本發(fā)明涉及一株簡單芽孢桿菌，具體地，涉及一株具有鈍化重金屬功能的簡單芽孢桿菌及其應用，以及含有該簡單芽孢桿菌的菌劑和一種鈍化重金屬的方法。

背景技術：

我國重金屬污染問題日益突出，成為環(huán)境科學領域關注的熱點問題之一。由于長期的金屬冶煉，礦山開采以及污水灌溉農(nóng)田，導致土壤中富集了大量的重金屬污染物，對耕地土壤質(zhì)量和民生健康安全造成了極大的威脅。據(jù)2014年我國環(huán)境保護部和國土資源部對全國土壤污染情況的調(diào)查結果顯示，部分地區(qū)土壤重金屬污染嚴重，受鎘、砷、鉛、鉻等重金屬污染場地面積近2萬公頃，約占耕地總面積的1/5，其中全國土壤重金屬鎘超標率達7％，污染最為嚴重。

重金屬鎘作為機體生長發(fā)育非必需元素，是對植物、動物及人類毒性最強的重金屬元素之一。重金屬鎘經(jīng)過食物鏈產(chǎn)生生物放大作用，在較高級的生物體中富集起來，然后通過食物等渠道進入人體。當重金屬鎘在人體內(nèi)積累到一定限度，會造成人體急性或慢性中毒，對人體器官特別是腎臟造成很大的危害。

重金屬鎘污染問題亟待解決。目前常用的物理修復法主要有氣相抽提技術和熱脫附技術；化學修復法主要有淋洗技術、固定/穩(wěn)定化技術以及氧化-還原技術；生物修復方法主要有植物修復技術和微生物修復技術。

物理化學方法雖然見效快，但存在二次污染、資金不足等一系列問題；生物修復方法中的植物法是一種環(huán)境友好的修復技術，但其修復周期過長， 無法滿足快速治理的需求。微生物修復技術利用微生物自身及其代謝過程中的產(chǎn)物將重金屬鈍化于環(huán)境中，降低重金屬生物可利用度，對環(huán)境擾動小，相比其它修復技術具有環(huán)境友好的絕對優(yōu)勢，被認為是在重金屬污染方面最具前景的修復技術。

篩選對重金屬具有較強抗性及鈍化能力的菌株，對重金屬的生物鈍化至關重要。雖然目前已報道了較多的鎘抗性菌株，但真正能夠大規(guī)模直接用于鎘污染土壤生物修復的卻不多。

因此，急需開發(fā)一株能夠強力高效降解環(huán)境中的重金屬，尤其是鎘的微生物菌株。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為了克服現(xiàn)有技術修復重金屬污染工程量及能耗大，或者是容易造成二次污染，或者修復周期長的缺陷，提供一株能夠在簡單操作的條件下，無污染的且修復周期短的對重金屬進行鈍化的菌株及其應用。

為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)，其中，所述簡單芽孢桿菌的保藏編號為CGMCC No.10853。

第二方面，本發(fā)明提供了一種菌劑，其中，該菌劑含有如上所述的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)的菌體。

優(yōu)選的，所述菌劑含有所述簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)的死菌體

第三方面，本發(fā)明提供了如上所述的簡單芽孢桿菌和/或如上所述的菌劑在重金屬鈍化中的應用。

優(yōu)選的，所述重金屬為鎘。

第四方面，本發(fā)明提供了一種鈍化重金屬的方法，該方法包括：將如上所述的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)，和/或如上所述的菌劑加入到含有重金屬的環(huán)境中，以對所述重金屬進行鈍化。

優(yōu)選的，所述重金屬為鎘。

本發(fā)明提供的菌株能夠在Cd²⁺濃度高達300mg/L的培養(yǎng)基中生長，濃度低于100mg/L的Cd²⁺對該菌株的生長無明顯影響，表現(xiàn)出了極強的耐鎘特性；該菌株的活菌體和死菌體在水體中對低濃度的Cd²⁺的去除率可分別達70％和90％以上，對300mg/L的高濃度Cd²⁺的去除率可達30％和50％以上；在土相實驗中，該菌株的死菌體、活菌體均能夠有效地將重金屬鎘從可交換態(tài)轉變?yōu)槠渌€(wěn)定形態(tài)，對重金屬鎘具有良好的鈍化效果。并且，采用本發(fā)明的簡單芽孢桿菌對重金屬鈍化，操作簡便，能耗小，不會造成二次污染，并且周期較短，具有較高的經(jīng)濟效益和社會效益。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

生物保藏

本發(fā)明的菌株為簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)，并于2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.10853。

附圖說明

附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌在不同鎘濃度下的水相中的生長曲線。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

第一方面，本發(fā)明提供了一種簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)，其中，所述簡單芽孢桿菌的保藏編號為CGMCC No.10853。

本發(fā)明的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)分離自安徽宣城的煙植土壤。

所述分離的方法可以為本領域常規(guī)的用于新菌株篩選的方法，例如，液相富集法或土壤環(huán)流法。

液相富集法具體可以包括：稱取適量鎘污染土壤樣品加入到裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，加入適量玻璃珠。將三角瓶在28-30℃，150-170rpm下振蕩；將土壤混合液轉入離心管，取離心后的上清液作為鎘鈍化微生物的來源。將所述上清液接種到含有鎘的LB液體培養(yǎng)基中，在28-30℃，150-170rpm下振蕩培養(yǎng)。用無菌吸管吸取1-2mL，移入另一個富集培養(yǎng)三角瓶中。如此轉移三次后，在不同Cd²⁺濃度的LB固體培養(yǎng)基上進行平板劃線，分離單菌落。其中，LB固體培養(yǎng)基中分別含有50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L濃度的Cd²⁺。

土壤環(huán)流法具體可以包括：稱取鎘污染土壤與適量粒徑約為3mm的砂?；旌暇鶆颍糜诃h(huán)流裝置的上層。下層裝入LB培養(yǎng)基作為環(huán)流液。啟動空氣壓縮機，開始馴化過程，期間根據(jù)環(huán)流液的蒸發(fā)情況定期補加環(huán)流液。馴化結束后，取上層土壤和下層環(huán)流液，將馴化后的微生物在不同Cd²⁺濃度的LB固體培養(yǎng)基上進行平板劃線，分離單菌落。其中，LB固體培養(yǎng)基中分別含有50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L濃度的Cd²⁺。

本發(fā)明從篩選出的菌株中獲得了一株對重金屬鎘耐抗性最強的細菌進行了DNA提取與鑒定，鑒定結果顯示，該菌株的16S rDNA序列gb|KM817245.1(如SEQ ID No：1所示)與簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex) 有100％的同源性，可確定為簡單芽孢桿菌簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)，并于2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.10853。

本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌經(jīng)過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量簡單芽孢桿菌的活菌體，所述培養(yǎng)的方法沒有特別的要求，只要是能使所述簡單芽孢桿菌增殖即可，例如可以按照10⁷CFU/mL的接種量將簡單芽孢桿菌的活菌體接種于LB培養(yǎng)基中，并且在好氧條件下，在25-38℃的溫度下培養(yǎng)8-72小時后，得到培養(yǎng)液。

本發(fā)明可以進一步分離上述培養(yǎng)液中的簡單芽孢桿菌的菌體，所述分離的方法沒有特別的限制，只要是能從培養(yǎng)液中富集菌體即可，例如可以通過離心和/或過濾的方法實現(xiàn)，所述離心和所述過濾的條件可以為公知的條件，本發(fā)明在此不再贅述。

第二方面，本發(fā)明提供了一種菌劑，其中，該菌劑含有如上所述的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)的菌體。

本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過程中意外的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的簡單芽孢桿菌的死菌體和活菌體均能夠有效對金屬進行鈍化。因此，如上所述的簡單芽孢桿菌的菌體可以為活菌體，也可為死菌體，還可以為活菌體和死菌體的混合菌體。但更令人驚奇的是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)的死菌體對重金屬的鈍化效果更佳。

根據(jù)本發(fā)明，對于以上死菌體的制備方法沒有特別的限制，例如但不限于，可以通過自然裂解制備，也可以通過熱致死制備。

根據(jù)本發(fā)明，所述菌劑中所述簡單芽孢桿菌的濃度沒有特別的限制，可以根據(jù)具體的情況進行具體的選擇，在此不再詳細贅述。

另外，根據(jù)預定的用途不同，本發(fā)明提供的菌劑可以制備為不同的劑型，并添加相應的賦形劑等成分。其中，在何種劑型的菌劑中添加何種賦形劑為 本領域技術人員所公知，在此不再詳細贅述。

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)是在高Cd²⁺濃度下篩選得到的，但其對土壤中常規(guī)的污染重金屬，例如，鎳、砷、銅、鉛、汞等均有一定的鈍化作用。

基于以上發(fā)現(xiàn)，第三方面，本發(fā)明提供了如上所述的簡單芽孢桿菌和/或如上所述的菌劑在重金屬鈍化中的應用。

本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌對重金屬，例如，鎘、鎳、砷、銅、鉛、汞等均有一定的鈍化作用，但其更適用于對重金屬鎘進行鈍化。

本申請中，術語“鈍化”是指使重金屬固定在污染土壤的表面，降低重金屬的生物有效性，減少植物對其吸收利用，從而達到修復重金屬污染的環(huán)境的目的。

第四方面，本發(fā)明提供了一種鈍化重金屬的方法，該方法包括：將如上所述的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)，和/或如上所述的菌劑加入到含有重金屬的環(huán)境中，以對所述重金屬進行鈍化。

本發(fā)明中的所述重金屬的具體選擇可以為如上所述的，此處不再重復。

根據(jù)本發(fā)明，所述含有重金屬污染的環(huán)境可以包括任何含有重金屬的環(huán)境，例如，所述含有重金屬污染的環(huán)境可以包括含有重金屬，優(yōu)選鎘，的土壤或水體。

根據(jù)本發(fā)明，加入至所述含有重金屬污染的環(huán)境中的簡單芽孢桿菌的形式并沒有特別的限定，只要保證加入后所述簡單芽孢桿菌能夠在所述含有重金屬污染的環(huán)境中起作用并且對所述重金屬有效鈍化即可，加入的所述簡單芽孢桿菌的形式，例如，可以為活菌體，也可以為死菌體，或者可以為菌液或干粉的形式。如上所述的，本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌的死菌體對重金屬的鈍化效果更好，因此，本發(fā)明優(yōu)選加入所述簡單芽孢桿菌的死菌體。

本發(fā)明對加入的簡單芽孢桿菌的量也沒有特別的限制，這可以根據(jù)所述 含有重金屬污染的環(huán)境中的重金屬的含量以及鈍化難易程度來決定，例如，當所述環(huán)境中的重金屬含量較高或較難鈍化時，可以提高所述簡單芽孢桿菌的加入量；當所述環(huán)境中的重金屬含量較低或較易鈍化時，可以減少所述簡單芽孢桿菌的加入量。

另外，當加入到環(huán)境中的為本發(fā)明的簡單芽孢桿菌的活菌體時，還可以向環(huán)境中添加適量的適于所述簡單芽孢桿菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)，例如，LB培養(yǎng)液，或者是無機鹽培養(yǎng)液。所述無機鹽培養(yǎng)液例如可以含有0.1-0.2％的KH₂PO₄，0.1-0.2％的K₂HPO₄，0.05-0.1％的NH₄NO₃，0.05-0.1％的MgSO₄，0.001-0.002％的CaCl₂，0.01-0.02％的FeSO₄·7H2O；pH＝6.8-7.0。其中，各成分含量以重量份計。

根據(jù)本發(fā)明，當所述含有重金屬的環(huán)境為土壤時，為了進一步促進本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌對重金屬的鈍化效率，優(yōu)選的，將土壤中的水含量控制在至少15重量％，更優(yōu)選為18-30重量％。

以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。

以下實施例中：

LB液體培養(yǎng)基：0.8-1％的蛋白胨，0.5-0.8％的酵母粉，1-1.5％的氯化鈉，pH＝6.8-7.0。其中，各成分含量以重量份計。

本發(fā)明的菌株為簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)并于2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.10853。

參比蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，Huang F,Dang Z,Guo C L,et al.Biosorption of Cd(II)by live and dead cells of Bacillus cereus RC-1isolated from cadmium-contaminated soil[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013, 107:11-18。

制備例

將本發(fā)明的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)以及參比的蠟狀芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基中活化2次，所述活化在28-30℃下進行10-12小時，菌體濃度達到10⁹CFU/mL，分別得到活化的本發(fā)明的簡單芽孢桿菌(菌株Cd-w)和活化的參比的蠟狀芽孢桿菌(菌株D)，分別于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例1

本實施例用于說明本發(fā)明的簡單芽孢桿菌鎘對鎘的耐性

將活化的菌株Cd-w接種于LB液體培養(yǎng)基中，28-30℃下培養(yǎng)至10-12h，然后取一定量的菌液(1-2體積％接種量)接入不同鎘濃度(分別為0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L和300mg/L)的液體培養(yǎng)基，28-30℃，150-170rpm振蕩培養(yǎng)，不同時間取樣，用紫外分光光度計測定該菌株在600nm波長處的OD值，以確定其不同鎘濃度下菌體的生長曲線。每個處理設置三個重復。生長曲線見圖1。

由圖1可以看出，Cd²⁺濃度低于100mg/L時，該菌株可正常生長，生長曲線未受到影響，在Cd²⁺濃度高達300mg/L時，該菌株的最大OD600值仍可達到4.66±0.24，表現(xiàn)出了該菌株對極端環(huán)境的適應性和對重金屬鎘極強的耐受能力。

對比例1

本實施例用于說明參比的蠟狀芽孢桿菌鎘對鎘的耐性

按照實施例1的方法對菌株D的耐鎘特性進行測試。結果顯示，該菌株D只能夠在300mg/L的Cd²⁺濃度下的OD值最高只能夠達到2.31。并且Cd²⁺ 濃度為100mg/L時，已經(jīng)影響了該蠟狀芽孢桿菌的生長。

實施例2

本實施例用于說明本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌鎘對鎘的鈍化性能

(1)在水體中

將活化的菌株Cd-w按1-2體積％的接種量接種于液體LB培養(yǎng)基中，28-30℃，150-170rpm下振蕩培養(yǎng)16-18h。其中，

一組菌體細胞先115-121℃下進行滅活處理15-20min，然后6000-8000rpm低溫離心15-20min，收集死菌體，以作死細胞鈍化劑。

另一組菌體細胞直接6000-8000rpm低溫離心15-20min，收集活菌體，并用無菌水洗滌2-3次，以作活細胞鈍化劑。

將兩組細胞分別以0.1g/L的量加入到含鎘(0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L)水溶液中進行吸附實驗，處理3天后測定水體中的Cd²⁺濃度。結果見表1。

其中，鎘含量的檢測方式為：取適量處理后的水體，8000rpm離心5min，取上清液，用ICP-AES檢測上清液中Cd²⁺濃度。

(2)在土壤中

按照(1)中方法制備死、活細胞鈍化劑，分別將兩種鈍化劑以1g/L的量加入到含重金屬鎘的過篩風干土壤中，攪拌均勻，20-24℃下鈍化10d，期間保持含水量為20-30％。鈍化完成后，用BCR連續(xù)提取法提取土壤中各形態(tài)的重金屬鎘，結果見表2。步驟如下：

1.可交換態(tài)：準確稱取通過100目篩的風干土壤樣品1g，加40mL 0.1mol/L的HAc，放在恒溫振蕩器中24±1℃下連續(xù)振蕩16h，然后3000-5000rpm下離心15-20min。取上清液，用ICP-AES測定Cd²⁺含量。

2.可還原態(tài)：加入無菌水清1中的洗殘余物，振蕩20-30min，離心，棄去清洗液。向殘渣中加入40mL 0.5mol/L的鹽酸羥胺，放在恒溫振蕩器中22-24℃下連續(xù)振蕩15-16h，然后3000-5000rpm下離心15-20min。其余步驟同1。

3.可氧化態(tài)：向2的殘渣中加入10mL H₂O₂，攪拌均勻，室溫下靜置1h左右后用水浴加熱保持80-85℃1h左右，再加入10mL H₂O₂，在恒溫水浴箱中加熱保持80-85℃1h左右。冷卻后，加入50mL 1mol/L的NH₄Ac，放在恒溫振動器中22-24℃下連續(xù)震蕩16h，然后3000-5000rpm下離心15-20min。其余步驟同1。

4.殘余態(tài)：向3的殘渣中加入10mL HNO₃，使酸和樣品充分混合均勻。進行微波消解，用ICP-AES測定Cd²⁺含量。

對比例2-1

本對比例用于說明參比的菌種對鎘的鈍化性能

按照實施例2中的方法對水體和土壤中鎘進行鈍化，不同的是，所使用的菌株為菌株D。水中對鎘的鈍化性能結果見表1，土壤中對鎘的鈍化性能結果見表2。

對比例2-2

本對比例用于說明自然狀態(tài)下鎘的鈍化性能

按照實施例2中的方法對水體中和土壤中的鎘進行測試，不同的是，不加入任何菌株。水中對鎘的鈍化性能結果見表1，土壤中對鎘的鈍化性能結果見表2。

表1

由表1可以看出，本發(fā)明的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)死細胞對水體中重金屬鎘的鈍化效果要優(yōu)于活細胞，但二者菌對重金屬鎘具有較大的鈍化量。并且本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)對重金屬鎘的鈍化效果要明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術中的同屬的蠟狀芽孢桿菌對重金屬鎘的鈍化效果。

表2

由表2可以看出，本發(fā)明的簡單芽孢桿菌的死、活細胞鈍化劑均能夠有效地將可交換態(tài)的鎘轉化成為更穩(wěn)定的可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)。并且，死細胞鈍化劑的效果優(yōu)于活細胞鈍化劑，這與水體鈍化結果相一致。并且本發(fā)明提供的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)對重金屬鎘的鈍化效果要明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術中的同屬的蠟狀芽孢桿菌對重金屬鎘的鈍化效果。

同樣的，本發(fā)明的菌種對土壤或水體中鎳、砷、銅、鉛、汞均有一定的的鈍化效果。

以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。