本發(fā)明涉及一種定向分離免疫調(diào)節(jié)性腸道乳桿菌的方法，屬于生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳桿菌是益生菌的重要成員，廣泛存在于人體和動物胃腸道內(nèi)。國內(nèi)、外已有大量試驗(yàn)證實(shí)體內(nèi)的多種乳桿菌可調(diào)節(jié)宿主對免疫系統(tǒng)功能，這是它們預(yù)防傳染性疾病、改善食物過敏、抗癌、穩(wěn)固腸黏膜屏障、改善免疫佐劑性能和緩解腸道炎癥等作用的基礎(chǔ)。其作用機(jī)制與其直接激活免疫細(xì)胞和分泌免疫調(diào)節(jié)物有關(guān)。

國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量分離腸道免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌的研究。分離篩選腸道免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌已有前人采用常規(guī)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行篩選，用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布法得到大量菌株，然后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，棄掉革蘭氏陰性菌株，之后通過過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)氣莢膜梭菌洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，棄掉過氧化氫酶陽性和產(chǎn)氣莢膜梭菌，最終將革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性和無芽孢桿狀暫定為乳桿菌，最后做乳桿菌特異性的PCR最終確定篩出的菌為乳桿菌。該方法具有一定的局限性，篩菌周期長且篩出的菌不一定為腸道免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌，傳統(tǒng)方法的不確定性導(dǎo)致篩選工作的不確定性。另外，這種培養(yǎng)法方法檢出限是10cfu/g。

綜上，腸道免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌是采用經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)性的傳統(tǒng)分離方法進(jìn)行篩選得到的。首先利用選擇性培養(yǎng)基分離獲得大量腸道乳桿菌菌株，然后分別考察其粘附腸道細(xì)菌能力、耐酸性和體外誘導(dǎo)細(xì)胞因子活性。這種分離方法工作量非常大，需要大量人力、物力，活性菌株篩選周期也很長。但許多體外生理表現(xiàn)相似的菌株的體內(nèi)活性差別很大[Ibnouzekri et al.,2003]，更加增加了篩選工作的復(fù)雜性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明建立了一種靶向分離高免疫調(diào)節(jié)活性乳桿菌菌株的方法。本發(fā)明的快速、定向的從人或動物腸道內(nèi)容物或糞便分離高免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌的方法，基于免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，利用生物素與鏈霉親和素易于結(jié)合的特點(diǎn)，快速有效地從糞便中分離IgA包裹乳桿菌，然后再利用特異性培養(yǎng)基分離菌株，并用乳桿菌特異性PCR進(jìn)行快速初步鑒定。

乳桿菌可通過M細(xì)胞進(jìn)入小腸派伊爾結(jié)(PP)。PP是小腸最重要的抗原采集部位，內(nèi)部存在大量巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。樹突細(xì)胞攝取乳桿菌，被刺激成熟，將誘導(dǎo)B細(xì)胞成為產(chǎn)IgA漿細(xì)胞。B細(xì)胞可以產(chǎn)生兩種IgA，一種為以弱作用力結(jié)合大部分腸道細(xì)菌天然IgA，另外一種為以高親和力結(jié)合免疫誘導(dǎo)菌的IgA。乳桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用具有明顯的菌株依賴性，高活性菌株可進(jìn)入PP誘導(dǎo)高親和性IgA產(chǎn)生，因此，免疫刺激活性較強(qiáng)的腸道乳桿菌其細(xì)胞表面都被高親和性IgA所包裹。IgA包裹后也可促進(jìn)乳桿菌進(jìn)入PP持續(xù)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，也可以增強(qiáng)其抗炎活性。

本發(fā)明的定向分離免疫調(diào)節(jié)性腸道乳桿菌的方法，先后包括：(1)制備菌體懸浮液；(2)在懸浮液中加入山羊血清或者牛血清白蛋白，冰浴一段時(shí)間；然后加入生物素標(biāo)記的兔抗人IgA冰浴一段時(shí)間；再加入鏈霉親和素磁珠，冰浴一段時(shí)間；最后磁性吸附結(jié)合有菌體的鏈霉親和素磁珠，洗滌即得到菌體；(3)將上一步得到的菌體富集培養(yǎng)；(4)鑒定富集培養(yǎng)到的菌株，鑒定為乳桿菌的菌株即為高免疫調(diào)節(jié)活性的乳桿菌菌株。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述菌體懸浮液為唾液、腸道內(nèi)容物或糞便制備的細(xì)菌懸浮液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述菌體懸浮液，當(dāng)樣品為固態(tài)或半固態(tài)時(shí)，是將樣品加入滅菌的緩沖液中，漩渦混勻，低速離心取上清液并經(jīng)細(xì)胞過濾網(wǎng)處理，過濾得到的液體經(jīng)多次高速離心、洗滌，然后重懸于緩沖液中，得到混合細(xì)菌的菌體懸浮液；當(dāng)樣品為液體時(shí)，直接將樣品加入滅菌的緩沖液中，漩渦混勻，高速離心取沉淀，經(jīng)多次洗滌、離心，然后重懸于緩沖液中得到菌體懸浮液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述低速離心是在800～1200rpm；所述高速離心是在8000～12000rpm。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述緩沖液為蛋白胨緩沖液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述山羊血清或牛血清白蛋白的作用是封閉非特異性結(jié)合。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述山羊血清或牛血清白蛋白的添加量為在菌懸液的終濃度分別為10％、0.05～0.5％。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述鏈霉親和素磁珠的添加量為0.1-1.0mg/mL。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述鏈霉親和素磁珠的制備是先制備氨基化納米磁珠，然后與戊二醛連接，將連接上戊二醛的氨基化納米磁珠與鏈霉親和素在緩沖液中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后利用外加磁場吸附鏈霉親和素化的納米磁珠，清洗，即得到鏈霉親和素磁珠。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述鏈霉親和素磁珠的制備具體是：

①氨基化納米磁珠：將所用實(shí)驗(yàn)器皿在王水中過夜浸泡，洗凈烘干，向放有轉(zhuǎn)子的圓底燒瓶中加入60mL乙二醇，13g己二胺，4g無水醋酸鈉，2g FeCl₃·6H₂O，在50℃油浴至溶液均勻，將液體轉(zhuǎn)移至帶有四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，于198℃反應(yīng)6h，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至燒杯中，使用無水乙醇和去離子水反復(fù)沖洗多次黑色固體后，將黑色固體在50℃條件下烘干10h，然后干燥的黑色固體使用瑪瑙研缽研磨成粉末，即得到氨基化納米磁珠。

②戊二醛連接：稱取2mg氨基化磁珠于離心管中，加入戊二醛/PBS緩沖溶液(體積比為5％)2mL，37℃搖床中反應(yīng)2h，利用吸鐵石的磁力吸住磁珠，用PBS緩沖溶液反復(fù)清洗5次以上，除去未結(jié)合的戊二醛。

③鏈霉親和素磁珠：在連接上戊二醛的氨基化磁珠中加2mL PBS緩沖溶液，然后再加入1mg/mL的鏈霉親和素250uL，37℃搖床中反應(yīng)12h，利用外加磁場用PBS緩沖液反復(fù)清洗5次以上，除去未結(jié)合的鏈霉親和素，收集沉淀，即得到鏈霉親和素化的納米磁珠。磁珠清洗后放置在4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述冰浴的時(shí)間為10-30min。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(3)具體是：

①在混合細(xì)菌懸浮于蛋白胨緩沖液得到的菌體懸浮液中，加入5％的山羊血清，冰浴15min；加入生物素標(biāo)記的兔抗人IgA，冰浴20min；然后加入鏈霉親和素磁珠，冰浴20min。

②用吸鐵石或磁珠分選器吸附磁珠結(jié)合細(xì)菌，倒掉上清液；之后用蛋白胨緩沖液清洗3次菌體。

③最后將鏈霉親和素磁珠吸附的菌體重懸在蛋白胨緩沖液中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述富集培養(yǎng)，是先在富集培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)6-8h，然后多次在乳桿菌特異性分離培養(yǎng)基(LAMVAB)上劃線、純化，得到候選菌株。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述富集培養(yǎng)基的配方：阿拉伯糖20mM；核糖20mM；MgSO₄1mM；MnSO₄0.1mM；FeSO₄5uM。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述乳桿菌特異性分離培養(yǎng)基的配方：溶液A：MRS培養(yǎng)基250mL，鹽酸半胱氨酸0.0125g，溴甲酚綠0.0012g，調(diào)pH至5.0±0.1；溶液B：10g瓊脂溶于250mL去離子水中；溶液C：5mL鹽酸萬古霉素，2mg/mL，無菌水配制；等量A、B溶液121℃滅菌15min，B冷卻至50℃，A冷去至室溫加溶液C，混勻，再將A、B溶液混勻，倒平板。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述鑒定是使用乳桿菌屬特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述鑒定具體是：提取候選菌株基因組DNA，利用乳桿菌屬特異性引物進(jìn)行PCR，所用引物為(序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)：

LbLMA1-rev(5’-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3’)和R16-1(5’-CTTGTACACACCGCCCGTCA-3’)；得到的含有200～500bp特征性產(chǎn)物的菌株即為高免疫調(diào)節(jié)活性的乳桿菌菌株。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明方法，包括免疫磁珠的制備、腸道內(nèi)容物或糞便細(xì)菌懸浮液制備、磁珠結(jié)合反應(yīng)和磁珠分選、細(xì)菌富集和選擇性培養(yǎng)、PCR法乳桿菌鑒定。本發(fā)明方法基于高活性菌株誘導(dǎo)分泌的IgA進(jìn)入腸腔可特異性地結(jié)合該菌株，利用靶向結(jié)合IgA的親和磁珠與糞便細(xì)菌懸液作用并清洗。在實(shí)驗(yàn)過程中，與細(xì)菌結(jié)合的天然IgA及與之結(jié)合的磁珠在清洗過程中就會被洗掉，僅保留與高親和性IgA結(jié)合的磁珠，通過磁珠分選，并富集培養(yǎng)，從而快速分離活性菌株。同時(shí)，通過對分離方法中，山羊血清或牛血清白蛋白的添加量、鏈霉親和素磁珠的添加量、冰浴時(shí)間等優(yōu)化，進(jìn)一步提高了篩選效率、縮短了篩選周期。

與常規(guī)的乳桿菌篩選相比，本發(fā)明通過細(xì)胞表面高親和性IgA存在情況分離、篩選乳桿菌，大大提高免疫調(diào)節(jié)菌分離選擇性，也明顯縮短菌株篩選周期。

附圖說明

圖1為定向分離高親和性IgA結(jié)合乳桿菌的流程圖；

圖2為從糞便中篩選的IgA包裹乳桿菌的乳桿菌特異性PCR電泳結(jié)果圖；

圖3為從唾液中篩選的IgA包裹乳桿菌的乳桿菌特異性PCR電泳結(jié)果圖；

圖4為不同來源的免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞因子TNF-α(a)、IL-6(b)、IL-12(c)和IL-10(d)的產(chǎn)生；其中，LPS代表脂多糖；F1代表糞便中磁珠吸附的乳桿菌；FS1代表磁珠吸附后上清液中的乳桿菌；T1代表唾液中磁珠吸附的乳桿菌；TS1代表磁珠吸附后上清液中的乳桿菌；其中*表示與空白組相比有顯著差異，P<0.05；**表示與空白組相比有極顯著差異，P<0.01；#表示與LPS陰性對照組相比有顯著差異，P<0.05；##表示與LPS陰性對照組相比有極顯著差異，P<0.01；

圖5為TNF-α/IL-10(e)、IL-6/IL-10(f)和IL-12/IL-10(g)；其中，LPS代表脂多糖；F1代表糞便中磁珠吸附的菌；FS1代表磁珠吸附后上清液中的菌；T1代表唾液中磁珠吸附的菌；TS1：磁珠吸附后上清液中的菌；其中*表示與空白組相比有顯著差異，P<0.05；**表示與空白組相比有極顯著差異，P<0.01；#表示與LPS陰性對照組相比有顯著差異，P<0.05；##表示與LPS陰性對照組相比有極顯著差異，P<0.01。

具體實(shí)施方案

下面將結(jié)合實(shí)施案例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明；下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：鏈霉親和素磁珠的制備

按照以下方法制備鏈霉親和素磁珠

(1)氨基化的Fe₃O₄納米磁珠的制備

①將圓底燒瓶、轉(zhuǎn)子和反應(yīng)釜內(nèi)膽都在王水中過夜浸泡，然后用洗潔精清洗干凈，再用去離子水清洗后放入烘箱中烘干。

②向放有轉(zhuǎn)子的圓底燒瓶中加入30mL乙二醇，加入6.5g 1,6-己二胺，再加入2.0g無水醋酸鈉，最后加1.0g FeCl₃·6H₂O。

③將圓底燒瓶在50℃中油浴加上回流裝置，并磁力攪拌大概0.5h-1h。反應(yīng)至燒瓶內(nèi)的溶液均勻。

④將圓底燒瓶內(nèi)的溶液小心地轉(zhuǎn)移至四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜內(nèi)膽中，并將反應(yīng)釜擰緊，放置在198℃高溫下反應(yīng)6h，結(jié)束后后自然冷卻至室溫(隔夜冷卻)。

⑤將反應(yīng)釜中液體的用玻璃棒攪勻，小心地倒入250mL燒杯中，用無水乙醇多次沖洗反應(yīng)釜，清洗液也一并倒入燒杯中。

⑥利用超聲將燒杯中的黑色磁性顆粒分散(大約5min)，從超聲水池將燒杯拿下來放在磁鐵上，利用磁分離收集，黑色顆粒就會被吸在杯底，帶著磁鐵將燒杯中的溶液倒出，剩余的液體用移液槍吸出來。

⑦交替使用40mL去離子水和無水乙醇清洗，利用超聲將燒杯中的黑色磁性顆粒分散(大約5min)，從超聲水池將燒杯拿下來放在磁鐵上，利用磁分離收集，黑色顆粒就會被吸在杯底，帶著磁鐵將燒杯中的溶液倒出，剩余的液體用移液槍吸出來。

⑧重復(fù)步驟7兩次。

將得到的黑色固體放置在50℃條件下干燥10h。

⑨干燥的黑色固體顆粒用瑪瑙研缽中研磨成粉末，即得到氨基化的Fe₃O₄納米磁珠，置于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(2)在氨基化磁珠中連接戊二醛

稱取上述制好的氨基化磁珠2mg于離心管中，加入戊二醛/PBS緩沖溶液(體積比為5％)2mL，37℃搖床中反應(yīng)2h，利用吸鐵石的磁力吸住磁珠，用PBS緩沖溶液反復(fù)清洗5次以上，除去未結(jié)合的戊二醛。

(3)鏈霉親和素磁珠

連接上戊二醛的氨基化磁珠中加2mLPBS緩沖溶液，然后再加入1mg/mL的鏈霉親和素250uL，37℃搖床中反應(yīng)12h，利用外加磁場用PBS緩沖液反復(fù)清洗5次以上，除去未結(jié)合的鏈霉親和素，收集沉淀，即得到鏈霉親和素化的納米磁珠。磁珠清洗后放置在4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：使用鏈霉親和素磁珠技術(shù)從人糞便中分離篩選免疫調(diào)節(jié)乳桿菌

該實(shí)施例為使用鏈霉親和素磁珠技術(shù)從人糞便中分離篩選免疫調(diào)節(jié)乳桿菌，圖1為定向分離高親和性IgA結(jié)合乳桿菌的流程圖。

具體包括以下步驟：

采用鏈霉親和素磁珠法從糞便中分離篩選IgA包裹乳桿菌：

①稱取1g健康人的糞便，加入10mL滅菌的蛋白胨緩沖液，漩渦混勻5min。

②在1000rpm下離心5min，取上清液，大的碎片和上清液通過無菌的200目的細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾到一個(gè)新的管子里。

③將過濾的得到的離心管在10000rpm下離心5min，倒掉上清液。加入5mL的蛋白胨緩沖液，吹打混勻，10000rpm下離心5min，倒掉上清液，再重復(fù)一次。

④再將沉淀重懸在5mL蛋白胨緩沖液中，加入5％的山羊血清，冰浴15min。加入的生物素標(biāo)記的兔抗人IgA，冰浴20min。然后入鏈霉親和素標(biāo)記的納米免疫磁珠(即鏈霉親和素磁珠)，冰浴20min。

⑤用吸鐵石在管子底部吸附，將上清液倒在一個(gè)新的滅菌管子中。之后用滅菌的蛋白胨緩沖液清洗3次菌體。

⑥最后將免疫磁珠吸附的菌體重懸在蛋白胨緩沖液中，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

在上一步驟中得到的IgA包裹菌在富集培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)6-8h，然后在LAMVAB特異性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48h，隨后在每個(gè)平板上挑選具有特異性的，菌落形態(tài)各不相同的4株菌，然后將這4株菌分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，再在LAMVAB特異性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化，挑單菌落培養(yǎng)，如此純化3次，得到幾十株菌。

富集培養(yǎng)基的基本成分為：阿拉伯糖20mM；核糖20mM；MgSO₄1mM；MnSO₄0.1mM；FeSO₄5uM。

MRS液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取菌株細(xì)菌組DNA提?。?/p>

乳桿菌特異性PCR：

為證明上述分離的菌株是否為sIgA包裹乳桿菌，使用上述得到的純化菌株的DNA進(jìn)行乳桿菌特異性PCR。

PCR反應(yīng)體系25uL：10buffer-MgCl2 2.5uL；MgCl2 2uL；dNTP 0.5uL；上游引物0.5uL；下游引物0.5uL；模板DNA 3uL；Taq酶0.5uL；DEPC水13.5uL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸15min，冷卻至12℃。

PCR結(jié)束后，在1％的瓊脂糖凝膠電泳，剔除未跑出條帶的菌株，從而得到從糞便中篩選的sIgA包裹乳桿菌。

實(shí)施例3：使用鏈霉親和素磁珠技術(shù)從唾液中分離篩選免疫調(diào)節(jié)乳桿菌

該實(shí)施例為使用鏈霉親和素磁珠技術(shù)從唾液中分離篩選IgA包裹乳桿菌。

一種基于鏈霉親和素磁珠技術(shù)分離IgA包裹乳桿菌的方法具體包括以下步驟：

鏈霉親和素磁珠的制備：與實(shí)施例1中相同。

采用鏈霉親和素磁珠法從唾液中分離篩選IgA包裹乳桿菌：

①吸取1mL健康人的唾液，加入9mL滅菌的蛋白胨緩沖液，漩渦混勻5min。

②混勻后在10000rpm下離心5min，倒掉上清液。加入5mL滅菌的蛋白胨緩沖液，吹打混勻，10000rpm下離心5min，倒掉上清液，再重復(fù)一次。

④再將沉淀重懸在5mL蛋白胨緩沖液中，加入5％的山羊血清，冰浴15min。加入的生物素標(biāo)記的兔抗人IgA，冰浴20min。然后入鏈霉親和素標(biāo)記的納米免疫磁珠，冰浴20min。

⑤用吸鐵石在管子底部吸附，將上清液倒在一個(gè)新的滅菌管子中。之后用滅菌的蛋白胨緩沖液清洗3次菌體。

⑥最后將免疫磁珠吸附的菌體重懸在蛋白胨緩沖液中，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

在上一步驟中得到的IgA包裹菌在富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)6-8h，然后在LAMVAB特異性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48h，隨后在每個(gè)平板上挑選具有特異性的，菌落形態(tài)各不相同的4株菌，然后將這4株菌分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，再在LAMVAB特異性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化，挑單菌落培養(yǎng)，如此純化3次，得到幾十株菌。

MRS液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，一部分于40％的甘油冷凍保存菌體，一部分用于提取細(xì)菌基因組DNA。

純化菌株細(xì)菌組DNA提?。?/p>

使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取純化菌株基因組DNA。

乳桿菌特異性PCR：

為證明上述分離的菌株是否為IgA包裹乳桿菌，使用上述得到的純化菌株的DNA進(jìn)行乳桿菌特異性PCR。

PCR反應(yīng)體系25uL：10buffer-MgCl2 2.5uL；MgCl2 2uL；dNTP 0.5uL；上游引物0.5uL；下游引物0.5uL；模板DNA 3uL；Taq酶0.5uL；DEPC水13.5uL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸15min，冷卻至12℃。

PCR結(jié)束后，在1％的瓊脂糖凝膠電泳，剔除未跑出條帶的菌株，從而得到從唾液中分離篩選的sIgA包裹乳桿菌。

圖2-3為從糞便和唾液中篩選的IgA包裹乳桿菌的乳桿菌特異性PCR后的電泳圖。如圖2所示F6、F7、F21沒有條帶，剩余的就為IgA包裹乳桿菌；如圖3所示T2未跑出條帶，剩余的就為IgA包裹乳桿菌。

實(shí)施例4：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將上述實(shí)施例2-3得到的從糞便和唾液中得到的乳桿菌進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證得到的乳桿菌體外誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7與上述篩選出的細(xì)菌和磁珠吸附之后的上清液菌株進(jìn)行共培養(yǎng)，將實(shí)驗(yàn)分為以下四組：

(1)空白組：加入100uL PBS；

(2)實(shí)驗(yàn)組：加入100uL濃度為1×10⁵(CFU)/mL的F1(糞便中磁珠吸附的乳桿菌)，F(xiàn)1上清液(磁珠吸附后上清液中的乳桿菌)，T1(唾液中磁珠吸附的乳桿菌)，T1上清液(磁珠吸附后上清液中的乳桿菌)；

(3)陽性對照組：加入100uL濃度為1×10⁵(CFU)/mL的L.rhamnosus GG(LGG)(陽性對照)；

(4)陰性對照組：1μg/mL LPS；將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7的濃度調(diào)至5×10⁵(CFU)/mL。

37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，離心收集上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書要求，測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-10的水平。

由圖4和圖5中可看出LPS會顯著上調(diào)IL-6、TNF-α和IL-12等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量，IL-6、TNF-α和IL-12的分泌量與空白組相比LPS組達(dá)到極顯著差異(P<0.01)；但是從圖4中可得到F1和T1較FS1和TS1的IL-6、TNF-α和IL-12等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量低，但對IL-10的表達(dá)并沒有影響，說明在本發(fā)明中初步驗(yàn)證了免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌免疫調(diào)節(jié)性能；同樣，在圖5中TNF-α/IL-10的比值升高代表細(xì)胞因子分泌的不協(xié)調(diào)，會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，LPS、FS1和TS1的TNF-α/IL-10都顯著高于空白組，TNF-α/IL-10與空白組相比LPS、FS1和TS1組達(dá)到顯著差異(P<0.05)?；谏鲜鼋Y(jié)論，本發(fā)明方法可以分離篩選得到腸道免疫調(diào)節(jié)性乳桿菌。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種定向分離免疫調(diào)節(jié)性腸道乳桿菌的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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