一種聯(lián)合應(yīng)用amf與pgpr菌劑進(jìn)行柑橘容器菌根苗栽培的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及柑橘苗木栽培技術(shù)，具體涉及聯(lián)合應(yīng)用AMF與PGPR菌劑進(jìn)行柑橘容器 菌根苗栽培的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 叢枝菌根真菌（AMF)幾乎存在于所有生態(tài)類型土壤中，在自然界中分布極其廣泛， 其能侵染80%的陸生高等植物形成互惠共生體。經(jīng)研究表明，AMF真菌能促進(jìn)宿主植物對 養(yǎng)分和水分的吸收，提高宿主植物對多種生物和非生物脅迫的抗性；另外，在生物修復(fù)退化 土壤、改良土壤結(jié)構(gòu)、減輕土壤污染、保護(hù)和利用資源等方面也具有不可替代的重要作用。
[0003] 而根圍促生細(xì)菌（PGPR)是根際土壤微生態(tài)中的一類重要的有益微生物成員。 研究表明，巨大芽孢桿菌（ifeciWiAs挪識terii/a?)與膠質(zhì)類芽孢桿菌（ 作為微生物肥料中兩類經(jīng)常應(yīng)用的PGPR，能夠促進(jìn)土壤難溶性磷、鉀等礦 物質(zhì)元素的釋放，近年來，通過其改善植物營養(yǎng)吸收，減少化學(xué)肥料施用的研究逐漸成為了 發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的熱點(diǎn)。
[0004] 在目前，柑橘砧木苗通常通過種子繁育，傳統(tǒng)的露地育苗設(shè)施環(huán)境調(diào)控能力差，出 苗率偏低、偏慢，容易受病蟲害感染，而且在自然土壤中育苗，不同種類的大量微生物常與 AMF競爭，從而抑制AMF對砧木苗根系的大量侵染。因此，露地繁育的柑橘砧木苗只帶有自 然的、較少的菌根，嚴(yán)重消弱了菌根共生體對柑橘吸收利用營養(yǎng)及抗病性的有益貢獻(xiàn)。
[0005] 而相比較露地育苗，柑橘容器育苗能夠培育出高質(zhì)量苗木，近年來在全國柑橘容 器育苗中被大量采用。理論上來說，若在育苗伊始就對苗木根系接種上高效的AMF菌種，批 量化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)柑橘容器菌根苗，可顯著提高柑橘幼苗對基質(zhì)養(yǎng)分的利用吸收，促進(jìn)苗木快 速整齊生長，縮短育苗周期，并提高苗木定植后的抗逆性和抗病性，緩解柑橘連作障礙，而 且可使橘樹終生受益。但經(jīng)多年的研究表明，單一微生物的促生長作用效率普遍偏低，無法 滿足實(shí)際當(dāng)中的大批量育苗需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種聯(lián)合應(yīng)用AMF與PGPR菌劑進(jìn)行柑橘容 器菌根苗栽培的方法，其能夠提高柑橘根系的菌根侵染率，更好的活化營養(yǎng)土礦質(zhì)營養(yǎng)，促 進(jìn)柑橘容器苗對養(yǎng)分和水分的吸收利用，培育出抗逆性和成活率更高的菌根容器苗，有利 于工廠化大批量容器苗的整齊快速的生長，縮短育苗期，并能使橘樹終身受益菌根促生效 應(yīng)，減少化學(xué)肥料在容器育苗中的施用量。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種聯(lián)合應(yīng)用AMF與PGPR菌劑進(jìn)行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：包括如 下幾個步驟： a、制備AMF菌根接種體：選細(xì)河沙、橘園土、草炭按體積比2:1:1混勾，裝布袋經(jīng)121°C 濕熱滅菌2小時2次，中間間隔24小時，放置1~2周后作為AMF菌劑培養(yǎng)基質(zhì)；將含有AMF 孢子的菌劑加入上述培養(yǎng)基質(zhì)中并播種三葉草，在塑料溫室自然光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)3~4 個月后收獲基質(zhì)和根段，保證根段侵染率在70%以上，侵染強(qiáng)度在40%以上；且風(fēng)干后測定 AMF孢子密度，保證每克接種基質(zhì)至少含25個成熟健康孢子，作為標(biāo)準(zhǔn)接種劑； b、 制備PGPR菌劑：將濃度為10s CFU/ml的PGPR種子液Iml接種于液體培養(yǎng)基中，于 30攝氏度下180轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)36小時后稀釋至10s CFU/ml，作為標(biāo)準(zhǔn)接種劑； c、 育苗土消毒：將育苗土裝布袋濕熱滅菌2小時2次，消毒除去雜菌，中間間隔24小 時，放置1~2周后作為柑橘容器育苗土；所述育苗土為橘園普通土壤添加堆慪發(fā)酵、充分腐 熟并以體積比7 :3的比例添加菌糠；所述菌糠為金針菇、平菇、杏鮑菇菌糠中的一種或多 種； d. 枳種子催芽：選擇上一年采集優(yōu)質(zhì)飽滿枳種子，用10%雙氧水表面消毒10分鐘，蒸 餾水沖洗數(shù)次后，置于底部鋪有濕潤棉層的托盤中，于27°C電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱中暗培 養(yǎng)催芽； e. 播種與接種：先將萌發(fā)的枳種子在濃度為10s CFU/ml的PGPR液體培養(yǎng)基中浸泡 30分鐘，在育苗缽中裝入消毒育苗土至育苗缽的3/4處，澆透水壓出孔穴，而后將AMF菌根 接種體25-35克撒入孔穴，并以1株/缽將浸泡過的枳種子根系平直的播種于育苗缽孔穴 中，并灌根移入5ml的PGPR菌劑，再覆蓋1-1. 5 cm育苗土。
[0008] 進(jìn)一步的，上述AMF為根內(nèi)球囊霉或摩西球囊霉 iFunneliforeis mosseae、。
[0009] 進(jìn)一步的，上述PGPR為巨大芽孢桿菌，所述液體培養(yǎng)基含有1. 5%淀粉、0. 5%酵母 粉、0· 05% K2HPO4 · 3Η20、0· 05% NaCl、0. 05% MgSO4 · 7H20 和 0· 01% CaCO3,液體培養(yǎng)基的 pH 為 7. 0〇
[0010] 進(jìn)一步的，上述PGPR為膠質(zhì)類芽孢桿菌，其液體培養(yǎng)基含有0.5%牛肉浸膏、1% 蛋白胨、0· 1% NaCl、0. 1% MgSO4 · 7Η20、0· 05% K2HPO4 · 3H20 和 0· 01% CaCO3,液體培養(yǎng)基的 pH 為 7. 0。
[0011] 進(jìn)一步的，上述菌糠為糞肥菌糠，其通過清潔菌糠加入稀人畜糞尿充分混勻，用稀 泥封頂，堆體溫度達(dá)到50°C，自然發(fā)酵2個月左右，當(dāng)堆肥溫度低于32°C，達(dá)到黑、爛即可。
[0012] 進(jìn)一步的，上述培育土中添加過磷酸鈣肥料。
[0013] 進(jìn)一步的，上述育苗缽在播種前先清洗干凈，用0. 1%高錳酸鉀溶液浸泡30分鐘后 晾干備用。
[0014] 進(jìn)一步的，上述播完種的育苗缽放置于溫室培養(yǎng)架上培育柑橘砧木苗，每隔7天 澆施200ml自來水/缽，溫室搭建遮陽網(wǎng)，遮陽率70%，溫室內(nèi)溫度為28-34°C，相對濕度80% 以上，進(jìn)行常規(guī)管理，注意日常檢查，防范病蟲害。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1.在容器育苗營養(yǎng)土中添加高效促生長的AMF菌根接種體，能夠比未接種容器育苗培 育出抗逆性和成活率更高的菌根容器苗，接種技術(shù)簡單易行，有利于工廠化大批量容器苗 的整齊快速的生長，縮短育苗期，并能使橘樹終身受益菌根促生效應(yīng)。
[0016] 2.在柑橘容器苗根際聯(lián)合接種AMF與PGPR能夠提高柑橘根系的菌根侵染率，更好 的活化營養(yǎng)土礦質(zhì)營養(yǎng)，促進(jìn)柑橘容器苗對養(yǎng)分和水分的吸收利用，最終減少化學(xué)肥料在 容器育苗中的施用量。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明所用的AMF為根內(nèi)球囊霉i/7irarai/ice>6·)或摩西球囊霉 ffias^eae),分別簡稱為 Ri 和 Gm。
[0018] 本發(fā)明所用的PGPR為膠質(zhì)類芽孢桿菌（)或巨大 芽抱桿菌aze^ateri·)，分別簡稱為Pa和Bm。
[0019] -種聯(lián)合應(yīng)用AMF與PGPR菌劑進(jìn)行柑橘容器菌根苗栽培的方法，包括如下幾個步 驟： 1、制備AMF菌根接種體：選細(xì)河沙、橘園土、草炭按體積比2:1:1混勾，裝布袋經(jīng)121°C 濕熱滅菌2小時2次，中間間隔24小時，放置1~2周后作為AMF菌劑培養(yǎng)基質(zhì)；將含有AMF 孢子的菌劑加入上述培養(yǎng)基質(zhì)中并播種三葉草，在塑料溫室自然光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)3~4 個月后收獲基質(zhì)和根段，保證根段侵染率在70%以上，侵染強(qiáng)度在40%以上；且風(fēng)干后測定 AMF孢子密度，保證每克接種基質(zhì)至少含25個成熟健康孢子。
[0020] 2、制備PGPR菌劑：將濃度為10s CFU/ml的PGPR種子液Iml接種于液體培養(yǎng) 基中，于30攝氏度下180轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)36小時后稀釋至10s CFU/ml，作為標(biāo)準(zhǔn)接種 劑。在此，當(dāng)PGPR為巨大芽孢桿菌時，以上液體培養(yǎng)基含有1. 5%淀粉、0. 5%酵母粉、0. 05% K2HPO4 · 3Η20、0· 05% NaCl、0. 05% MgSO4 · 7H20 和 0· 01% CaCO3,液體培養(yǎng)基的 pH 為 7. 0。當(dāng) PGPR為膠質(zhì)類芽孢桿菌時，所述液體培養(yǎng)基含有0.5%牛肉浸膏、1%蛋白胨、0.1% NaCl、 0· 1% MgSO4 · 7Η20、0· 05% K2HPO4 · 3H20 和 0· 01% CaCO3,液體培養(yǎng)基的 pH 為 7. 0。
[0021] 3、育苗土消毒：將育苗土裝布袋濕熱滅菌2小時2次，消毒除去雜菌，中間間隔24 小時，放置1~2周后作為柑橘容器育苗土；所述育苗土為橘園普通土壤添加堆慪發(fā)酵、充分 腐熟并以體積比7 :3的比例添加菌糠；所述菌糠為金針菇、平菇、杏鮑菇菌糠中的一種或多 種。
[0022] 以上菌糠為糞肥菌糠，其通過清潔菌糠加入稀人畜糞尿充分混勻，用稀泥封頂，堆 體溫度達(dá)到50°C，自然發(fā)酵2個月左右，當(dāng)堆肥溫度低于32°C，達(dá)到黑、爛即可。
[0023] 以上培育土中可添加適量的過磷酸鈣。
[0024] 4.枳種子催芽：選擇上一年4°C沙藏采集優(yōu)質(zhì)飽滿枳種子，用10%雙氧水表面消 毒10分鐘，蒸餾水沖洗數(shù)次后，置于底部鋪有濕潤棉層的托盤中，于27°c電熱恒溫隔水式 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)催芽，待種子萌發(fā)露根后備用。
[0025] 5.播種與接種：在播種前先首先將育苗缽清洗干凈，用0. 1%高錳酸鉀溶液浸泡 30分鐘后晾干備用。將萌發(fā)的枳種子在濃度為10s CFU/ml的PGPR液體培養(yǎng)基中浸泡30 分鐘，而后在育苗缽中裝入消毒育苗土至育苗缽的3/4處，澆透水壓出孔穴，接著將AMF菌 根接種體25-35克撒入孔穴，并以1株/缽將浸泡過的枳種子根系平直的播種于育苗缽孔 穴中，并灌根移入5ml的PGPR菌劑，再覆蓋1-1.5 cm育苗土。
[0026] 播完種的育苗缽放置于溫室培養(yǎng)架上培育柑橘砧木苗，每