本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

豬肺炎支原體會引起豬的慢性呼吸道疾病，造成養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。肺炎支原體的培養(yǎng)和保存條件非常苛刻，是疫苗規(guī)?；a(chǎn)的工藝難題。豬支原體肺炎又稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病，廣泛存在于世界各地。豬只感染后除導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長發(fā)育不良外，且易繼發(fā)病毒或細(xì)菌感染，造成豬死亡率升高，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失慘重。疫苗免疫是預(yù)防本病最重要的手段。在支原體細(xì)胞壁組成成分當(dāng)中，脂類含量很高，其中膽固醇的含量就有約36％，所以脂類是非常重要的一個成分。在培養(yǎng)基中，添加血清會造成成本較高，利用脂類來代替血清，也是近些年來研究的熱點，本發(fā)明利用脂類的合理添加，使得培養(yǎng)支原體所用的血清濃度降低到5％以下，大大的節(jié)省了成本。目前，市場上的支原體培養(yǎng)如：A26、KM2培養(yǎng)基基成分較為簡單。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述培養(yǎng)基成本較高、成分簡單的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種成本低及效果好的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加包，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：M199、腦浸出粉、水解乳蛋白、BSA、葡萄糖、新鮮酵母提取物、Hepes、檸檬酸鐵、氯化鈣.2H₂O、酚紅、dd H₂O，所述添加包的組份包括膽固醇、亞油酸、亞麻酸、軟脂酸、乙醇、豬血清。

在本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基一種較佳實施例中，所述M199的質(zhì)量濃度為5-17g/L，所述腦浸出粉的質(zhì)量濃度為3-15g/L，所述水解乳蛋白的質(zhì)量濃度為0.5-3g/L，所述BSA的質(zhì)量濃度為2-8g/L，所述葡萄糖的質(zhì)量濃度為4-8g/L，所述新鮮酵母提取物的質(zhì)量濃度為3-60g/L，所述Hepes的質(zhì)量濃度為1-5g/L，所述檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度為0.01-5g/L，所述氯化鈣.2H₂O的質(zhì)量濃度為0.01-5g/L，所述酚紅的濃度為1-6ml/L，所述dd H2O的質(zhì)量濃度為500-2000ml/L，。

在本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基一種較佳實施例中，所述膽固醇的質(zhì)量濃度為50-90mg/L、所述亞油酸的質(zhì)量濃度為30-100mg/L、所述亞麻酸的質(zhì)量濃度為30-100mg/L、所述軟脂酸的質(zhì)量濃度為30-100mg/L、所述乙醇的濃度為10-15ml/L、所述豬血清的濃度為30-100mg/L。

在本發(fā)明提供的所述低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：

步驟一、配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基：按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分配方配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

步驟二、PH值調(diào)節(jié)：用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.4-7.6；

步驟三、滅菌：對基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行高溫消毒；

步驟四、加入添加包：無菌條件下加入添加包，即制得成品。

在本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法一種較佳實施例中，所述步驟四中添加包的制備方法具體為：

步驟一、在一個容器中加5-30ml的無水乙醇，并且將其溫度控制在10-60℃；

步驟二、將膽固醇、亞油酸、亞麻酸、軟脂酸及乙醇的組分緩慢加入；

步驟三、在恒溫條件下對添加包混合組分進(jìn)行震蕩或攪拌至完全溶解；

步驟四、將步驟三中的溶液冷卻至室溫，同時加入豬血清；

步驟五、配制好后過濾。

本發(fā)明的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法的注意事項及有益效果：

利用成分相對復(fù)雜的培養(yǎng)基M199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的一部分，可以避免的培養(yǎng)基成分單一所造成的影響培養(yǎng)基性能的作用；該豬肺炎支原體培養(yǎng)基能夠降低血清的用量，可以使得血清的添加量低于5％，從而降低了成本，同時也使得支原體的質(zhì)量提升，既保證半成品生長滴度高而且穩(wěn)定，用本發(fā)明方法制備的半成品菌液效價高達(dá)10⁹CCU/ml，可用于疫苗等相關(guān)領(lǐng)域的生產(chǎn)和研究。有利于高效生產(chǎn)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的研制，通過一些水解物以及脂類的添加，可以使得血清的添加量低于5％，從而降低了成本，同時也使得支原體的質(zhì)量提升，提高豬肺炎支原體抗原效價。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中：

圖1是本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法一種實施例的工藝流程圖；

圖2，是圖1所示的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法中添加包的制備方法一種實施例的工藝流程圖；

圖3，是本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基對豬肺炎支原體菌株進(jìn)行培養(yǎng)試驗的生長情況圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基1包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加包。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：M199、腦浸出粉、水解乳蛋白、BSA、葡萄糖、新鮮酵母提取物、Hepes、檸檬酸鐵、氯化鈣.2H₂O、酚紅、dd H₂O。所述添加包的組份包括膽固醇、亞油酸、亞麻酸、軟脂酸、乙醇、豬血清。

所述M199的質(zhì)量濃度為5-17g/L，所述腦浸出粉的質(zhì)量濃度為3-15g/L，所述水解乳蛋白的質(zhì)量濃度為0.5-3g/L，所述BSA的質(zhì)量濃度為2-8g/L，所述葡萄糖的質(zhì)量濃度為4-8g/L，所述新鮮酵母提取物的質(zhì)量濃度為3-60g/L，所述Hepes的質(zhì)量濃度為1-5g/L，所述檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度為0.01-5g/L，所述氯化鈣.2H2O的質(zhì)量濃度為0.01-5g/L，所述酚紅的濃度為1-6ml/L，所述dd H2O的質(zhì)量濃度為500-2000ml/L，。

所述膽固醇的質(zhì)量濃度為50-90mg/L、所述亞油酸的質(zhì)量濃度為30-100mg/L、所述亞麻酸的質(zhì)量濃度為30-100mg/L、所述軟脂酸的質(zhì)量濃度為30-100mg/L、所述乙醇的濃度為10-15ml/L、所述豬血清的濃度為30-100mg/L。

請參閱圖1，是本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法一種實施例的工藝流程圖。

所述低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法S1，包括如下步驟：

步驟S11、配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基：按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分配方配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

步驟S12、PH值調(diào)節(jié)：用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.4-7.6；

步驟S13、滅菌：對基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行高溫消毒；

步驟S14、加入添加包：無菌條件下加入添加包，即制得成品。

請參閱圖2，是本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法中添加包的制備方法一種實施例的工藝流程圖。

所述步驟四中添加包的制備方法S14具體為：

步驟S141、在一個容器中加5-30ml的無水乙醇，并且將其溫度控制在10-60℃；

步驟S142、將膽固醇、亞油酸、亞麻酸、軟脂酸及乙醇的組分緩慢加入；

步驟S143、在恒溫條件下對添加包混合組分進(jìn)行震蕩或攪拌至完全溶解；

步驟S144、將步驟S143中的溶液冷卻至室溫，同時加入豬血清；

步驟S145、配制好后過濾。

本發(fā)明的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基1及其制備方法具有如下有益效果：

利用成分相對復(fù)雜的培養(yǎng)基M199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的一部分，可以避免的培養(yǎng)基成分單一所造成的影響培養(yǎng)基性能的作用；該豬肺炎支原體培養(yǎng)基能夠降低血清的用量，可以使得血清的添加量低于5％，從而降低了成本，同時也使得支原體的質(zhì)量提升，既保證半成品生長滴度高而且穩(wěn)定，用本發(fā)明方法制備的半成品菌液效價高達(dá)10⁹CCU/ml，可用于疫苗等相關(guān)領(lǐng)域的生產(chǎn)和研究。有利于高效生產(chǎn)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的研制，通過一些水解物以及脂類的添加，可以使得血清的添加量低于5％，從而降低了成本，同時也使得支原體的質(zhì)量提升，提高豬肺炎支原體抗原效價。

采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基對豬肺炎支原體菌株進(jìn)行培養(yǎng)試驗：

本實驗選取的支原體是豬肺炎支原體168株，培養(yǎng)方法如下：在以KM2、A26添加20％的豬血清作為對照試驗，以本發(fā)明培養(yǎng)基JYK-MHM+5％豬血清作為實驗組進(jìn)行了豬肺炎支原體培養(yǎng)試驗。在37℃、轉(zhuǎn)速100rpm、PH 7.5的條件下培養(yǎng)使得支原體種子復(fù)壯，當(dāng)培養(yǎng)基的顏色變黃時，即培養(yǎng)基的PH值間于5-6之間時，在無菌條件下取出培養(yǎng)物，進(jìn)行活菌滴度的測定。

活菌滴度(CCU)測定

在培養(yǎng)的豬肺炎支原體培養(yǎng)基中，每隔6時進(jìn)行采樣。具體方法如下：將培養(yǎng)基(包括：KM2+20％豬血清、A26+20％豬血清和自主研發(fā)的JYK-MHM+5％豬血清)分別分裝成每管2.7ml，第1號管加入待測菌液0.3ml，吹打混勻后，取0.3ml加入第2號試管中，吹打混勻后，取0.3ml加入第3號試管中，依次重復(fù)以上操作至第10管，將第10管中混勻后取0.3ml棄去。由此待測菌液被稀釋為10^-1，10^-2，10^-3至10^-10不同的稀釋度。每個時間點取樣3份，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以未接種菌液的培養(yǎng)基為陰性對照。連續(xù)計數(shù)60h每天觀察試管顏色變化，直至無試管顏色發(fā)生變化為止，最后一個變色的試管即為待測菌液的生長滴度，用顏色變化單位(color change unit，CCU)表示。

請參閱圖3，是本發(fā)明提供的低血清高效培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)基對豬肺炎支原體菌株進(jìn)行培養(yǎng)試驗的生長情況圖。

圖3：豬肺炎支原體在不同的培養(yǎng)基中的生長情況，縱坐標(biāo)表示Log^CCU，橫坐標(biāo)表示時間(h)。

從上圖可以看出，本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體的顏色變化單位CCU為10⁹/ml，明顯高于對照組KM2+20％豬血清、A26+20％豬血清。該豬肺炎支原體培養(yǎng)基能夠降低血清的用量，可以使得血清的添加量低于5％，從而降低了成本，同時也使得支原體的質(zhì)量提升，既保證半成品生長滴度高而且穩(wěn)定，用本發(fā)明方法制備的半成品菌液效價高達(dá)10⁹CCU/ml，可用于疫苗等相關(guān)領(lǐng)域的生產(chǎn)單和位/研小究時/。h

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。