本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一株生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸(2-Keto-L-Gulonic acid，2-KGA)的菌株及其生產(chǎn)方法，具體涉及利用微生物發(fā)酵的手段將底物L(fēng)-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA的菌株及工藝。

背景技術(shù)：
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VC是人體必需的一種維生素，在抗氧化和維持新陳代謝平衡等方面具有廣泛的生理作用，在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、飼料行業(yè)以及化妝品行業(yè)上均有重要用途。其應(yīng)用范圍廣闊，市場(chǎng)規(guī)模巨大。

目前，全球90％以上的VC生產(chǎn)，均利用我國(guó)發(fā)明的“二步發(fā)酵法”。其第一步發(fā)酵是在氧化葡萄糖酸桿菌作用下將D-山梨醇氧化為L(zhǎng)-山梨糖。第二步是在一種混合菌系的作用下將L-山梨糖進(jìn)一步氧化成VC的重要中間體2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)。最后經(jīng)過化學(xué)轉(zhuǎn)化使2-KGA生成VC。

第二步發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA是決定VC發(fā)酵產(chǎn)率和成本的關(guān)鍵步驟。在其混合菌系中：酮古龍酸菌是產(chǎn)2-KGA的關(guān)鍵菌株，具有氧化底物L(fēng)-山梨糖為2-KGA的酶系統(tǒng)。但該菌獨(dú)立生長(zhǎng)及產(chǎn)2-KGA能力非常弱，需要巨大芽孢桿菌提供某些“效應(yīng)物”促進(jìn)其生長(zhǎng)及產(chǎn)2-KGA。該菌本身能獨(dú)立生長(zhǎng)，卻不能轉(zhuǎn)化L-山梨糖為2-KGA。

由于L-山梨糖在轉(zhuǎn)化為2-KGA的過程中，其中間產(chǎn)物L(fēng)-山梨酮可在山梨酮脫氫酶(SNDH)的作用下，伴隨副產(chǎn)物維生素C的產(chǎn)生；同時(shí)L-山梨糖亦作為酮古龍酸菌自身碳源參與糖代謝作用，故在實(shí)際發(fā)酵過程中，2-KGA的轉(zhuǎn)化率通常在90％左右，難以進(jìn)一步提升。在本發(fā)明中，由于SPUB 805具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，并且缺乏酮古龍酸菌體內(nèi)的一條重要糖代謝途徑(ED pathway)，同時(shí)亦缺乏伴隨副產(chǎn)物VC產(chǎn)生的SNDH，故在產(chǎn)2-KGA發(fā)酵的過程中，該菌具有較高的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率及較短的發(fā)酵周期。

現(xiàn)有技術(shù)中，未見具有上述性狀特征的天然酮古龍酸菌及基因工程菌株的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一株可高產(chǎn)2-KGA的微生物菌株普通生酮基 古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)(SPU B805)，減少VC二步發(fā)酵過程中，底物L(fēng)-山梨糖參與糖代謝及產(chǎn)生其它副產(chǎn)物的數(shù)量，進(jìn)而提高目標(biāo)產(chǎn)物2-KGA的轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室分離、篩選及進(jìn)一步人工馴化得到了一株性狀穩(wěn)定，并具有較高2-KGA轉(zhuǎn)化率的菌株SPU B805，連續(xù)40次傳代證明該菌性狀穩(wěn)定。

本發(fā)明所述的普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)(SPU B805)為革蘭氏陰性菌，短桿，可形成短鏈或絲狀體，不能形成芽孢(見圖1)；在原有酮古龍酸菌固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4天的菌落形態(tài)為點(diǎn)狀，凸起，完整，光滑的圓形菌落，菌落表面成油狀，透明，有棕色色素產(chǎn)生?；?6SrDNA測(cè)序及生理生化指標(biāo)考察，經(jīng)鑒定該菌為普通生酮基古龍?zhí)撬峋?Ketogulonicigenium vulgare)(見圖2)。

進(jìn)一步利用454-焦磷酸測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建并完成了該菌株的全基因組完成圖。并進(jìn)一步完成了該菌株的基因組注釋及與已知酮古龍酸菌(Y25及WSH-001)基因組的比較基因組學(xué)研究。比較基因組分析表明，SPU B805與已知菌株Y25及WSH-001最大的區(qū)別為缺少兩菌體內(nèi)分別存在的大質(zhì)粒pYP2及pKVU_200，同時(shí)SPU B805基因組與其它兩株菌相比亦存在部分基因片段的重排(見圖3)，除此各功能基因幾乎相同。由于SPU B805質(zhì)粒的缺失，導(dǎo)致了該菌體內(nèi)缺乏酮古龍酸菌ED途徑三種關(guān)鍵酶(包括：2-dehydro-3-deoxygluconokinase，EC:2.7.1.45；phosphogluconate dehydratase，EC:4.2.1.12及2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase，EC:4.1.2.14)及一種利用L-山梨酮直接產(chǎn)生維生素C的關(guān)鍵酶L-sorbosone dehydrogenase，EC:1.1.5.2，見表1。

表1.與已知Ketogulonicigenium vulgare Y25及WSH-001比較，SPU B805體內(nèi)缺乏的關(guān)鍵酶及其對(duì)應(yīng)的酶促反應(yīng)

本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供菌株酮古龍酸菌SPU B805發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA 的方法，發(fā)酵方法如下：

1.分離及斜面培養(yǎng)基：酵母膏0.1-10g/L、牛肉膏0.1-10g/L、玉米漿0.1-30g/L、蛋白胨0.1-15g/L、無水硫酸鎂0.1-10g/L、山梨糖0.2-20g/L、碳酸鈣0.1-10g/L、瓊脂20g/L、pH5.0-8.0。

2.種子培養(yǎng)基：L-山梨糖0.5-40g/L、玉米漿0.1-30g/L、蛋白胨0.1-15g/L、酵母膏0.1-5g/L、葡萄糖0.1-50g/L、D-山梨醇0.2-20g/L、D-甘露醇0.1-20g/L、碳酸鈣0.1-10g/L、pH5.0-8.0。

3.發(fā)酵培養(yǎng)基：L-山梨糖10-150g/L、玉米漿0.1-20g/L、尿素1-40g/L、無水硫酸鎂0.1-0.5g/L、pH5.0-8.0；

4.培養(yǎng)方法：

(1)斜面培養(yǎng)

挑取SPU B805菌體與伴生菌Bacillus megaterium于斜面培養(yǎng)基搭配26-34℃混合培養(yǎng)3-5天。

(2)種子培養(yǎng)

將SPU B805與伴生菌Bacillus megaterium混合培養(yǎng)的斜面接入15～30mL的種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中16-32h，于26～34℃震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150-300rpm，制備發(fā)酵用種子液。

(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液按接種量5-25％(v/v)接種于裝有20～40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于26～34℃震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150-300rpm，培養(yǎng)32-44h。

(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)10-12h后采用連續(xù)流加L-山梨糖工藝，控制底物L(fēng)-山梨糖濃度，L-山梨糖底物初始度為1-5％，終點(diǎn)累積流加量控制在8-12％，優(yōu)選8-10％，流加時(shí)間控制在12-36h，使用20-25％的碳酸鈉控制pH為6.5-8.0。

(5)本發(fā)明提供了該菌株在發(fā)酵過程中，產(chǎn)生2-KGA的最佳溫度為30-32℃，搖瓶發(fā)酵L-山梨糖最佳終點(diǎn)濃度為8％；發(fā)酵罐培養(yǎng)最佳底物L(fēng)-山梨糖濃度為4％，最佳L-山梨糖流加總量為6-10％。

本發(fā)明的有益效果：與原VC二步發(fā)酵生產(chǎn)菌株相比較，在底物L(fēng)-山梨糖為8％的濃度下，經(jīng)過32-44h搖瓶發(fā)酵，2-KGA的轉(zhuǎn)化率為90％以上(對(duì)照組為85％)，在底物L(fēng)-山梨糖為8-10％的濃度下，5L發(fā)酵罐36-48h發(fā)酵，2-KGA的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到95％以上 (對(duì)照組約為90％)。

本發(fā)明使用的普通生酮基古龍?zhí)撬峋?Ketogulonicigenium vulgare)(SPU B805)已送至中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏日期2016年8月17日，保藏編號(hào)為CGMCC No.12858。

附圖說明：

圖1為與Bacillus megaterium混合培養(yǎng)的Ketogulonicigenium vulgare SPU B805光鏡1000倍下的形態(tài)。

圖2為Ketogulonicigenium vulgare SPU B805與臨近種屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

圖3.Ketogulonicigenium vulgare SPU B805與已知酮古龍酸菌基因組比較。圖中相同圖案框圖代表同源序列，其中菌株WSH-001及Y25分別擁有2個(gè)大質(zhì)粒pKVU_100，pKVU_200及pYP1，pYP2。在K.vulgare SPU B805基因組中，存在與pKVU_100及pYP1相同的同源序列(灰色框)，而質(zhì)粒pKVU_200及pYP2(白色框)在SPU B805中缺失。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施實(shí)例1：酮古龍酸菌SPU B805體內(nèi)所缺乏的4種關(guān)鍵酶及其基因序列見SEQ ID：1，SEQ ID：2，SEQ ID：3，SEQ ID:4。

實(shí)施實(shí)例2：酮古龍酸菌SPU B805生物學(xué)特性

SPU B805在革蘭氏染色后，呈革蘭陰性菌短桿菌，可形成短鏈或絲狀體，不能形成芽孢。該菌在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4天，其菌落形態(tài)為點(diǎn)狀，凸起，完整，光滑的圓形菌落，菌落表面成油狀，透明，有棕色色素產(chǎn)生。

提取菌株SPU B805的基因組DNA，以Primer(S)：5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’；和Primer(A)：5’AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增16s rRNA基因，純化后進(jìn)行基因測(cè)序，并將所測(cè)序列與Genbank中的rRNA同源序列比對(duì)，選取7株較高同源性的菌株，利用軟件Mega5構(gòu)建菌種進(jìn)化樹。菌株SPU B805與Ketogulonicigenium vulgare同源性最高。再結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，該菌株被鑒定為Ketogulonicigenium vulgare。

實(shí)施實(shí)例3：菌株SPU B805搖瓶發(fā)酵特性

將混菌斜面(SPU B805及Bacillus megaterium)接于種子培養(yǎng)基中，30℃、220rpm搖瓶培養(yǎng)18h后，以15％轉(zhuǎn)種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，其發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)含有8％的山梨 糖，于26～34℃，220r/min振蕩培養(yǎng)至44h。每隔4h取樣，測(cè)定2-KGA產(chǎn)量以及轉(zhuǎn)化率，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由此可見，菌株SPU B805在32℃發(fā)酵36h可完成發(fā)酵，2-KGA平均轉(zhuǎn)化率可到達(dá)95.34％。

表2.菌株SPU B805搖瓶發(fā)酵特性.

實(shí)施實(shí)例4：菌株SPU B805發(fā)酵的最適底物L(fēng)-山梨糖濃度的確定

將混菌斜面(SPU B805及Bacillus megaterium)接于種子培養(yǎng)基中，32℃、220rpm搖瓶培養(yǎng)18h后，以10％轉(zhuǎn)種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，其發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)含有6％～12％的山梨糖，于32℃，220r/min振蕩培養(yǎng)至48h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定2-KGA的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，如表3所示，可見菌株SPU B805最適的山梨糖底物濃度為8％，此條件下轉(zhuǎn)化率平均可達(dá)94.72％。

表3.菌株SPU B805發(fā)酵的最適底物L(fēng)-山梨糖濃度的確定

實(shí)施實(shí)例5菌株SPU B805發(fā)酵罐上發(fā)酵特性

根據(jù)搖瓶發(fā)酵研究結(jié)果利用發(fā)酵培養(yǎng)基，在5L全自動(dòng)發(fā)罐上設(shè)計(jì)工藝控制參數(shù)(如表4)，在不同底物濃度下，對(duì)菌株SPU B805發(fā)酵性能進(jìn)行研究，結(jié)果見表5。可見菌株SPU B805在36h時(shí)其轉(zhuǎn)化率為95.35％。

表4.發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定.

表5.菌株SPU B805在發(fā)酵罐上的發(fā)酵特性.