專利名稱：硫化物醌氧化還原酶腸道定向表達載體及其細胞系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及硫化物醌氧化還原酶腸道定向表達載體及其細胞系，屬于生物技術領域。ニ背景技術：
環(huán)境友好型養(yǎng)殖業(yè)是畜牧業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的新方向。改革開放以來，隨著我國國民經(jīng)濟的全面、快速發(fā)展，人民生活需求水平的不斷提高，我國畜牧產(chǎn)業(yè)規(guī)?；〉昧丝涨暗陌l(fā)展。然而，隨著畜牧場規(guī)?；?、集約化和機械化程度的提高，畜禽糞便已成為ー個不可忽視的污染源。畜禽糞便不僅會帶來水體和土壤污染，也會帶來嚴重的空氣污染。據(jù)檢測，ー個年出欄10萬頭的養(yǎng)豬場，每小時可向大氣排出近148 kg氨氣(NH3)、13.5 kg硫化氫(H2S)、24 kg粉塵和14億個菌體，這些物質(zhì)的污染半徑可達5 km，而塵埃和病原微生物可 隨風傳播30 km以上。如何降低這些廢氣排放一直是困擾大型養(yǎng)豬場的難題之一。目前，豬場對這些廢氣只能做到一定程度上的控制，不能做到真正無害化。主要采取的控制方法有吸附法、焚燒法、化學與生物除臭劑法、洗滌法及生物過濾等，這些方法對H2S、NH3等有害氣體有一定的控制作用，但因成本較高或是二次污染問題而不能大規(guī)模運用。所以尋求一種經(jīng)濟可行的廢氣無害化處理方案很有必要。硫化物-醌氧化還原酶，即Sul de-Quinone Reductase 或 Sul de: QuinoneOxidoreductase (SQR)，廣泛存在于光營養(yǎng)和化學營養(yǎng)細菌(綠菌屬、莢膜桿菌屬、著色菌屬等)中，它是一條57kDa的多肽，能夠分解H2S等硫化物。1997年，Shutz等從莢膜紅桿菌中分離純化出SQR，并將SQR基因成功克隆于大腸桿菌中，結(jié)果顯示，大腸桿菌表達的SQR具有生物酶活性。另外很重要的一點是，SQR降解H2S的反應是在細胞外進行的，無需進入細胞內(nèi)。基于以上研究進展，利用SQR分解硫化物廢氣的生物學特性，綜合現(xiàn)在的分子和細胞生物學手段，采用轉(zhuǎn)基因手段在目的動物細胞中導入具有特殊生物學功能的外源SQR基因，通過轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術途徑獲得能在腸道中穩(wěn)定表達和穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)SQR基因動物新品種，將可從源頭上解決動物糞便中H2S廢氣減排環(huán)境污染問題。腸道脂肪酸結(jié)合蛋白(IFABP)是ー類是重要的脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白，其特異地表達于小腸上皮吸收細胞，與食物中長鏈脂肪酸(LCFA)的吸收、靶向運輸及代謝密切相關。腸道脂肪酸結(jié)合蛋白啟動子是IFABP特異表達于腸道的關鍵，相關研究顯示IFABP啟動子具有種間保守性，大鼠IFABP啟動子能夠啟動人生長激素在小鼠腸道中特異表達。所以本發(fā)明利用大鼠IFABP啟動子構(gòu)建SQR基因的腸道定向表達載體，并進ー步轉(zhuǎn)染體細胞，建立成纖維細胞系，解決了轉(zhuǎn)基因動物腸道目的基因定向表達及其有效發(fā)揮其生物學功能的關鍵技術。
發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明的目的是提供SQR腸道定向表達載體pcDNA3. I-IFABP- SQR-GFP和pLenti4-IFABP- SQR-GFP慢病毒載體的構(gòu)建方法及構(gòu)建相關轉(zhuǎn)基因細胞系的技術體系，是專用于生命科學和畜牧科研與生產(chǎn)的環(huán)保型的生物制品，可作為開展環(huán)境友好型轉(zhuǎn)基因豬研究提供必要的生物材料及其相關關鍵技術方法參考。技術方案穩(wěn)定表達SQR的真核細胞系,是通過以下方法生產(chǎn)的,包括(一)SQR腸道定向表達載體pcDNA3. I-IFABP- SQR-GFP的構(gòu)建 I. SQR真核表達載體pcDNA3. I (-) -SQR-Myc構(gòu)建
根據(jù)SQR基因序列，設計PCR引物Pl，P2，為了加入Myc標簽，P2引物3，端末端引入Myc-Tag序列。以原核載體pRSETA-SQR為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物(SQR-Myc基因片段)與pMD-18T使用T4 DNA 連接酶連接，獲得克隆載體pMD18T_SQR_ Myc0將pMD18T-SQR-Myc用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I雙酶切，純化回收目的片段SQR-Myc，同時用相同內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pcDNA3. 1(_)，將酶切回收后的pcDNA3. 1(_)質(zhì)粒片段和SQR-Myc目的片段由T4 DNA連接酶連接，獲得真核表達載體pcDNA3. I (-) -SQR-Myc(圖I)。2.中間載體 pMD18T-SQR-GFP 的構(gòu)建
為了便于后期轉(zhuǎn)基因細胞(系)的檢測，在基因載體結(jié)構(gòu)序列中導入GFP標記基因，并采用重疊PCR擴增法獲得SQR-GFP融合基因片段。以pcDNA3. I (-) -SQR-Myc為模板設計PCR反應引物P3、P4，以pEGFP-C3為模板設計PCR反應引物P5、P6，引物P4、P5均在5’端含有GFP和SQR-Myc部分序列。以pcDNA3. I㈠-SQR-Myc質(zhì)粒為模板，使用引物P3、P4，擴增SQR-Myc片段(1334bp)，以質(zhì)粒pEGFP-C3為模板，使用引物P5、P6，擴增GFP片段(744bp)。以上述擴增產(chǎn)物SQR-Myc片段及GFP片段為模板，使用引物P3和P6，采用重疊PCR方法將兩種組件融合，得到SQR-GFP片段(2048bp)，將該片段與pMD_18T載體通過T4 DNA連接酶連接處理，獲得中間載體PMD18T-SQR-GFP。3.融合蛋白 SQR-GFP 表達載體 pcDNA3. I (-) -SQR-GFP 的構(gòu)建
將中間載體PMD18T-SQR-GFP用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I雙酶切，純化回收目的片段(2kb)，同時用相同內(nèi)切酶酶切pcDNA3. I (-)，純化回收大片段(5. 3kb)，T4 DNA連接酶連接上述兩個酶切片段獲得SQR-GFP表達載體pc DNA3. I (-)-SQR-GFP (圖2)。 4. SQR 腸道特異表達載體 pcDNA3. I (-) -IFABP-SQR-GFP 的構(gòu)建
為了在載體pcDNA3. I (-)中插入IFABP啟動子，根據(jù)Genebank中IFABP (基因序列號NM_013068. I)啟動子序列設計引物P7、P8，PCR擴增獲得IFABP片段(1352bp)，將該片段純化后進行TA克隆獲得重組載體pMD18T-IFABP。用Nhe I和Xba I對pMD18_IFABP進行雙酶切，回收得到的IFABP片段克隆到質(zhì)粒pcDNA3. I-SQR-GFP相應的酶切位點，得到重組載體 pcDNA3. I-IFABP- SQR-GFP (圖 3)。5.攜帶IFABP-SQR-GFP基因片段的慢病毒載體制備
pcDNA3. 1-IFABP-SQR-GFP質(zhì)粒采用Nhe I、Kpn I雙酶切，并經(jīng)瓊脂糖凝膠分離純化后獲取目的片段IFABP-SQR-GFP。相同酶切方法處理pLenti4質(zhì)粒獲取含慢病毒轉(zhuǎn)運載體序列的DNA片段，瓊脂糖凝膠分離純化后用快速連接試劑盒與IFABP-SQR-GFP連接，獲得新的重組質(zhì)粒pLenti4-IFABP- SQR-GFP,再與病毒輔助質(zhì)粒pC_GP、pR-Rev、pC-VSVG通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染J1EK293細胞，隨后采用高速離心法濃縮，制備慢病毒病毒載體。(ニ)轉(zhuǎn)SQR基因豬體細胞系的制備
I.轉(zhuǎn)SQR基因豬胎兒腸上皮細胞系的建立
采用組織塊培養(yǎng)方法。采集剛出生仔豬小腸，將小腸組織PBS充分洗浄后，剪成小于Imm3的碎片，用含5% FBS、添加表皮生長因子、胰島素和肝素鈉的DMEM/F12懸浮組織塊并接種于培養(yǎng)瓶中，間隔24h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)直至獲得細胞單層。利用上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶的敏感度不同，采用胰蛋白酶消化法去除其中的成纖維細胞，經(jīng)過胰蛋白酶的多次消化獲得純度高的豬腸上皮細胞系。攜帯IFABP-SQR-GFP的慢病毒轉(zhuǎn)染豬腸上皮細胞，24 48小時后進行瞬時轉(zhuǎn)染，取部分細胞置熒光倒置顯微鏡下觀察，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性細胞，并經(jīng)傳代培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定表達SQR的細胞細胞株(系)。2.轉(zhuǎn)SQR基因豬胎兒成纖維細胞系制備
采用酶消化法進行體外培養(yǎng)。將豬胎兒皮膚用剪刀剪碎，放入0.25%的胰蛋白酶消化成單個細胞，取少量細胞懸液進行細胞計數(shù)后，適量稀釋細胞懸液于含10% FCS的DMEM/ F12中進行培養(yǎng)，待細胞長到100%匯合時進行反復傳代，獲得純化豬成纖維細胞。pcDNA3. 1-IFABP-SQR-GFP基因載體采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染豬成纖維細胞，24^48小時后進行瞬時轉(zhuǎn)染效率檢測，同時加入適量濃度的G418 (300 Ug/ml)進行反復篩選，經(jīng)四周以上傳代培養(yǎng)，篩選鑒定出穩(wěn)定表達SQR的細胞克隆，挑取單克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)獲得SQR穩(wěn)定表達細胞株(系)。有益效果
本發(fā)明成功構(gòu)建了 SQR的腸道定向表達載體pcDNA3. 1-IFABP-SQR-GFP和pLenti4-IFABP- SQR-GFP慢病毒載體，并通過該兩種攜帶目的基因SQR、標記基因GFP以及其腸道特異表達啟動子IFABP的真核基因載體轉(zhuǎn)染體細胞，經(jīng)反復傳代培養(yǎng)、篩選及其相關分子和細胞生物學鑒定技術途徑獲得能夠穩(wěn)定遺傳SQR的豬胎兒成纖維細胞株(系)。本發(fā)明首次將原核表達的SQR基因?qū)胝婧吮磉_載體中，使SQR能夠在真核細胞中表達，同時將腸道特異啟動子連入載體中，使得SQR在動物腸道中定向表達，由此獲得了轉(zhuǎn)SQR基因的豬胎兒成纖維細胞株，為進ー步開展體細胞核移植克隆轉(zhuǎn)SQR基因胚胎制備，培育減少污染物排放的轉(zhuǎn)基因豬新品種提供必要的轉(zhuǎn)基因生物材料和關鍵技術體系支撐。四

圖 I :pcDNA3. 1(-)-SQR-Myc 構(gòu)建流程圖
圖 2 pcDNA3. I (-) -SQR-GFP 構(gòu)建流程圖
圖 3 pcDNA3. I (-) -IFABP-SQR-GFP 構(gòu)建流程圖
圖4 :攜帯SQR目的基因和GFP標記基因的慢病毒構(gòu)建流程圖
圖5 =SQR-Myc擴增片段電泳圖
M: DL2000 Marker; 1-6: SQR-Myc 擴增條帶
圖6 pMD-18T-SQR-Myc酶切鑒定結(jié)果
Ml: DL2000 Marker; M2: DL5000 Marker; 1,2,3,4:重組質(zhì)粒pMD-18T_SQR-Myc經(jīng)Xho I、Kpn I雙酶切；5，6:重組質(zhì)粒EcoR I、Hind III雙酶切圖 7 pcDNA3. I (-) -SQR-Myc 雙酶切鑒定
M: DL5000 Marker; 1-8:重組質(zhì)粒 pcDNA3. I (-) SQR-Myc 經(jīng) Xho I、Kpn I 雙酶切結(jié)
果
圖8 =PCR擴增SQR、GFP片段電泳圖
M: DL2000 Marker; A : 1-4 為 SQR-Myc 擴增條帶 B : 1-4 為 GFP 擴增條帶 圖9 =SQR-GFP擴增片段電泳圖M: DL2000 Marker; 1-6: SQR-GFP 擴增條帶 圖 10 pcDNA3. I-SQR-GFP 酶切鑒定
M: Marker; I:重組質(zhì)粒pcDNA3. 1-SQR-GFP經(jīng)Xho I ,Kpn I 雙酶切(5300+2038 bp) 圖11 =IFABP擴增片段電泳圖 M: DL5000 Marker; I, 2: IFABP 擴增條帶 圖 12 pcDNA3. I-IFABP-SQR-Myc-GFP 酶切鑒定
M: Marker I:重組質(zhì)粒 pcDNA3. l-IFABP-SQR-Myc-GFP 由 Nhe I and Xba I 雙酶切 圖13真核細胞表達的SQR蛋白檢測
I pcDNA3. I (-) -SQR-Myc 轉(zhuǎn)染 HEK293 胞漿蛋白；2 pcDNA3. I (-) -SQR-Myc 轉(zhuǎn) 染 HEK293培養(yǎng)基上清蛋白；泳道3 :空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293胞漿蛋白圖14 =IFABP啟動SQR基因表達的轉(zhuǎn)基因陽性上皮細胞
A :白光下豬腸上皮細胞；B :470nm光波激發(fā)的豬腸上皮細胞(呈綠色熒光細胞為GFP表達細胞);C :豬成纖維細胞白光下；D :豬成纖維細胞470nm光波激發(fā)圖15 :轉(zhuǎn)基因豬胎兒成纖維細胞克隆的陽性PCR鑒定結(jié)果I :陽性對照2-17 :細胞克隆提取的DNA樣品M =Marker
五具體實施例方式 實施例I SQR真核表達載體pcDNA3. I (-) -SQR-Myc的構(gòu)建 I.實驗材料
質(zhì)粒pcDNA3. 1(-)質(zhì)粒購于上海Invitrogen生命技術有限公司；pMD18T質(zhì)粒購于大連寶生物有限公司；pRSETA-SQR質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院李加琪教授課題組構(gòu)建并惠贈(于峰祥等，江蘇農(nóng)業(yè)學報，2011，27 (5) 1043-1046)。菌種大腸桿菌DH5 a菌種購于大連寶生物有限公司。主要酶及試劑藥盒限制性內(nèi)切酶Xho I、Kpn I、EcoR I、Hind III, Prime STAR高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自大連Takara公司；中量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Promega公司；其余普通化學試劑均為國產(chǎn)、進ロ分裝或進ロ。2.溶液配制
培養(yǎng)基、試劑的配制若無特別要求，均以重蒸水為溶剤，高壓滅菌條件為102. 9kPa蒸氣滅菌30分鐘。LB液體培養(yǎng)基蛋白陳10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，調(diào)節(jié)pH值至
7.5,定容至1000ml,高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基蛋白陳10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加瓊脂粉15g，調(diào)節(jié)pH值至7. 5,定容至1000ml,高壓滅菌。KCM轉(zhuǎn)化法相關試劑配制
(I)、TSM 液配制(IOml)
母液I體積 I終濃度■
LB7. 3mI
50%PEGMW4000 2ml 10%
DMSO0.5ml 5%
lMMgC12[lOOy I IlOmMlMMgS04[lOOy I IlOmM
(2)、5XKCM: 0.5MKC1, 0. 15M CaCl2, 0. 25M MgCl2 過濾除菌后，分裝至 I. 5ml EP管中，凍存于一 20°C冰箱備用。質(zhì)粒提取溶液I: 50mmol/L 葡萄糖,25mmol/L Tris Cl (pH8. 0) , 10mmol /T,EDTA (pH8. 0)，高壓滅菌15分鐘。質(zhì)粒提取溶液II: 0. 2mmol/L NaOH, 1%SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配。質(zhì)粒提取溶液III :5mol/Lこ酸鉀60ml，冰こ酸11. 5ml，水28. 5ml，4°C保存。50 X TAE: 242g Tr is 堿，57. Iml 冰こ酸，IOOml 0. 5mol/L EDTA (pH 8.0)，溶解后定容至1000ml。3.實驗步驟
(I)中間載體pMD18T-SQR-Myc的構(gòu)建及鑒定
引物設計以原核載體pRSETA-SQR為模板，根據(jù)SQR基因序列，設計PCR引物Pl，P2，其中5’端引物Pl帶有Xho I酶切位點(CTCGAG)及其保護堿基，3’端引物P2末端引入Myc-Tag序列，帶有Kpn I酶切位點(GGTACC)及其保護堿基，由南京金斯瑞生物公司合成Pl: 5，-CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTGGG-3， Xho I
P2: 5 ’ -GGGGTACCTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCCCCTTCTTCACGGCCTTCA-3，Kpn I
PCR擴增目的基因SQR-Myc :以質(zhì)粒pRSET_A_SQR為模板，用引物PI、P2終濃度約liimol/mL，50iiL體系使用Prime STAR高保真DNA聚合酶擴增，反應條件為98 °C 10s，55°C 10s, 72°C 90s, 30 循環(huán)，72°C延伸 5min 獲得目的基因 SQR-Myc。PCR 反應體系(50Ml) :F primer 0. 5M-1 ；R primer 0. 5M-1 ；DNA IM-I ；Prime STAR
0.；5Xbuffer IOW ；d NTP IPl ；dd H2O 371^1。連接反應取目的基因SQR-Myc 5I^g加入Taq DNA聚合酶構(gòu)成25 ii L PCR體系，72°C 30min延伸，為Prime STAR DNA聚合酶產(chǎn)物添加A-堿基尾。將上述PCR終產(chǎn)物與PMD-18T使用T4 DNA連接酶4°C連接過夜(按照產(chǎn)品說明書操作)，KCM法(C. T. Chung andR. H. Miller. Nucleic Acids Res. 1988; 16:3580)轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 a，經(jīng)氨芐青霉素篩選pMD18T-SQR-Myc的陽性轉(zhuǎn)化子，并采用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III酶切鑒定。(2) pcDNA3. I (-) -SQR-Myc 的構(gòu)建及鑒定
將pMD18T-SQR-Myc重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I雙酶切，純化回收約
1.3kb的目的片段(SQR-Myc)，同時用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I雙酶切pcDNA3. I (-)，將酶切回收后的pcDNA3. I (-)載體質(zhì)粒和SQR-Myc目的片段由T4 DNA連接酶連接過夜。連接反應體系(10 UL)
20ng 載體 DNA
20ng 外源 DNA I u LT4DNA 連接酶 10 X buffer
I 2U T4 DNA連接酶 補加水至10 u 1,16。。溫育8 12h。取5 ii I連接產(chǎn)物使用KCM法轉(zhuǎn)化55 ML大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB平板固體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后采用堿裂解法少量提取質(zhì)粒(參見《分子克隆實驗指南》，J 薩姆布魯克等編，第二版，全冬雁等譯的相關章節(jié))，酶切鑒定(圖3)。4.實驗結(jié)果
PCR擴增獲得目的基因片段SQR-Myc，大小為1326bp (圖5)。圖6雙酶切鑒定顯示，SQR-Myc成功連接到pl8T載體中。重組載體pcDNA3. I (-) -SQR-Myc經(jīng)雙酶切，獲得的兩條帶與實際相符，表明連接成功(圖7)。實施例2腸道特異表達載體pcDNA3. 1-IFABP-SQR-GFP構(gòu)建及其慢病毒制備 I.主要試劑
限制性內(nèi)切酶 Nhe I、Xba I、Xho I、Kpn I , Prime STAR 高保真 DNA 聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自大連Takara公司；去內(nèi)毒素中量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、快速連接試劑盒(Liga Fast Rapid DNA Ligation System)購自Promega公司，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine LTX、質(zhì)粒 pLenti4、pC_GP、pR-Rev、pC-VSVG 購自 invitrogen 公司；胰酶、青、鏈霉素購自SIGMA公司；DMEM (高糖)、胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司。2.溶液
HEK293細胞完全培養(yǎng)基(1L):DMEM (高糖)13. 4g，F(xiàn)BS (胎牛血清)100ml，青霉素0. 06g,鏈霉素0. lg，超純水定容到1L，調(diào)pH值至7. 2，抽濾除菌4°C保存?zhèn)溆?。Ca2VMg2+ free PBS (IL) NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 I. 44g，KH2PO4 0. 24g，HCl 調(diào)pH值至7. 2，高壓滅菌，室溫保存。如果配含Ca2+/Mg2+的PBS，需再加入CaCl2. H2O 0. 133g，MgCl2. 6H20 0. IOg03.操作步驟
(I)中間載體 pcDNA3. I (-) -SQR-GFP 的構(gòu)建
擴增SQR-Myc片段根據(jù)質(zhì)粒pcDNA3. I (-) -SQR-Myc設計PCR引物P3、P4，P3引物5’端帶有酶切位點Xho I，P4引物5’端序列與GFP序列5’末端互補。PCR條件為98°C，5min ;98°C，10s ；52°C,10s ；72°C,80s ；30 個循環(huán)；72°C，lOmin，擴增的 SQR-Myc 片段大小為1334bp。P3 :5’ -CCGCTCGAGAATGGCTCATAT-3’Xho I P4 :5’ -CCTTTGCTAGCCATCAGATCCTCTTCTC-3J 重疊序列
擴增GFP基因片段以pEGFP-C3 (由南京大學模式動物研究中心高翔教授惠贈，Ormoetal.，Science, 1996，273(5280) : 1392 1395)序列為模板，設計 PCR 反應引物 P5、P6，P5的5’端序列與SQR-Myc序列3’末端一致，引物P6的5’端帶有酶切位點Kpnl。擴增程序為98°C, 5min ;98°C，10s ；62°C,30s ；72°C,30s ;30 個循環(huán);72°C，lOmin，擴增的片段大小為744bp。P5: 5，-GAAGAGGATCTGATGGCTAGCAAAGG-3， 重疊序列 P6 :5’ -GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3^Kpn I
重疊PCR獲得SQR-GFP融合片段以上述擴增產(chǎn)物SQR-Myc片段及GFP片段為模板，用引物為P3和P6，采用重疊PCR方法(Ho et al. , Gene 1989; 77:51-59)將兩種組件融合，獲得 SQR-GFP 融合片段(2048bp)，擴增的程序98°C, 4min ;98°C，10s ；52°C,10s ；72°C,130s ；30 個循環(huán)；72°C, IOmin0T-A克隆取20 ii L上述重疊PCR產(chǎn)物，加入Taq DNA聚合酶構(gòu)成25 ii L PCR體系，72°C 30min延伸，添加A-堿基尾。將加尾后的SQR-GFP融合片段純化后與pMD_18T使用T4 DNA連接酶4°C連接，得到中間載體pMD18T-SQR-GFP。酶切連接用Xho I和Kpn I對pMD18_SQR_GFP進行雙酶切，回收得到的SQR- GFP片段克隆到pcDNA3. I (-)相應的酶切位點，獲得重組載體pcDNA3. I (-) -SQR- GFP,并進行雙酶切鑒定。(2)真核特異表達載體pcDNA3. l-IFABP-SQR-GFP的構(gòu)建
大鼠全基因組DNA提取取大鼠尾組織樣，剪碎后采用酚/氯仿提取法提取全基因組DNA，詳細操作參照《分子克隆手冊》第三版上冊6. 23。擴增IFABP片段根據(jù)Genebank中IFABP啟動子序列設計PCR引物P7、P8，以大鼠全基因組DNA為模板，擴增的程序為98°C，4min ；98°C,10s ；55°C,10s ；72°C,80s ;30個循環(huán)；72°C，5min，獲得 1352bp 的 IFABP 片段。 P7: 5 -CGGCTAGCACGAACATTGACTGGAGT Nhe I P8: 5’ -GCTCTAGATACTTTCCAAGTGCCATC Xba I
連接反應將IFABP片段通過T-A克隆獲得中間載體pMD18T-IFABP，用Nhe I和Xba I對pMD18-IFABP進行雙酶切，回收得到的IFABP片段克隆到pcDNA3. I- SQR-GFP相應的酶切位點，獲得重組載體pcDNA3. 1-IFABP-SQR-GFP，并酶切鑒定。(3) SQR慢病毒制備
① pLenti4-IFABP-SQR-GFP 的構(gòu)建
目的片段 IFABP-SQR-GFP 來自 pcDNA3. l-IFABP-SQR-GFP 質(zhì)粒，由質(zhì)粒經(jīng) Nhe I、Kpn I雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠分離純化后獲取。相同的酶處理pLenti4質(zhì)粒獲取含慢病毒轉(zhuǎn)運載體序列的DNA片段，瓊脂糖凝膠分離純化后以快速連接試劑盒與IFABP-SQR-GFP連接，獲得新的重組質(zhì)粒pLenti4-IFABP- SQR-GFP,再與病毒輔助質(zhì)粒pC_GP、pR-Rev、pC-VSVG共轉(zhuǎn)染HEK293細胞以生產(chǎn)病毒。②慢病毒的制備
細胞準備轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化J1EK293細胞，取約6X106個細胞種植于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入約IOml完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當天，待細胞達到80-85%融合度時，移除培養(yǎng)液，加入6ml無雙抗培養(yǎng)基。DNA 一脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復合物制備將pC-GP、pR-Rev、pC-VSVG質(zhì)粒按6. 5:2. 5:3. 5的質(zhì)量比進行混合制作包裝混合物。取包裝混合物11. 5 ii g與pLenti4-IFABP-SQR-GFP 5V- g，加入到I. 9ml無血清無雙抗培養(yǎng)基中，混勻稱為A液。取另ー離心管,于I. 9 ml無血清無雙抗培養(yǎng)基中加入70 ill的脂質(zhì)體Lipofectamine LTX，輕輕混勻，室溫孵育5 min，稱為B液，迅速將B液輕輕加入到A液中，混勻，室溫孵育30 min，以形成DNA —脂質(zhì)體復合物。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后收集病毒并濃縮將DNA —脂質(zhì)體復合物逐滴加入細胞培養(yǎng)瓶中，并輕輕混勻，37°C孵育過夜，轉(zhuǎn)染12 h后移去含有DNA —脂質(zhì)體復合物的培養(yǎng)基，換上新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72 h收集含病毒培養(yǎng)液，4°C 5000g離心15 min去除細胞沉淀，取上清并采用0.45 iim低蛋白結(jié)合PVDF濾膜進行抽濾。病毒原液經(jīng)4°C 50000g離心2h，棄上清，以I: 200 DMEM重懸，取部分病毒稀釋測量滴度，其余一 80°C保存?zhèn)溆谩?.結(jié)果(I) pcDNA3. I (-) -SQR-GFP 重組質(zhì)粒鑒定
以pMD18T-SQR-Myc質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得SQR片段(1334bp，圖8-A);以質(zhì)粒PEGFP-C3為模板，PCR擴增獲得GFP片段(744bp，圖8_B)。以擴增產(chǎn)物SQR-Myc片段及GFP片段為模板，采用重疊PCR方法將兩種組件融合，獲得SQR-GFP片段(2048bp，見圖9)。將pcDNA3. I-SQR-GFP重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Xho I、Kpn I雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳分別可見大小為2038 bp和5420 bp的兩條條帶，與基因圖譜一致(圖10)。(2) pcDNA3. I (-) -IFABP -SQR-GFP 重組質(zhì)粒酶切鑒定
以大鼠基因組DNA為模板，PCR擴增獲得IFABP片段(1342bp，圖11)。將重組質(zhì)粒pcDNA3.用限制性內(nèi)切酶Nhe I、Xba I雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳分別可見大小為1342 bp和7435 bp的兩條帶(圖12)，證明IFABP已經(jīng)成功連接到pcDNA3. I (-)-SQR-GFP中的相應位點。(3)慢病毒液病毒滴度測定
通過滴度測定結(jié)果表明由此生產(chǎn)的慢病毒的物理滴度為4. 76E+08，具體計算方法見表
Io表I Lenti4-blockit-IFABP -SQR-GFP 滴度測定
權利要求
1.硫化物醌氧化還原酶腸道定向表達載體，是通過以下方法構(gòu)建而成的 (1)以原核載體pRSETA-SQR為模板，根據(jù)SQR基因序列，設計PCR引物Pl和P2，P23’端引入Myc-Tag序列Pl: 5，-CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTGGG-3， Xho IP2: 5 ’ -GGGGTACCTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCCCCTTCTTCACGGCCTTCA-3，Kpn IPCR 擴增條件為98 °C,5min ;98°C，10s ;55°C，100s ；72 °C,80s ；30 個循環(huán)；72°C，5min，擴增片段大小為1331bp ； 將上述PCR終產(chǎn)物與pMD-18T使用T4 DNA連接酶4 °C連接，得到克隆載體pMD18T-SQR-Myc ； (2)將上述克隆載體pMD18T-SQR-Myc用限制性內(nèi)切酶XhoI和Kpn I雙酶切，同時用相同限制性內(nèi)切酶雙酶切pcDNA3. I (_)，將酶切回收的SQR-Myc目的片段和pcDNA3. I㈠載體片段由T4 DNA連接酶16°C連接過夜，得到SQR真核表達載體pcDNA3. I (-)-SQR-Myc ； (3)根據(jù)SQR基因及GFP基因序列，設計PCR反應引物P3 / P4和P5 / P6，引物P3/P4擴增SQR-Myc，引物P5/P6擴增GFP，P4有部分序列與GFP基因互補，同時P5有部分序列與SQR-Myc基因片段互補；P3: 5’ -CCGCTCGAGAATGGCTCATAT-3， Xho IP4: 5’ -CCTTGCTCACCATCAGATCCTCTTCTGA-3’P5: 5， -GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3，P6: 5’ -GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3J Kpn I 以pMD18T-SQR-Myc載體為模板，使用引物P3/P4，擴增SQR-Myc片段，大小為1334bp ；以質(zhì)粒PEGFP-C3為模板，使用引物P5/P6，擴增GFP片段，大小為744bp ； 以上述擴增產(chǎn)物SQR-Myc片段及GFP片段為模板，用引物P3和P6，采用重疊PCR方法將兩種組件融合，得到SQR-GFP片段，該融合片段的大小為2048bp，擴增程序為98°C，4min ；98°C，IOs ；52°C, IOs ；72°C，130s ；30 個循環(huán)；72°C, IOmin ； 利用T4 DNA連接酶將上述PCR終產(chǎn)物SQR-GFP片段與pMD_18T在4°C條件下連接，獲得重組載體PMD18T-SQR-GFP ； (4)將中間載體pMD18T-SQR-GFP用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I雙酶切，同時用同樣的限制性內(nèi)切酶雙酶切pcDNA3. I (_)，將酶切回收的SQR-GFP目的片段和pcDNA3. I㈠載體片段采用T4 DNA連接酶連接16°C過夜，獲得真核表達載體pcDNA3. l(-)-SQR-GFP ； (5)根據(jù)Genebank中IFABP啟動子序列設計PCR引物P7、P8，擴增IFABP啟動子片段，擴增的程序為98°C,4min ;98°C，10s ;55°C，10s ；72°C,80s ；30 個循環(huán)；72°C,5min,獲得IFABP片段的大小為1352bp ；P7: 5’ -CGGCTAGCACGAACATTGACTGGAGT Nhe IP8: 5’ -GCTCTAGATACTTTCCAAGTGCCATC Xba I 將上述獲得的IFABP片段TA克隆到載體pMD-18T上，獲得重組載體pMD18T_IFABP，并采用Nhe I和Xba I進行雙酶切，將回收得到的IFABP片段克隆到pcDNA3. I-SQR-GFP相應的酶切位點，獲得重組載體pcDNA3. 1-IFABP-SQR-GFP。
2.用權利要求I所述硫化物醌氧化還原酶腸道定向表達載體制備的慢病毒載體。
3.用權利要求I所述硫化物醌氧化還原酶腸道定向表達載體制備慢病毒載體的方法，其特征在于 權利要求I所述重組載體pcDNA3. 1-IFABP-SQR-GFP采用Nhe I、Kpn I雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠分離純化后獲取IFABP-SQR-GFP，利用相同酶切方法處理pLenti4質(zhì)粒獲取含慢病毒轉(zhuǎn)運載體序列的DNA片段，將此片段與IFABP-SQR-GFP連接，獲得新的重組質(zhì)粒pLenti4-IFABP- SQR-GFP,與病毒輔助質(zhì)粒 pC_GP、pR-Rev、pC-VSVG 共轉(zhuǎn)染 HEK293 細胞制備獲得慢病毒載體。
4.用權利要求2或3所述慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬成纖維細胞后獲得的轉(zhuǎn)基因細胞系。
5.用權利要求2或3所述慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬成纖維細胞后獲得的轉(zhuǎn)基因細胞系的方法，其特征在于 將權利要求2或3所述含有IFABP-SQR-GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬成纖維細胞，24^48小時后進行瞬時轉(zhuǎn)染效率檢測，同時加入300 ug/ml G418進行篩選，篩選四周后獲得穩(wěn)定表達SQR的細胞克隆，挑取單克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)獲得SQR穩(wěn)定表達細胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及硫化物醌氧化還原酶腸道定向表達載體及其細胞系，屬于生物技術領域。將SQR基因插入真核表達載體pcDNA3.1(-)，構(gòu)建慢病毒重組載體Lanti4-blockit-IFABP-SQR-GFP，將其感染原代培養(yǎng)的豬小腸上皮細胞，構(gòu)建特異表達SQR-GFP蛋白的真核細胞系。為進一步開展體細胞核移植克隆轉(zhuǎn)SQR基因胚胎制備，培育減少污染物排放的轉(zhuǎn)基因豬新品種提供必要的轉(zhuǎn)基因生物材料和關鍵技術體系支撐。
文檔編號C12N15/66GK102643853SQ201210115259
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權日2012年4月19日
發(fā)明者于峰祥, 于建寧, 徐小波, 王公金, 陳哲 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院