本發(fā)明涉及一株伯克霍爾德氏菌，具體地，涉及一株具有降解百菌清功能的伯克霍爾德氏菌，所述伯克霍爾德氏菌的培養(yǎng)方法，含有所述伯克霍爾德氏菌作為活性成分的菌劑，以及它們在降解百菌清中的應用。
背景技術：
百菌清(四氯間苯二腈)是一種取代苯類的保護性莖葉噴灑殺真菌劑,具有保護和治療作用，由美國鉆石制堿公司于1963年開發(fā)，有多種劑型，廣泛用于蔬菜、果樹以及豆類、水稻、小麥等多種作物上，以防治霜霉病、白斑病、黑斑病和軟腐病等病害。百菌清在植物表面有良好的黏著性，不易受雨水沖刷，藥效穩(wěn)定。然而，在大棚土中經(jīng)多次大量噴灑后其含量會較高，通過土壤自身很難降解。
百菌清純品為白色結(jié)晶，無臭味，不溶于水，微溶于丙酮等有機溶劑，對高等動物低毒，但對魚類及甲殼類動物毒性較大，對大鼠腎臟有致癌作用，致突變性較強，在防治農(nóng)作物病蟲草害中發(fā)揮了重要作用，但也對環(huán)境造成了污染。并且，百菌清農(nóng)藥在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量含農(nóng)藥廢水，且農(nóng)藥不論以何種方式施用，均會不可避免地通過多種途徑進入水體，造成水環(huán)境污染。
百菌清在水土環(huán)境中的降解受到很多研究人員的關注，微生物法有著方便，易處理，無二次污染等優(yōu)點。因此，發(fā)現(xiàn)新高效降解菌株對水土環(huán)境中百菌清修復具有重大意義和廣泛應用前景。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種對水土中的百菌清具有高效降解性能的微生物菌株，從而能夠簡單快捷的對環(huán)境中的百菌清進行有效的降解。
為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一株伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，其中，所述伯克霍爾德氏菌的保藏編號為CGMCC No.10848。
第二方面，本發(fā)明提供了一種伯克霍爾德氏菌的培養(yǎng)方法：其中，將如上所述的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848接種至以下培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)：
相對于1000重量份的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有45-55重量份的葡萄糖，10-20重量份的七水合硫酸鎂，10-20重量份的硫酸銨，25-35重量份的碳酸鈣，0.4-0.8重量份的磷酸二氫鉀，5-15重量份的蛋白胨，5-15重量份的氯化鈉，3-7重量份的酵母粉。
第三方面，本發(fā)明提供了一種菌劑，其中，該菌劑含有如上所述的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848的菌體作為活性成分。
優(yōu)選的，所述菌體為活菌體。
第四方面，本發(fā)明提供了如上所述的伯克霍爾德氏菌、如上所述的培養(yǎng)方法、如上所述的菌劑在降解百菌清中的應用。
第五方面，本發(fā)明提供了一種降解百菌清的方法，其中，該方法包括：將如上所述的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848和/或如上所述的菌劑與含有百菌清的環(huán)境接觸，以對環(huán)境中的百菌清進行降解。
將本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848用于降解百菌清的效果評估，結(jié)果顯示，該菌株能夠高效降解水土中的百菌清，如實施例2所示的，2天內(nèi)，在模擬水相中，該菌株對百菌清的降解率可高達71.99％，在模擬土相中，該菌株對百菌清的降解率可高達98.97％，在實際的土壤環(huán)境中，該 菌株對百菌清的降解率可高達99.05％。由此可以看出，本發(fā)明提供的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848能夠?qū)ν寥乐械陌倬暹M行有效地修復，具有較高的經(jīng)濟效益和社會效益。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。
生物保藏
本發(fā)明的菌株為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，于2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.10848。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
第一方面，本發(fā)明提供了一株伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，其中，所述伯克霍爾德氏菌的保藏編號為CGMCC No.10848。
本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)分離自安徽土壤。
本發(fā)明提供的伯克霍爾德氏菌經(jīng)過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量的伯克霍爾德氏菌的活菌體，所述培養(yǎng)的方法沒有特別的要求，只要是能使所述伯克霍爾德氏菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接種量將伯克霍爾德氏菌的活菌體接種于細菌培養(yǎng)基中，并且在好氧條件下，在20-38℃的溫度下培養(yǎng)8-72小時后，得到培養(yǎng)液。
本發(fā)明可以進一步分離上述培養(yǎng)液中的伯克霍爾德氏菌的活菌體，所述分離的方法沒有特別的限制，只要是能從培養(yǎng)液中富集菌體即可，例如可以通過離心和/或過濾的方法實現(xiàn)，所述離心和所述過濾的條件可以為公知的條 件，本發(fā)明在此不再贅述。
本發(fā)明提供的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
根據(jù)本發(fā)明，用于培養(yǎng)伯克霍爾德氏菌的培養(yǎng)基可以為本領域常規(guī)的細菌培養(yǎng)基，例如，LB培養(yǎng)基，但本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在含有如下成分的培養(yǎng)基中對伯克霍爾德氏菌進行培養(yǎng)，能夠進一步促進菌體的生長：相對于1000重量份的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有45-55重量份的葡萄糖，10-20重量份的七水合硫酸鎂，10-20重量份的硫酸銨，25-35重量份的碳酸鈣，0.4-0.8重量份的磷酸二氫鉀，5-15重量份的蛋白胨，5-15重量份的氯化鈉，3-7重量份的酵母粉。
本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過程中發(fā)現(xiàn)，如上所述的伯克霍爾德氏菌能夠?qū)Π倬遛r(nóng)藥進行有效的降解，且能夠以百菌清為唯一碳源進行生長。
基于此，第二方面，本發(fā)明提供了一種伯克霍爾德氏菌的培養(yǎng)方法：其中，將如上所述的伯克霍爾德氏菌接種至以下培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)：
相對于1kg的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有45-55g的葡萄糖，10-20g的七水合硫酸鎂，10-20g的硫酸銨，25-35g的碳酸鈣，0.4-0.8g的磷酸二氫鉀，5-15g的蛋白胨，5-15g的氯化鈉，3-7g的酵母粉。
另外，如需在固體平板上對所述伯克霍爾德氏菌進行培養(yǎng)，還可以在如上所述的培養(yǎng)基中添加適量的瓊脂粉，從而制備成固體培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明，對所述伯克霍爾德氏菌進行培養(yǎng)的條件可以為本領域常規(guī)對細菌進行培養(yǎng)的條件，例如，在有氧條件下，培養(yǎng)的溫度可以為20-38℃。
第三方面，本發(fā)明提供了一種菌劑，其中，該菌劑含有如上所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)的菌體作為活性成分。
本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過程中意外的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌的死菌體和活菌體均能夠有效的環(huán)境中的百菌清進行降解。因此，如上所述 的伯克霍爾德氏菌的菌體可以為活菌體，也可為死菌體，還可以為活菌體和死菌體的混合菌體，但優(yōu)選為活菌體。
根據(jù)本發(fā)明，所述菌劑中所述伯克霍爾德氏菌的濃度沒有特別的限制，可以根據(jù)具體的情況進行具體的選擇，在此不再詳細贅述。
另外，根據(jù)預定的用途不同，本發(fā)明提供的菌劑可以制備為不同的劑型，并添加相應的輔料等成分。其中，在何種劑型的菌劑中添加何種輔料為本領域技術人員所公知，在此不再詳細贅述。
根據(jù)本發(fā)明一種具體的實施方式，所述菌劑含有本發(fā)明如上提供的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848和10重量％的蛋白胨，10重量％的氯化鈉，15重量％的葡萄糖以及5重量％的酵母粉。
另外，本發(fā)明提供的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848還可以和其他菌體進行復配制備成混合菌劑，以進一步提高其效率。
根據(jù)本發(fā)明，所述菌劑可以為菌液的形式，也可以為干粉的形式，本領域技術人員可以根據(jù)實際的需要自行選擇。
第四方面，本發(fā)明提供了如上所述的伯克霍爾德氏菌、如上所述的培養(yǎng)方法、如上所述的菌劑在降解百菌清中的應用。
第五方面，本發(fā)明提供了一種降解百菌清的方法，其中，該方法包括：將如上所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)和/或如上所述的菌劑與含有百菌清的環(huán)境接觸，以對環(huán)境中的百菌清進行降解。
本發(fā)明優(yōu)選在所述伯克霍爾德氏菌能夠存活的條件下對環(huán)境中的百菌清進行降解。其中，術語“伯克霍爾德氏菌能夠存活”是指在含有百菌清的環(huán)境中，至少大于5％，優(yōu)選至少大于10％，更優(yōu)選至少大于60％的菌體能夠存活。術語“伯克霍爾德氏菌能夠存活的條件”是指環(huán)境中至少包括伯克霍爾德氏菌能夠存活的最基本條件，例如，溫度、營養(yǎng)源等，此為本領域技術人員所公知，在此不再贅述。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，為了進一步提高所述伯克霍爾德氏菌在環(huán)境中的生存能力，還可以向需要修復的環(huán)境中加入適宜所述伯克霍爾德氏菌生長的營養(yǎng)源，例如，在本發(fā)明的第二方面所提及的培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明，含有百菌清的環(huán)境可以包括任何含有百菌清的環(huán)境，例如，所述含有百菌清的環(huán)境可以包括含有百菌清的土壤或水體。
根據(jù)本發(fā)明，加入至所述含有百菌清的環(huán)境中的伯克霍爾德氏菌的形式并沒有特別的限定，只要保證加入后所述伯克霍爾德氏菌能夠在所述含有百菌清的環(huán)境中起作用并且對所述百菌清進行有效降解即可，加入的所述伯克霍爾德氏菌的形式，例如，可以為菌液的形式，也可以為菌體沉淀的形式，還也可以為干粉的形式。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的伯克霍爾德氏菌對百菌清的降解具有劑量和時間效應，例如，在一定的范圍內(nèi)，對百菌清的降解率會隨著所述伯克霍爾德氏菌濃度的升高或者時間的延長而提高。
因此，本發(fā)明對加入的伯克霍爾德氏菌的數(shù)量沒有特別的限制，這可以根據(jù)所述含有百菌清的環(huán)境中的百菌清的含量來決定，例如，當所述環(huán)境中的百菌清含量較高或所述環(huán)境對于所述伯克霍爾德氏菌的生存較不利時，可以提高所述伯克霍爾德氏菌的接種量；當所述環(huán)境中的百菌清含量較低或所述環(huán)境對所述伯克霍爾德氏菌的生存的影響較小時，可以減少所述伯克霍爾德氏菌的接種量。
根據(jù)本發(fā)明，當所述含有百菌清的環(huán)境為土壤時，為了進一步促進本發(fā)明提供的伯克霍爾德氏菌對百菌清的降解效率，優(yōu)選的，將土壤中的水含量控制在至少15重量％，更優(yōu)選為18-30重量％。
以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。
以下實施例中：
發(fā)酵培養(yǎng)基：以1L的培養(yǎng)基為基準，所述培養(yǎng)基含有50g的葡萄糖，15g的七水合硫酸鎂，15g的硫酸銨，30g的碳酸鈣，0.6g的磷酸二氫鉀，10g的蛋白胨，10g的氯化鈉，5g的酵母粉。
無機鹽液體培養(yǎng)基：1.5g的NH4NO3，0.5g的KH2PO4，1.5g的K2HPO4，1.0g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，PH＝7，去離子水補齊至1000ml。
無機鹽固體培養(yǎng)基：在如上的無機鹽液體培養(yǎng)基中添加適量的瓊脂后形成的固體培養(yǎng)基。
本發(fā)明的菌株為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，并于2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.10848，簡稱P-6。
本菌劑：含有10體積％的本發(fā)明的菌株以及10ml上述無機鹽液體培養(yǎng)基。
參比菌株為假鼻疽伯克霍爾德氏菌：分離自農(nóng)殘土。
參比菌劑：含有10體積的％的參比菌株以及10ml上述無機鹽液體培養(yǎng)基。
百菌清的測定方法：
水相中，將含有百菌清的液體倒入50ml離心管中，加入10ml石油醚振蕩萃取5分，再加入10ml石油醚振蕩萃取5分，靜置后取上清液10ml向其中加入無水硫酸鈉0.4g，脫水振蕩1分，之后取4ml于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)至干，再用2ml色譜純丙酮溶解再稀釋10倍，使用氣相色譜進行檢測
土相中，稱量5g烘干土，加入體積比例為1:1的丙酮和水10ml，靜置30分鐘，振蕩5分后離心取上清液，加入5ml石油醚振蕩萃取5分，如此重復三次，靜置后取上清液10ml向其中加入無水硫酸鈉0.4g，脫水振蕩1 分，之后取4ml于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)至干，再用2ml色譜純丙酮溶解再稀釋10倍，使用氣相色譜進行檢測。
水相中和土相中的用于檢測的氣相色譜條件為：
柱子：HT-Pesticides 1；檢測器：ECD檢測器；進樣口溫度：260℃；柱溫：240℃；檢測器溫度：280℃；分流比：60；進樣量：1μL；尾吹60mL/min；柱壓：60kpa；載氣流量：1.25mL/min。
百菌清降解率＝(未處理的樣本中百菌清的含量-處理后樣本中百菌清的含量)/未處理的樣本中百菌清的含量×100％
制備例
將保存的本發(fā)明的菌種以及參比菌種至如上的經(jīng)滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并于37℃下活化兩次?；罨蟮谋揪暌约皡⒈染甑臐舛染鶠?09CFU/mL。
實施例1
本實施例用于說明本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌的形態(tài)學、生理生化特性
(1)形態(tài)學特性
將活化好的本發(fā)明的菌株用生理鹽水進行梯度稀釋，并選擇合適的濃度涂布于平板固體LB培養(yǎng)基上，濃度的選擇以在LB固體培養(yǎng)基上能夠形成分散開的單菌落為準。然后將平板倒置于37℃溫箱中進行培養(yǎng)，待單菌落形成后觀察菌落形態(tài)。
經(jīng)觀察，該菌株在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時后能夠形成直徑1-2mm的菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣完整，凸狀，且不透明。
(2)過氧化氫酶試驗
取以上經(jīng)活化的培養(yǎng)液，直接滴加3％過氧化氫，立即觀察，有大量氣泡產(chǎn)生，為陽性反應“+”。
(3)氧化酶試驗
在LB培養(yǎng)物上分別滴加Kovacs氏試劑和Ewing氏試劑1-2滴，在數(shù)分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，有顏色改變，為陽性反應“+”。
(4)革蘭氏染色
涂菌：取干凈載玻片一塊，在載玻片上加一滴生理鹽水，按無菌操作法將活化的菌液涂在載玻片上，注意取菌不要太多。
干燥：讓涂片自然晾干或用酒精燈烘干。
固定：手執(zhí)載玻片一端，菌膜朝上，在火焰上固定2-3次。
初染：滴加結(jié)晶紫(剛好覆蓋菌膜為宜)，染色1-2min，水洗。
媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。
脫色：用濾紙吸去載玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴流管滴加95％乙醇脫色，直至流下的乙醇無紫色時，立即水洗。
復染：用番紅液復染約2min，水洗。
鏡檢：干燥后，用油鏡觀察，菌體被染成紫色，為革蘭氏陰性菌。
實施例2
本實施例用于說明本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌對百菌清的降解性能
(1)在水體中對百菌清的降解性
在無機鹽液體培養(yǎng)基中添加百菌清農(nóng)藥，添加量使得在每升培養(yǎng)基中，百菌清的含量為20mg，然后接入10體積％的如上活化兩次的本發(fā)明的伯克 霍爾德氏菌CGMCC No.10848，于37℃下培養(yǎng)2天后測定培養(yǎng)液中百菌清的濃度，并計算降解率，結(jié)果見表1。
(2)在土相中對百菌清的降解性
在沒有受百菌清污染的土壤中加入百菌清，并使得相對于1kg的土壤，百菌清的含量為10mg，然后分別加入5ml、10ml、15ml和20ml的上述經(jīng)活化2次的本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848培養(yǎng)液，在37℃下進行降解，并分別在第2天、第4天和第6天測定土壤中的百菌清濃度，并計算降解率，結(jié)果見表1。
同時，采用相同的方法向如上相同含量的百菌清土壤中加入0.05g、0.15g、0.25g和0.5g的菌劑，在相同的條件下對土壤中的百菌清進行降解，并分別在第2天、第4天和第6天測定土壤中的百菌清濃度，并計算降解率，結(jié)果見表1。
對比例2-1
本對比例用于說明自然狀態(tài)下百菌清的降解性能
按照實施例2的步驟(1)和(2)的方法配置相同百菌清濃度的水相和土相，并按照相同的條件進行處理，不同的是，接入相同量的不含任何菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基(空白對照)。測定的百菌清的濃度，并計算降解率，結(jié)果見表1。
對比例2-2
本對比例用于說明參比菌株的百菌清的降解性能
按照實施例2的步驟(1)和(2)的方法配置相同百菌清濃度的水相和土相介質(zhì)，并按照相同的條件進行處理，不同的是，分別接入相同量的如上活化2次的假鼻疽伯克霍爾德菌以及參比菌劑。測定的百菌清的濃度，并計 算降解率，結(jié)果見表1。
由表1可以看出，伯克霍爾德氏菌和菌劑對土壤和水體中的百菌清有明顯的去除效果，可廣泛應用于修復含有百菌清污染的環(huán)境，對修復土壤和生態(tài)環(huán)境問題有著重大的意義。
表1
實施例3
本實施例用于說明本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌對煙植土壤的修復能力
在移栽煙苗和未移栽煙苗的土壤中噴灑百菌清農(nóng)藥，并測定土壤中的百菌清濃度，然后向穴內(nèi)噴散本發(fā)明的經(jīng)活化的伯克霍爾德氏菌培養(yǎng)液，噴灑量為每穴20ml。30天后測定穴內(nèi)百菌清的濃度，并計算百菌清的降解率。每種情況取3穴，然后取均值，結(jié)果見表2。
對比例3-1
本對比例用于說明自然狀態(tài)下煙植土壤的修復能力
在移栽煙苗和未移栽煙苗的土壤中噴灑百菌清農(nóng)藥，并測定土壤中的百菌清濃度，同時向穴內(nèi)噴散不含任何菌體的培養(yǎng)液(空白對照)，噴灑量為每穴20ml。30天后測定穴內(nèi)百菌清的濃度，并計算百菌清的降解率。每種情況取3穴，然后取均值，結(jié)果見表2。
對比例3-2
本對比例用于說明參比的菌株對煙植土壤的修復能力
在移栽煙苗和未移栽煙苗的土壤中噴灑百菌清農(nóng)藥，并測定土壤中的百菌清濃度濃度，然后向穴內(nèi)噴散如上的參比菌株，噴灑量為每穴20ml。30天后測定穴內(nèi)百菌清的濃度，并計算百菌清的降解率。每種情況取3穴，然后取均值，結(jié)果見表2。
表2
由以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明提供的菌株對水土中的百菌清具有高效地降解性能，并且方便快捷，簡單易行，較同屬的菌株具有突出的降解效果。
以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術方 案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。