍，7.5mol/l檸檬酸鈉(pH7.0)，0.75％(W/V)十二烷基磺酸鈉，0.15mol/Lβ-巰基乙醇(2-ME)樣品處理液III苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)樣品處理液IV異丙醇樣品處理液V3mol/L NaAc樣品處理液VI75％乙醇樣品處理液VIIDEPC處理的雙蒸水逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液I25μmol/L正義引物P1(5′-AGC CAT ATG TTG AGT ATT-3′)和25μmol/L反義引物P2(5′-TAG AGA TGG ACA CTATGG C-3′)，焦碳酸二乙酯處理的雙蒸水。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液II10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/L dNTP，200u/μlM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液，25mmol/LMgCl2，25μmol/LP1，25μmol/LP2，10mmol/LdNTPs，逆轉(zhuǎn)錄合成的BTVS75′-NCRcDNA，無菌水，Taq DNA聚合酶。
陽性對照物含有BTV-10S75′-NCR片段的pUCm-T-BTV-S7重組質(zhì)粒。
陰性對照物pUCm-T質(zhì)?？蛰d，pUCm-T載體購自Promega公司。
液體石蠟商業(yè)化的實驗用液體石蠟電泳緩沖液50倍的TAE電泳緩沖液含有Tris堿242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/L EDTA，pH8.0含EB瓊脂糖含EB染料的商業(yè)化實驗用瓊脂糖。
實施例4利用試劑盒檢測藍(lán)舌病毒例取湖北省某畜牧場可疑病羊的肝素抗凝全血12份，健康綿羊肝素抗凝全血1份。提取全血BTV核酸進(jìn)行RT-PCR檢測方式同前。應(yīng)用此RT-PCR系統(tǒng)，我們共檢測了12例待測血液樣品。其中11例各擴(kuò)增出一條與標(biāo)準(zhǔn)株BTV-10結(jié)果相同大小的核酸序列，而第7例標(biāo)本血和健康綿羊血未見擴(kuò)增出相應(yīng)的核酸序列。進(jìn)一步用免疫學(xué)方法、透射電子顯微鏡技術(shù)、敏感細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離BTV診斷方法和臨床觀察等聯(lián)合驗證該檢測技術(shù)和方法，結(jié)果證明了本發(fā)明的技術(shù)和分子診斷藥盒的檢測符合率。(見圖2)實施例5利用試劑盒檢測藍(lán)舌病毒例將人肝癌Hep-3B細(xì)胞體外培養(yǎng)以1×108/ml劑量接種于裸鼠的頸背部皮下，以BTV-HbC3(1×104PFU濃度)行瘤內(nèi)注射處理。三周后同時提取腫瘤組織和各器官組織材料的總RNA，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)電泳作dsRNA基因組圖譜分析和用此分子診斷藥盒RT-PCR產(chǎn)物分析，以及群特異性抗體查BTV特異性抗原免疫學(xué)檢測。比較研究結(jié)果顯示，該診斷藥盒的檢測效率優(yōu)于免疫學(xué)方法，敏感度高于PAGE BTV基因組圖譜分析。(見圖3)
本發(fā)明已成為研究室用于BTV分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和實驗動物學(xué)檢測BTV分子和BTV的常規(guī)技術(shù)和方法，現(xiàn)貢獻(xiàn)給社會。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>藍(lán)舌病毒的檢測方法及試劑盒<130>藍(lán)舌病毒的檢測方法及試劑盒<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>290<212>DNA<213>藍(lán)舌病毒10型<400>1taccgtctga tgacctttgt accgtccatt gtagcacgtg tgtagcccca ctcgtaagag60gcatgatgat ttgacgtcgt ccccaccttc ctcccgatta ctcgggcagt ctccttagag120tgctcaacta aatggtagta actaaggata agggttgcgc tcgttgcagg acttaaccga180acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccatct gtcattctgt taacctccac240tatgtctcta tagctttgca gaagatgtca agagtgggca gttaaggaat 290
權(quán)利要求
1.一種藍(lán)舌病毒的檢測方法，其步驟是A、細(xì)胞的培養(yǎng)及病毒的增殖，采用含有10％的小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素、10μl/ml谷氨酰胺、MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待細(xì)胞單層覆蓋達(dá)80％培養(yǎng)瓶底時，棄去培養(yǎng)液，用pH7.2的PBS洗滌，接種病毒懸液，28-37℃吸附，棄去病毒懸液，加入含有0-2％小牛血清的MEM維持培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，出現(xiàn)細(xì)胞病變時，收獲病毒；B、待測樣品PCR模板的制備，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病毒基因組dsRNA，讓待測樣品通過樣品處理溶液處理，成為待檢模板一種是來自動物待檢樣品BTV dsRNA模板的制備首先是取待檢肝素抗凝全血加入PBS緩沖液，輕柔懸浮血細(xì)胞，離心，沉淀用PBS緩沖液洗滌；其次是收集沉淀，于沉淀中加入由異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇組成的裂解液，混勻至液體清亮；第三是加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，靜置；第四是離心，取上清至管中；第五是于上清液加入等體積異丙醇和1/10體積的3mol/L NaAc溶液，放置；第六是離心，沉淀用75％乙醇洗滌，溶解于焦碳酸二乙酯DEPC處理的水，即為待檢模板，用于RT-PCR擴(kuò)增；另一種是來自細(xì)胞培養(yǎng)BTV dsRNA模板的制備首先是培養(yǎng)20-36hr的帶毒單層細(xì)胞加入上述相同的裂解液，待溶液清亮后，吸取并移至Ep管中；其次是加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇，混勻，冰浴；第三是離心，取上層水相，移入Ep管中；第四是加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L NaAc溶液，沉淀，離心，棄上清；第五是用預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清，沉淀干燥，沉淀用DEPC處理的水溶解，保存；C、待檢樣品dsRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA在反應(yīng)試管分別加入待檢病毒樣品模板dsRNA提取液，正義引物P1和反義引物P2，94-96℃變性7-9分鐘，冰浴5分鐘，向混合物中加入10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻，37℃孵育60-80分鐘，72℃ 2-4分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，保存；D、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在反應(yīng)試管中依次加入10×PCR緩沖液、MgCl2、正義引物P1、反義引物P2、dNTPs、cDNA、無菌水、Taq DNA聚合酶，混勻反應(yīng)體系，離心后，覆蓋滅菌液體石蠟，反應(yīng)管放入DNA擴(kuò)增儀中，預(yù)變性94-96℃2-4分鐘，變性94-96℃ 28-32秒，退火50℃ 28-30秒，延伸72℃ 42-46秒，共30-36個循環(huán)，產(chǎn)物DNA延伸補(bǔ)齊72℃ 7-9分鐘；陽性對照試管和陰性對照試管處理同上；E、檢測結(jié)果a.用雙蒸水配制TAE緩沖液，取一定量于一燒杯，加入瓊脂糖，加熱使之溶解，澆制電泳平板，亦用TAE緩沖液作電泳緩沖液；b.吸取反應(yīng)管中的下層液體，點(diǎn)樣，按電壓降5V/cm電泳15-30分鐘，在紫外燈下觀察分析結(jié)果，出現(xiàn)與陽性對照平齊的DNA帶即判讀為陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種藍(lán)舌病毒的檢測方法，其特征在于陽性對照物含BTV-10的S7 5′-NCR片段的pUCM-T-BTV-S7重組質(zhì)粒。
3.實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的藍(lán)舌病毒檢測方法的一種試劑盒，其特征在于該試劑盒由樣品處理液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液、PCR反應(yīng)體系、陰性與陽性對照物、液體石蠟、電泳緩沖液、含EB的瓊脂糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種藍(lán)舌病毒檢測方法的試劑盒，其特征在于樣品處理液IPBS溶液；樣品處理液II6mol/l異硫氰酸胍，pH7.0的7.5mol/l檸檬酸鈉，0.75％十二烷基磺酸鈉，0.15mol/L β-巰基乙醇；樣品處理液III苯酚/氯仿/異戊醇為25/24/1；樣品處理液IV異丙醇；樣品處理液V3mol/LNaAc；樣品處理液VI75％乙醇；樣品處理液VIIDEPC處理的雙蒸水。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種藍(lán)舌病毒檢測方法的試劑盒，其特征在于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液I含有25μmol/L的正義引物P1，25μmol/L的反義引物P2和DEPC處理雙蒸水；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液II含有10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/L dNTP，200u/μl M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種藍(lán)舌病毒檢測方法的試劑盒，其特征在于正義引物P15′-AGC CAT ATG TTG AGT ATT-3′反義引物P25′-TAG AGA TGG ACA CTA TGG C-3′。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藍(lán)舌病毒的檢測方法及試劑盒，首先是細(xì)胞的培養(yǎng)及病毒的增殖；其次是通過在反應(yīng)試管中加入樣品處理液，制備待測樣品和陰陽性對照物PCR模板；第三是通過在反應(yīng)試管中分別加入待檢病毒樣品模板和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液，以逆轉(zhuǎn)錄合成待檢樣品dsRNA的cDNA；第四是通過在反應(yīng)試管中加入PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增合成靶標(biāo)序列。本發(fā)明檢測準(zhǔn)確、敏感、廉價、安全，操作方便，易于推廣。
文檔編號C12Q1/04GK1556216SQ20041001260
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月2日
發(fā)明者董長垣, 桂亦瑞, 張芄瑋, 陳冬峨, 劉軍 申請人:武漢大學(xué)