專利名稱：豬鼻支原體巢式pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎等的豬鼻支原體的檢測方法，特別是豬鼻支原體的巢式PCR檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬鼻支原體AjOAifli1S)是一種能夠引起豬多發(fā)性楽；膜炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎、肺炎等病癥的致病性支原體。作為一種常見病原菌，豬鼻支原體通常由母豬或大豬傳染給小豬。Ross和Spear (1993)證實了能從10%母豬和30% 40%斷奶仔豬的鼻腔分泌物中分離出該支原體。一旦感染，該支原體在上呼吸道迅速傳播并且能從感染豬的肺臟和鼻咽管中分離到。在英國和美國的慢性豬肺炎案例中，50%以上都能檢測到豬鼻支原體的存在；同 時在地方性肺炎暴發(fā)群中幾乎每次都能夠分離到豬鼻支原體。雖然從豬地方性肺炎病肺中分離豬鼻支原體的比例很高，但過去大部分學(xué)者并不認為這種微生物是豬地方性肺炎的病原，理由是從正常健康豬呼吸道內(nèi)也能檢測和分離到豬鼻支原體。直到70年代研究者進行的一系列實驗開始逐步證實了豬鼻支原體和豬肺炎的產(chǎn)生有著直接的相關(guān)性。從捷克斯洛伐克、丹麥、德國和英國分離出的幾株豬鼻支原體通過呼吸道途徑能誘發(fā)豬肺炎(Gois等1968、1971;Gois 和 Valicek 等 1968 ;Martin 等 1968 ;Friis 等 1971 ;Poland 等 1971)。豬鼻支原體的三株捷克斯洛伐克分離物(Tr32，Ploand等1971 ；Ne 110和Ni5，Gois等1971)和一株英國分離物(S218 Gois等1971)，可誘導(dǎo)無菌小豬發(fā)生肺炎。MeyLing(1971)檢查了自然發(fā)病的小豬肺炎，發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體陽性而肺炎支原體為陰性。國內(nèi)寧夏農(nóng)學(xué)院曾以兩株疑似豬鼻支原體(寧農(nóng)3和寧農(nóng)5)培養(yǎng)物滴鼻接種小豬，誘發(fā)輕度肺炎。臺灣林俊宏(2006)用豬鼻支原體分離株ATIT _1、3、7混合物氣管內(nèi)注射可以誘發(fā)部分攻毒豬發(fā)生典型的豬支原體肺炎病變，并成功從大部分攻毒豬肺中分離到豬鼻支原體。迄今為止，對豬鼻支原體檢測主要以分離培養(yǎng)為主，所需要的時間較長，亟需建立一種分子生物學(xué)的敏感性高的快速檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有的以分離培養(yǎng)為主對豬鼻支原體檢測明顯存在檢測時間長的缺陷，提供一種能快速、靈敏、準確地進行檢測的豬鼻支原體的巢式PCR檢測方法。本發(fā)明的豬鼻支原體的巢式PCR檢測方法，主要包括下列步驟
1)提取豬鼻支原體樣品的DNA，低溫保存?zhèn)溆茫?br> 2)以一對特異性引物MhrPOUMhr P02對豬鼻支原體樣品進行第一輪PCR擴增； 其中上游引物 Mhr POl 的序列為5’ -GCATCTATATTTTCGCCAATAGC-3’ ；
下游引物 Mhr P02 的序列為5’ -AGCTAGAGTTTCATCATTACC-3’ ；
所述第一輪PCR擴增方法是在PCR試劑管I中的反應(yīng)液總體積為20 μ 1，包括待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液0.5 1·0μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) I. 0 2· 5μ I, 25mM MgCl2L 0 2· 0μ 1，2· 5mM dNTPs I. 0 3· O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl
O.5 I. Ομ 1，lOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ02 O. 5 1.0 μ 1，5 單位/μ I TaqDNA 聚合酶
O.2 O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ 1，3000 5000g離心2 5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)擴增反應(yīng)；反應(yīng)條件為通過94 96°C解鏈2 5分鐘，然后94 96°C變性40 60秒，50^56 °C復(fù)性60秒，72°C延伸4(Γ90秒，25 35個循環(huán)，最后72°C延伸6 10分鐘，得豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物； 3)以另一對特異性引物Mhr P03, Mhr P04對豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增；
其中上游引物 Mhr P03 的序列為5’ -GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-3’ ；
下游引物 Mhr P04 的序列為5’ -GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’ ；
所述第二輪PCR擴增方法是在PCR試劑管II中加入豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物進行反應(yīng)，其反應(yīng)液總體積為20 μ 1，包括豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物O. 5' I. O μ 1，10XPCRBuffer (Mg2+ Free) I. 0 2· 5 μ I, 25mM MgCl2L 0 2· O μ 1，2· 5mM dNTPs I. 0 3· O μ I,IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5 I. O μ 1，IOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ04 0·5 1·0μ1，5單位/ μ I TaqDNA聚合酶O. 2 O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ 1，300(T5000g離心2 5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)擴增反應(yīng)；反應(yīng)條件為通過94、6°C解鏈2飛分鐘，然后94、6°C變性40 60秒，46 50°C復(fù)性60秒，72°C延伸60 90秒，25 30個循環(huán)，最后72°C延伸6 10分鐘，得豬鼻支原體第二輪PCR產(chǎn)物；
4)電泳檢測
取豬鼻支原體第二輪PCR產(chǎn)物5 10 μ 1，與2 6 μ I 0. 25% (質(zhì)量/體積)溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0. 8 2% (質(zhì)量/體積)Goldview的0. 7 1% (質(zhì)量/體積)瓊脂糖凝膠在電壓8(T100V下電泳2(Γ30分鐘，于凝膠成像系統(tǒng)中透射紫外燈下拍照檢測，樣品孔有一條346bp的核酸條帶為有豬鼻支原體感染或污染的陽性樣品，即可確定待測樣品中含有病原菌豬鼻支原體，反之則沒有。上述dNTPs為dTTP與dATP、dCTP、dGTP四種濃度分別為2. 5mM核苷酸的混合物。進一步，所述第一輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管I中的反應(yīng)液的最佳組分為待測樣品豬鼻支原體 DNA 模板提取液 1·0μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) 2. 0 μ l,25mMMgCl22. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2. 0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl 0. 5 μ 1，IOpmol/μ I 下游引物Mhr Ρ02 0. 5 μ 1，5單位/μ I TaqDNA聚合酶0. 2 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I。進一步，所述第二輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管II中的反應(yīng)液的最佳組分為豬鼻支原體第一輪 PCR 產(chǎn)物 I. O μ 1，10XPCR Buffer(Mg2+ Free) 2. O μ 1，25mM MgCl22. O μ 1，
2.5mM dNTPs 2. 0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物Mhr Ρ03 0. 5 μ 1，IOpmol/μ I 下游引物Mhr Ρ04
0.5 μ I，5單位/ μ I TaqDNA聚合酶0. 2 μ I，滅菌超純水補至總體積20 μ I。本發(fā)明設(shè)計特異引物并成功建立豬鼻支原體巢式PCR檢測技術(shù)，具有特異性強、靈敏度高和檢疫周期短等優(yōu)點和效果
I.目前，針對豬鼻支原體的檢測，都是普通的雙引物的PCR檢測方法，本發(fā)明首次使用巢式PCR實現(xiàn)了該病原的特異性強、靈敏度高達102(XU/ml，而普通雙引物PCR的靈敏度僅 為 106CCU/mL。
2.本發(fā)明對可能豬鼻支原體的組織進行DNA提取及分子檢測，省去了傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的時間，在時間上大大縮短了檢疫周期，從樣品的采集至檢測完成僅需要l(Tl2h即可完成，易于推廣。


圖I是豬鼻支原體巢式PCR第二輪PCR特異性凝膠電泳 圖I中的M為Marker ；1為豬鼻支原體陽性對照；2為空白對照；3為陰性對照；4為豬絮狀支原體；5為豬滑液支原體；6為豬肺炎支原體；7為雞毒支原體；8為胸膜肺炎放線桿菌；9為豬瘟病毒；10為豬流感病毒；11為豬圓環(huán)病毒。 圖2是豬鼻支原體巢式PCR第一輪PCR敏感性凝膠電泳 圖2中，M是2000bp DNA marker，1_6表示以不同含量DNA為模板第一輪PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，其中的I為107CCU/mL樣品、2為106CCU/mL樣品、3為105CCU/mL樣品、4為IO4CCU/mL樣品、5為103CCU/mL樣品、6為102CCU/mL樣品；7為陰性對照。圖3是豬鼻支原體巢式PCR第二輪PCR敏感性凝膠電泳 圖3中，M為2000bp DNA Marker ;1_12表示以不同含量的DNA為模板的第二輪PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖，其中I為109CCU/mL樣品、2為108CCU/mL樣品、3為107CCU/mL樣品、4為106CCU/mL樣品、5 為 105CCU/mL樣品，6 為 104CCU/mL樣品、7 為 103CCU/mL樣品、8 為 IO2CCU/mL 樣品、9 為 Io1CCUAiL 樣品、10 為 10°CCU/mL 樣品、11 為 I(TiCCUAiL 樣品、12 為 l(T2CCU/mL樣品，13為空白對照；14為陰性對照。圖4是21份豬場采集的臨床樣本的豬鼻支原體巢式PCR第二輪PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖。圖4中的M:為2000bp DNA Marker ;1為.陽性對照；2.為空白對照；3.為陰性對照；4-24. 21份豬場采集的臨床樣本的豬鼻支原體巢式PCR第二輪PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步描述。實施例1，本發(fā)明的豬鼻支原體的巢式PCR檢測方法，主要包括下列步驟
I)提取豬鼻支原體樣品的DNA，低溫保存?zhèn)溆茫?br> 本發(fā)明使用的豬鼻支原體樣品的DNA，可按常規(guī)方法提取，具體方法是在提取含有豬鼻支原體的豬肺組織后再按下述步驟進行
I)加IOOmg組織至600 μ I蛋白裂解液，再加入蛋白酶Κ3 μ I (20mg/ml), RNase抑制酶3 μ I (10 mg/ml),混勻，55°C水浴2-4小時，期間振搖數(shù)次。2)力口等體積的酌·:氯仿:異戍醇(25 24 :1),輕振IOmin, I, 2000rpm離心5min。3)取上清(約 300 μ I),加氯仿 600 μ I, I，2000 rpm 離心 5min。4)取上清(約 200 μ I),加氯仿 600 μ I, I，2000 rpm 離心 5min。5)取上清(約200 μ I )，加2倍的無水乙醇，O. 4倍的5mol/L的醋酸銨，輕輕顛倒混勻，放置20min.
6) 1,2000 rpm離心5min,棄上清,加入70%乙醇,洗2次(1，2000 rpm離心lmin)。7)加50 μ I的滅菌去離子水或者TE溶液。得本發(fā)明所需要使用的豬鼻支原體樣品的DNA。2)以一對特異性引物Mhr POUMhr P02對豬鼻支原體樣品進行第一輪PCR擴增； 其中上游引物 Mhr POl 的序列為5’ -GCATCTATATTTTCGCCAATAGC-3’ ；
下游引物 Mhr P02 的序列為5’ -AGCTAGAGTTTCATCATTACC-3’ ；
上述引物Mhr POl和Mhr P02分別是由DNA合成儀按堿基序列合成的DNA片段；是根據(jù)GeneBank公布豬鼻支原體的P37序列的堿基組成差異(登陸號X14140. I、M37339. I、CP002669. I、CP00323. I、CP002170. I、⑶722587. 1)，利用引物設(shè)計軟件(Oligo7 )設(shè)計。所述第一輪PCR擴增方法是在PCR試劑管I中的 反應(yīng)液總體積為20 μ I，包括待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液O. 5 I. O μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) I. 0 2· 5μ I, 25mM MgCl2L 0 2· 0μ 1，2· 5mM dNTPs I. 0 3· O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POlO. 5 I. 0μ 1，lOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ02 O. 5 1.0 μ 1，5 單位/μ I TaqDNA 聚合酶O. 2 O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ 1，3000 5000g離心2 5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)擴增反應(yīng)；反應(yīng)條件為通過94 96°C解鏈2 5分鐘，然后94 96°C變性40 60秒，50^56 °C復(fù)性60秒，72°C延伸4(Γ90秒，25 35個循環(huán)，最后72°C延伸6 10分鐘，得豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物；
3)以另一對特異性引物MhrP03, Mhr P04對豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增；
其中上游引物 Mhr P03 的序列為5’ -GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-3’ ；
下游引物 Mhr P04 的序列為5’ -GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’ ；
上述引物Mhr P03、Mhr P04分別是由DNA合成儀按堿基序列合成的DNA片段；可根據(jù)文獻 Caron J et al. , 2000, Diagnosis and Differentiation of Mycoplasmahyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplificationof the p36 and p46 Genes 序列進行合成。所述第二輪PCR擴增方法是在PCR試劑管II中加入豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物進行反應(yīng)，其反應(yīng)液總體積為20 μ 1，包括豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物0. 5' I. O μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) I. 0 2· 5 μ I, 25mM MgCl2I. 0 2· O μ I，2· 5mM dNTPs1·0 3·0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5 I. O μ 1，IOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ040. 5 Ι.ΟμΙ，5單位/μ I TaqDNA聚合酶0. 2 0. 5μ1，滅菌超純水補至總體積20μ1，300(T5000g離心2 5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)擴增反應(yīng)；反應(yīng)條件為通過94 96°C解鏈2 5分鐘，然后94 96°C變性40 60秒，46 50°C復(fù)性60秒，72°C延伸60 90秒，25 30個循環(huán)，最后72°C延伸6 10分鐘，得豬鼻支原體第二輪PCR產(chǎn)物；
4)電泳檢測
取豬鼻支原體第二輪PCR產(chǎn)物5 10 μ 1，與2 6 μ I 0. 25% (質(zhì)量/體積)溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0. 8 2% (質(zhì)量/體積)Goldview的0. 7 1% (質(zhì)量/體積)瓊脂糖凝膠在電壓8(T100V下電泳2(Γ30分鐘，于凝膠成像系統(tǒng)中透射紫外燈下拍照檢測，樣品孔有一條346bp的核酸條帶為有豬鼻支原體感染或污染的陽性樣品，即可確定待測樣品中含有病原菌豬鼻支原體，反之則沒有。上述dNTPs為dTTP與dATP、dCTP、dGTP四種濃度分別為2. 5mM核苷酸的混合物。
所述第一輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管I中的反應(yīng)液的具體組分可分別為
I、待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液O. 5μ 1，10XPCR Buffer(Mg2+ Free) 1.0μ I, 25mM MgCl2L O μ 1,2. 5mM dNTPs I. O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl O. 5μ I,lOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ02 O. 5μ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶O. 2 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I02、待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液O. 5 μ 1，IOXPCR Buffer (Mg2+ Free) 2.5μ I, 25mM MgCl22. Ομ 1,2. 5mM dNTPs 3.0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl I. 0μ I,lOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ02 I. 0μ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I03、待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液1.0 μ 1，IOXPCR Buffer (Mg2+ Free) 1.0μ I, 25mM MgCl2L O μ 1,2. 5mM dNTPs I. O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl 0. 5μ I, lOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ02 0. 5μ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶O. 2 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I04、待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液1.0 μ 1，IOXPCR Buffer (Mg2+ Free) 2.5μ I, 25mM MgCl22. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 3.0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl I. 0μ I,lOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ02 I. 0μ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I05、待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液1·0μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free)2.0 μ 1, 25mM MgCl22. 0 μ 1, 2. 5mM dNTPs 2. 0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl O. 5μ I,lOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ02 0.5 4 1，5單位/^1 TaqDNA聚合酶O. 2 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I0綜上所述，第一輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管I中的反應(yīng)液的組分在下述范圍內(nèi)均可反就成功，即待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液O. 5 I. Ομ I, IOXPCR Buffer (Mg2+Free) I. 0 2· 5 μ I, 25mM MgCl2L 0^2. O μ I, 2. 5mM dNTPs I. 0 3· O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl 0.5 1.(^1，10 11101/^1下游引物他『Ρ02 O. 5 1.0 μ 1，5 單位/μ ITaqDNA聚合酶O. 2 O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I。所述第二輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管II中的反應(yīng)液的具體組分可分別為
1、豬鼻支原體第一輪PCR 產(chǎn)物 0. 5 μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) I. O μ I, 25mMMgCl2L O μ 1,2. 5mM dNTPs I. O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5 μ 1，IOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ04 0. 5μ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶0. 2 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I,
2、豬鼻支原體第一輪PCR 產(chǎn)物 0. 5· μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) 2.5 μ I, 25mMMgCl22. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 3.0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 I. O μ I, lOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ04 1.0μ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶0. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積
20μ I,
3、豬鼻支原體第一輪PCR 產(chǎn)物 I. O μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) I. O μ I, 25mMMgCl2L O μ 1,2. 5mM dNTPs I. O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5 μ 1，IOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ04 0. 5μ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶0. 2 μ 1，滅菌超純水補至總體積
20μ I。
4、豬鼻支原體第一輪 PCR 產(chǎn)物 I. O μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) 2.5 μ I,25mM MgCl22. Ομ 1,2. 5mM dNTPs 3.0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 I. O μ I, IOpmol/μ I下游引物Mhr Ρ04 Ι.Ομ I, 5單位/ μ I TaqDNA聚合酶O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積 20 μ I05、豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物 I. O μ 1，IOXPCR Buffer (Mg2+ Free) 2. O μ l,25mMMgCl22. Ομ 1,2. 5mM dNTPs 2· 0 μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5 μ 1，IOpmol/μ I 下游引物Mhr Ρ04 O. 5 μ 1，5單位/μ I TaqDNA聚合酶O. 2 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I。綜上所述，第二輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管II中的反應(yīng)液的組分在下述范圍內(nèi)均可反就成功，即豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物0.5 1·0μ1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free)1·0 2·5 μ I, 25mM MgCl2L 0 2· O μ 1，2· 5mM dNTPs I. 0 3· O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物Mhr Ρ03 O. 5 I. Ομ 1，lOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ04 O. 5 Ι.Ομ 1，5 單位 / μ I TaqDNA 聚合酶O. 2^0. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ I。實施例2，為了驗證豬鼻支原體的特異性，可用所述電泳檢測方法分別對豬絮狀支原體、豬滑液支原體、豬肺炎支原體、.雞毒支原體、胸膜肺炎放線桿菌、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬圓環(huán)病毒及豬鼻支原體陰陽性對照進行檢測。各菌株擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，豬鼻支原體可以擴增出346bp的條帶，而陰性對照和其它菌株沒有擴增出特異條帶。實施例3，普通雙引物PCR的靈敏度試驗
1.通過豬鼻支原體的變色單位測定，測得豬鼻支原體的含量為109CCU/mL;
2.將上述豬鼻支原體菌體原液作梯度稀釋為107(XU/mL、106(XU/mL、105(XU/mL、104CCU/mL、103CCU/mL、102CCU/mL、提取各菌體的 DNA，取 I μ I
為模板，分別只用特異性引物Mhr Ρ01/Ρ02進行一次PCR擴增，擴增后電泳結(jié)果見圖2。經(jīng)重復(fù)三次擴增均得到同樣結(jié)果。圖2 中，M 是 2000bp DNA marker; 1-6 表示 DNA 模板分別為 107CCU/mL、106CCU/mL、105CCU/mL、104CCU/mL、103CCU/mL、102CCU/mL 的豬鼻支原體的一次 PCR擴增產(chǎn)物。圖 2 顯示，單獨使用特異性引物Mhr P01/P02進行一次PCR擴增，最低可檢測到的病原菌為IO6CCU/
mLo實施例4，Nested PCR的靈敏度試驗
將豬鼻支原體菌體原液作梯度稀釋為109CCU/mL、108CCU/mL、107CCU/mL、106CCU/mL、105CCU/mL、104CCU/mL、103CCU/mL、102CCU/mL、lOtCU/mL、100CCU/mL、K^CCU/mL、KT2CCU/mL。提取DNA后，取1μ I
作模板，按實施例I的步驟3和步驟4依次進行第一輪、第二輪兩輪擴增。
經(jīng)兩輪擴增所得的產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖3，圖中，M是2000bp DNA Marker ;1_12表示 DNA 模板分別為 109CCU/mL、108CCU/mL、107CCU/mL、106CCU/mL、105CCU/mL、104CCU/mL、103CCU/mL、102CCU/mL、lOtCU/mL、10°CCU/mL、lOtCU/mL、l(T2CCU/mL 的豬鼻支原體的擴增產(chǎn)物，13為空白對照，14為陰性對照。圖3顯示，經(jīng)兩輪PCR擴增，最低可檢測到的病原菌為 102CCU/mL。與實施例3的圖2相比，可見本發(fā)明Nested PCR采用兩次PCR擴增，其檢測的靈敏度遠高于實施例3單獨使用特異引物Mhr P01/P02進行一次PCR擴增的檢測靈敏度。對豬鼻支原體檢測具有特異性強、靈敏度高和檢疫周期短等優(yōu)點和效果。實施例5, Nested PCR法進行豬肺組織中豬鼻支原體檢測
從豬場采集的臨床樣本21份，取30mg組織，按實施例I步驟I提取DNA，按實施例I的步驟2和步驟3依次進行第一輪和第二輪兩輪擴增。
兩輪PCR擴增后的電泳結(jié)果見圖4，圖中可見，在21份樣本中有11份樣品出現(xiàn)特異性346bp，陽性檢出率為52. 4%。能及時發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體感染。
權(quán)利要求
1.一種豬鼻支原體的巢式PCR檢測方法，其特征在于包括下列步驟 1)提取豬鼻支原體樣品的DNA，低溫保存?zhèn)溆茫? 2)以一對特異性引物MhrPOUMhr P02對豬鼻支原體樣品進行第一輪PCR擴增； 其中上游引物 Mhr POl 的序列為5’ -GCATCTATATTTTCGCCAATAGC-3’ ； 下游引物 Mhr P02 的序列為5’ -AGCTAGAGTTTCATCATTACC-3’ ； 所述第一輪PCR擴增方法是在PCR試劑管I中的反應(yīng)液總體積為20 μ 1，包括待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液0.5 1·0μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) I. 0 2· 5μ I, 25mM MgCl2 I. 0 2· 0μ 1，2· 5mM dNTPs I. 0 3· O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POlO. 5 I. 0μ 1，lOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ02 O. 5 1.0 μ 1，5 單位/μ I TaqDNA 聚合酶O. 2 O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ 1，3000 5000g離心2 5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)擴增反應(yīng)；反應(yīng)條件為通過94 96°C解鏈2 5分鐘，然后94 96°C變性40 60秒，50^56°C復(fù)性60秒，72°C延伸4(Γ90秒，25 35個循環(huán)，最后72°C延伸6 10分鐘，得豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物； 3)以另一對特異性引物MhrP03, Mhr P04對豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增； 其中上游引物 Mhr P03 的序列為5’ -GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-3’ ； 下游引物 Mhr P04 的序列為5’ -GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’ ； 所述第二輪PCR擴增方法是在PCR試劑管II中加入豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物進行反應(yīng)，其反應(yīng)液總體積為20 μ 1，包括豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物O. 5' I. O μ 1，10XPCRBuffer (Mg2+ Free) I. 0 2· 5 μ I, 25mM MgCl2 I. 0 2· O μ 1，2· 5mM dNTPs I. 0 3· O μ I,IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5 I. O μ 1，IOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ04 O. 5 1.0 μ 1，5單位/ μ I TaqDNA聚合酶O. 2 O. 5 μ 1，滅菌超純水補至總體積20 μ 1，300(T5000g離心2 5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)擴增反應(yīng)；反應(yīng)條件為通過94、6°C解鏈2飛分鐘，然后94、6°C變性40 60秒，46 50°C復(fù)性60秒，72°C延伸60 90秒，25 30個循環(huán)，最后72°C延伸6 10分鐘，得豬鼻支原體第二輪PCR產(chǎn)物； 4)電泳檢測 取豬鼻支原體第二輪PCR產(chǎn)物5 10 μ 1，與2 6 μ I 0. 25% (質(zhì)量/體積)溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0. 8 2% (質(zhì)量/體積)Goldview的0. 7 1% (質(zhì)量/體積)瓊脂糖凝膠在電壓8(T100V下電泳2(Γ30分鐘，于凝膠成像系統(tǒng)中透射紫外燈下拍照檢測，樣品孔有一條346bp的核酸條帶為有豬鼻支原體感染或污染的陽性樣品，即可確定待測樣品中含有病原菌豬鼻支原體，反之則沒有。
2.如權(quán)利要求I所述的豬鼻支原體的巢式PCR檢測方法，其特征在于所述dNTPs為dTTP與dATP、dCTP、dGTP四種濃度分別為2. 5mM核苷酸的混合物。
3.如權(quán)利要求I或2所述檢測豬鼻支原體巢式PCR方法，其特征在于所述第一輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管I中的反應(yīng)液的最佳組分為待測樣品豬鼻支原體DNA模板提取液I. O μ 1，10XPCR Buffer (Mg2+ Free) 2. O μ l,25mM MgCl2 2. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2. O μ I, IOpmol/μ I 上游引物 Mhr POl O. 5 μ 1，IOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ02 O. 5 μ 1，5 單位/μ I TaqDNA聚合酶0. 2 μ I,滅菌超純水補至總體積20 μ I。
4.如權(quán)利要求I或2所述檢測豬鼻支原體巢式PCR方法，其特征在于所述第二輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管II中的反應(yīng)液的最佳組分為豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物I. O μ 1，IOXPCRBuffer (Mg2+ Free) 2. O μ l,25mM MgCl2 2. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2· O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5μ 1，lOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ04 0.5“1，5單位/^1 TaqDNA 聚合酶O.2 μ I,滅菌超純水補至總體積20 μ I。
5.如權(quán)利要求3所述檢測豬鼻支原體巢式PCR方法，其特征在于所述第二輪PCR擴增的PCR反應(yīng)管II中的反應(yīng)液的最佳組分為豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物I. O μ 1，10XPCRBuffer (Mg2+ Free) 2. O μ l,25mM MgCl2 2. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2· O μ 1，IOpmol/μ I 上游引物 Mhr Ρ03 O. 5μ 1，lOpmol/μ I 下游引物 Mhr Ρ04 0.5“1，5單位/^1 TaqDNA 聚合酶O.2 μ I,滅菌超純水補至總體積20 μ I。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎等的豬鼻支原體的巢式PCR檢測方法，主要步驟包括1)提取豬鼻支原體樣品的DNA，低溫保存?zhèn)溆茫?)以一對特異性引物MhrP01、MhrP02對豬鼻支原體樣品進行第一輪PCR擴增；3)以另一對特異性引物MhrP03、MhrP04對豬鼻支原體第一輪PCR產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增；4)對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。如果存在346bp的特異性條帶，則確定所檢測的病菌為豬鼻支原體。本方法在微量病原菌的存在下，都可以準確檢出，只要有102CCU/mL病原菌存在，即可檢測出。本發(fā)明的優(yōu)點是檢測速度快、特異性強、靈敏度高和易于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102676658SQ201210115339
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者馮志新, 劉茂軍, 武昱孜, 熊祺琰, 白方方, 邵國青 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院