本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌凍干粉及其制備方法，屬于生物菌制品的生產(chǎn)領域。
背景技術：
鼠李糖乳桿菌是目前最受全球關注的益生菌之一。該菌能夠耐受動物消化道環(huán)境,具有能夠在人和動物腸道內定植,起到調節(jié)腸道菌群、預防和治療腹瀉、排除毒素、預防齲齒和提高機體免疫力等功能特性。
菌粉便于儲藏和運輸，并有利于后期產(chǎn)品的加工，乳酸菌的生產(chǎn)多以菌粉的形式呈現(xiàn)。目前真空冷凍干燥是生產(chǎn)菌粉最有效的干燥技術，其可以很好的保持菌體的生理生化特性和生物活性。乳酸菌預凍成固體后，水分不經(jīng)過液相，在真空和低溫條件下直接升華。但是不加任何保護的菌體直接凍干，必然引起機械損傷，細胞膜的流動性和通透性變化，動態(tài)平衡的破壞，細胞會被殺死。因此，凍干乳酸菌時會添加凍干保護劑提高菌體的存活率。但是不同的蛋白因其性質不同，保護效果亦不同，篩選保護效果好的蛋白質是提高凍干存活率的先決條件。糖類被認為具有通過氫鍵替代穩(wěn)定脂質膜和蛋白的效果，同時也可以通過玻璃化過程形成無定形的非晶結構。脫脂乳、蔗糖和海藻糖因其較好的保護效果，是經(jīng)常被使用的凍干保護劑。
雖然目前廣泛使用的保護劑在凍干乳酸菌時已具有較好效果，但是目前文獻報道的鼠李糖乳桿菌凍干粉的菌株存活率均較低。大量研究也表明不同的菌株需要的保護劑不同，保護劑的使用量也不同。這與菌株的特異性和菌體的大小有關系。因此一種更有效的保護鼠李糖乳桿菌的保護劑配方及制備策略是提高鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)的關鍵技術。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種凍干保護劑，成分包括乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的鼠李糖乳桿菌凍干保護劑的組成為：乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種鼠李糖乳桿菌凍干粉，是由所述凍干保護劑和鼠李糖乳桿菌活性成分制成。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述凍干粉含有鼠李糖乳桿菌CGMCC1.549。
本發(fā)明的第三個目的是提供所述鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法，包括收集菌體、配制保護劑、凍干和保藏。
在本發(fā)明的一種實施方式中，收集濕菌體是收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期的鼠李糖乳桿菌，離心獲得菌泥。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述配制保護劑是配乳清蛋白，海藻糖，菊粉，谷胱甘肽，和咖啡酸溶液，分別滅菌并按終濃度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L進行混勻，制備成凍干保護劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述凍干是將收集的濕菌體與凍干保護劑溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混勻，預凍，一次干燥，二次干燥。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法為：
(1)收集菌體：收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期的鼠李糖乳桿菌，在4000～6000rpm，4℃離心，用無菌生理鹽水洗滌菌體，然后在相同的條件下離心，得到菌泥。
(2)配制保護劑：配制乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻。
(3)凍干：將收集的鼠李糖乳桿菌菌泥與凍干保護劑溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混勻，菌懸液倒入凍干容器中，液面厚度0.5～1.0cm，在真空冷凍干燥機凍干箱進行真空冷凍干燥，具體步驟為：
(a)預凍：將產(chǎn)品溫度降至4℃，保持30～60分鐘，再降溫至-40℃，保持4～6小時。
(b)一次干燥：預凍完成后，將溫度降至-40℃以下，以0.5℃/min的升溫速率將產(chǎn)品溫度升至-20℃，保持-20℃20～30h。
(c)二次干燥：將產(chǎn)品溫度升至20℃，保持10～20小時，產(chǎn)品無水分揮發(fā)后結束凍干過程。
(4)菌粉的收集和保藏：凍干結束后，收集菌粉并進行真空封裝。
本發(fā)明還要求保護所述凍干保護劑在發(fā)酵食品、化工生產(chǎn)領域中的應用。
有益效果：本發(fā)明的凍干保護劑較常規(guī)保護劑能夠顯著提高鼠李糖乳桿菌的凍干存活率，制備的鼠李糖乳桿菌凍干粉中，鼠李糖乳桿菌活菌含量達到2.8～6.0×1011cfu/g，凍干存活率達到98％以上，且不會產(chǎn)生發(fā)酵性能減弱的現(xiàn)象。
具體實施方式
菌體發(fā)酵性能檢測：將菌體在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，挑取單菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧活化培養(yǎng)至OD＝0.8，按體積比以5％的接種量轉接至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧發(fā)酵48h，測定乳酸產(chǎn)量Y0；將凍干粉中的菌體按上述相同方法活化、培養(yǎng)、發(fā)酵，測定乳酸產(chǎn)量Y1；發(fā)酵性能＝100％×Y1/Y0。
實施例1
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護劑。
實施例2
以鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549為例，評價凍干菌粉的效果。
(1)收集菌體：收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期的鼠李糖乳桿菌，在4000～6000rpm，4℃離心，用無菌生理鹽水洗滌菌體，然后在相同的條件下離心，得到菌泥。
(2)配制保護劑：配制乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻。
(3)凍干：將收集的鼠李糖乳桿菌菌泥與凍干保護劑溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混勻，菌懸液倒入凍干容器中，液面厚度0.5～1.0cm，在真空冷凍干燥機凍干箱進行真空冷凍干燥，具體步驟為：將產(chǎn)品溫度降至4℃，保持30～60分鐘，再降溫至-40℃，保持4～6小時；預凍完成后，將溫度降至-40℃以下，以0.5℃/min的升溫速率將產(chǎn)品溫度升至-20℃，保持-20℃20～30h；將產(chǎn)品溫度升至20℃，保持10～20小時，產(chǎn)品無水分揮發(fā)后結束凍干過程。
(4)菌粉的收集和保藏：凍干結束后，收集菌粉并進行真空封裝。
(5)凍干完成后，凍干菌粉用無菌蒸餾水復溶至凍干前體積，測定活菌濃度、菌體發(fā)酵性能，計算凍干存活率，結果如表1所示。
表1 鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549在兩種保護劑中的凍干存活率
凍干完成后，常規(guī)保護劑的保護效果顯著低于本發(fā)明保護劑，鼠李糖乳桿菌CGMCC1.549在常規(guī)保護劑的中凍干存活率均低于75％，發(fā)酵性能下降10～26％，而本發(fā)明保護劑顯著提高凍干存活率，活菌含量達到2.8～6.0×1011cfu/g，菌泥添加量低于1.0g/10mL保護劑時，凍干存活率達到100％，菌泥含量為2g/10mL時，存活率仍接近100％。
實施例3
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白90g/L，海藻糖60g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護劑。
實施例4
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉60g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護劑。
實施例5
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽4g/L，咖啡酸1.0g/L。將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護劑。
實施例6
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白120g/L，海藻糖60g/L，菊粉60g/L，谷胱甘肽6g/L，咖啡酸2g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護劑。
按實施例2的方法制備凍干粉，其區(qū)別在于，將菌體和實施例3～6制備的凍干保護劑以1g:10mL的比例充分混勻，結果如表2所示。
表2 鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549在不同保護劑中的凍干存活率
結果顯示，本發(fā)明的方法制備的凍干保護劑具有理想的效果，可以使鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549凍干存活率接近100％，且保證凍干后的菌體發(fā)酵性能不降低。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。