本發(fā)明涉及重金屬汞污染的生物修復(fù)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種陰溝腸桿菌、含有該菌的菌劑及其應(yīng)用和一種鈍化汞的方法。
背景技術(shù)：
：汞(Hg)，又稱(chēng)水銀，熔點(diǎn)僅有-38.87℃，是常溫下唯一呈現(xiàn)液態(tài)并容易流動(dòng)的金屬。汞及其化合物是非常重要的工業(yè)原料，通常被用作催化劑或者原材料，大規(guī)模被應(yīng)用于化工、油漆、制藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)。由于汞的大量使用，由人類(lèi)活動(dòng)造成的全球汞含量持續(xù)增加?！度蚬癄顩r評(píng)估》指出，自工業(yè)革命以來(lái)，汞在全球的大氣、水和土壤環(huán)境中的含量增加了近三倍。每年全球約6500噸汞釋放到環(huán)境中，汞進(jìn)入環(huán)境后不斷遷移，威脅到整體生態(tài)環(huán)境安全。工業(yè)造成的含汞化合物廢水排放成為最大污染源，農(nóng)藥等僅居其次，含汞的殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、防腐劑和選種劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用對(duì)土壤造成嚴(yán)重污染。土壤對(duì)汞具有強(qiáng)烈地吸附作用，95％以上的汞進(jìn)入土壤后會(huì)被迅速吸附或者固定，并在表層積累并不斷遷移，對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育影響極大，并可導(dǎo)致生物體基因突變，隨遷移過(guò)程，水體、大氣環(huán)境都受到嚴(yán)重威脅。目前汞污染治理方法主要有化學(xué)沉淀法、活性炭吸附法、金屬還原法、離子交換法、電解法和膜技術(shù)分離法。這些方法主要集中并應(yīng)用于含汞廢水的治理，操作繁瑣且運(yùn)行費(fèi)用較高，能耗大且易造成二次污染，而且并不能滿(mǎn)足汞污染土壤修復(fù)的要求。因此，綠色鈍化土壤中的汞是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可忽視的問(wèn)題，篩選出一株高效汞鈍化菌株是當(dāng)前的主要任務(wù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服汞污染生物修復(fù)中存在的上述缺陷，提供一種陰溝腸桿菌、含有該菌的菌劑及其應(yīng)用和一種鈍化汞的方法。本發(fā)明的陰溝腸桿菌，具有較高的汞鈍化能力，可耐受較高濃度的汞污染，操作簡(jiǎn)便，可在汞污染的土壤或含汞廢水的生物修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量的篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果篩選到一種具有較高的汞鈍化能力、可耐受較高濃度的汞污染的陰溝腸桿菌。因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，該陰溝腸桿菌的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850。第二方面，本發(fā)明提供了一種含有上述陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)的菌劑。第三方面，本發(fā)明提供了上述陰溝腸桿菌和/或菌劑在鈍化汞中的應(yīng)用。第四方面，本發(fā)明提供了一種鈍化汞的方法，所述方法包括：將上述陰溝腸桿菌和/或上述菌劑與汞污染樣品接觸，以對(duì)汞污染樣品中的汞進(jìn)行鈍化。本發(fā)明的陰溝腸桿菌為重金屬汞高效鈍化菌株，對(duì)汞具有高耐受性與降解能力，可在較高汞含量下快速生長(zhǎng)，能夠有效降低汞在水相或土壤相中的生物可利用度，達(dá)到快速鈍化效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的陰溝腸桿菌能夠高效鈍化土壤相或水相中的汞，降解率高達(dá)85.5％，可耐受較高濃度的汞污染(最大汞耐受量高達(dá)30mg/L)，操作簡(jiǎn)便，可在汞污染的土壤或含汞廢水的生物修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，實(shí)現(xiàn)環(huán)保綠色修復(fù)的目的，經(jīng)濟(jì)高效，操作簡(jiǎn)單，環(huán)境友好。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。附圖說(shuō)明圖1為不同Hg2+濃度下菌株的生長(zhǎng)狀況圖。生物保藏本發(fā)明的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，于2015年5月22日被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫(xiě)為CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC：10850。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。第一方面，本發(fā)明提供了一種陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，該陰溝腸桿菌的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850。本發(fā)明的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌，為革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科腸桿菌屬陰溝腸桿菌。該菌株來(lái)源于安徽宣城汞污染土壤，采用土壤環(huán)流方式篩選并通過(guò)稀釋平板方法分離純化得到。生物學(xué)特性為：粗短桿狀、周生鞭毛、可分泌大量胞外分泌物；革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)陰性，明膠液化試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，可利用甘露糖。其中，本發(fā)明的陰溝腸桿菌的分離過(guò)程可以包括：將100g土壤與適量粒徑約為3mm的砂?；旌暇鶆?，置于環(huán)流富集裝置的上層，200mlLB培養(yǎng)基作為環(huán)流液置于下層。啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，富集過(guò)程中根據(jù)環(huán)流液的蒸發(fā)情況定期補(bǔ)加環(huán)流液。富集結(jié)束后，取上層土壤與下層環(huán)流液，并將上清液分別稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取適量涂布于含有5、15、30、50、70mg/LHg2+的LB固體培養(yǎng)基上，25-30℃培養(yǎng)3天后取菌株進(jìn)行 平板劃線(xiàn)，分離單菌落。本發(fā)明從篩選出的菌株中獲得了一株對(duì)重金屬汞耐抗性最強(qiáng)的菌株P(guān)7，對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化鑒定分析，其生物學(xué)特性為：粗短桿狀、周生鞭毛、可分泌大量胞外分泌物；革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)陰性，明膠液化試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，可利用甘露糖。同時(shí)，根據(jù)天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANampbacteriaDNAkit)步驟提取該菌株的DNA，進(jìn)行16SrDNA基因序列分析，其16srDNA基因序列如SEQIDNO.1所示，結(jié)果表明該菌為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。將該陰溝腸桿菌保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO：10850。本發(fā)明提供的陰溝腸桿菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量陰溝腸桿菌的活菌體，所述培養(yǎng)的方法沒(méi)有特別的要求，只要是能使所述陰溝腸桿菌增殖即可，例如，可以按照107CFU/mL的接種量將陰溝腸桿菌的活菌體接種于LB培養(yǎng)基中，在25-38℃的溫度下培養(yǎng)12-48小時(shí)后，得到培養(yǎng)液。本發(fā)明中，對(duì)于陰溝腸桿菌的培養(yǎng)條件沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種培養(yǎng)條件，例如，培養(yǎng)時(shí)所用的LB液體培養(yǎng)基的組成可以為：0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化鈉，pH＝6.8-7.0。固體LB培養(yǎng)基中還含有2.5-3.0重量％的瓊脂。培養(yǎng)時(shí)所用的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成可以為：0.8-1.2重量％KH2PO4，0.8-1.2重量％K2HPO4，1-1.5重量％NH4NO3，0.03-0.08重量％MgSO4，0.001-0.003重量％CaCl2，0.01-0.03重量％FeSO4·7H2O，pH＝6.0-7.5。本發(fā)明可以進(jìn)一步分離上述培養(yǎng)液中的陰溝腸桿菌的活菌體，所述分離的方法沒(méi)有特別的限制，只要是能從培養(yǎng)液中富集菌體即可，例如可以通過(guò)離心和/或過(guò)濾的方法實(shí)現(xiàn)，所述離心和所述過(guò)濾的條件可以為公知的條件，本發(fā)明在此不再贅述。本發(fā)明還可以進(jìn)一步從陰溝腸桿菌的活菌體中得到細(xì)胞內(nèi)提取物，對(duì)于得到細(xì)胞內(nèi)提取物的方法沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可以為在冰浴條件下對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎，離心取上清。第二方面，本發(fā)明提供了含有保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)的菌劑。本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過(guò)程中意外的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的陰溝腸桿菌的死菌體和活菌體均能夠有效對(duì)重金屬汞進(jìn)行鈍化。因此，如上所述的陰溝腸桿菌的菌體可以為活菌體，也可以為死菌體，還可以為活菌體和死菌體的混合菌體，即菌劑含有所述陰溝腸桿菌的死菌體和/或活菌體。但更令人驚奇的是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的陰溝腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)提取物，對(duì)重金屬汞的鈍化效果更佳，因此，優(yōu)選情況下，菌劑含有所述陰溝腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)提取物。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于以上死菌體的制備方法沒(méi)有特別的限制，例如但不限于，可以通過(guò)自然裂解制備，也可以通過(guò)熱致死制備，還可以通過(guò)冰浴條件下超聲破碎制備，其中以冰浴條件下超聲破碎制備效果最優(yōu)。對(duì)于得到細(xì)胞內(nèi)提取物的方法沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可以為在冰浴條件下對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎，離心取上清。本發(fā)明中，對(duì)菌劑中所述陰溝腸桿菌的濃度或細(xì)胞內(nèi)提取物的量沒(méi)有特別的限定，可以根據(jù)具體的情況進(jìn)行具體的選擇，在此不再詳細(xì)贅述。另外，根據(jù)預(yù)定的用途不同，本發(fā)明提供的菌劑可以制備為不同的劑型，并添加相應(yīng)的賦形劑等成分。其中，在何種劑型的菌劑中添加何種賦形劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再詳細(xì)贅述。第三方面，本發(fā)明提供了上述陰溝腸桿菌和/或菌劑在鈍化汞中的應(yīng)用。優(yōu)選情況下，汞源為汞污染的土壤或含汞廢水。本發(fā)明中，“鈍化汞”是指降低汞污染樣品中重金屬汞(Hg2+)的含量 及其生物有效性，從而達(dá)到修復(fù)重金屬汞污染的環(huán)境的目的。第四方面，本發(fā)明提供了一種鈍化汞的方法，該方法包括：將保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌和/或含有保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌的菌劑與汞污染樣品接觸，以對(duì)汞污染樣品中的汞進(jìn)行鈍化。本發(fā)明方法中，對(duì)于接觸的方法沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種的方法，例如可以在汞污染樣品中加入保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌和/或含有保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌的菌劑，混合均勻。優(yōu)選情況下，所述樣品為土壤或含汞廢水。本發(fā)明方法中，對(duì)于加入至汞污染樣品中的陰溝腸桿菌的形式并沒(méi)有特別的限定，只要保證加入后所述陰溝腸桿菌能夠在所述汞污染樣品中起作用并且對(duì)重金屬汞有效鈍化即可，加入的所述陰溝腸桿菌的形式，例如，可以為培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌體或菌液，也可以為冷凍干燥后的菌體干粉，還可以為其細(xì)胞內(nèi)提取物。本發(fā)明對(duì)加入的陰溝腸桿菌的數(shù)量和菌劑的量也沒(méi)有特別的限制，這可以根據(jù)所述汞污染樣品中的汞的含量以及鈍化難易程度來(lái)決定，例如，當(dāng)所述樣品中的汞含量較高或較難鈍化或?qū)τ谒鲫帨夏c桿菌的生存較不利時(shí)，可以提高所述陰溝腸桿菌的接種量和菌劑的加入量；當(dāng)所述樣品中的汞含量較低或較易鈍化或?qū)λ鲫帨夏c桿菌的生存的影響較小時(shí)，可以減少所述陰溝腸桿菌的接種量和菌劑的加入量。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)汞污染樣品為土壤時(shí)，為了進(jìn)一步促進(jìn)本發(fā)明提供的陰溝腸桿菌對(duì)汞的鈍化效率，優(yōu)選的，將土壤中的水含量控制在至少15重量％，更優(yōu)選為18-30重量％。實(shí)施例以下將通過(guò)實(shí)施例和對(duì)比例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但并不因此限制本 發(fā)明。以下實(shí)施例和對(duì)比例中的實(shí)驗(yàn)方法中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例和對(duì)比例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到。汞降解率＝(處理前Hg2+含量-處理后Hg2+含量)/處理前Hg2+含量×100％。冷原子吸收汞分析儀購(gòu)自北京利曼科技有限公司，型號(hào)為HydraAAAuto。制備例將本發(fā)明的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中活化2次，每次活化均在170rpm、30±1℃下進(jìn)行12小時(shí)，得到菌液，將得到的菌液以3體積％的接種量接種于300mlLB液體培養(yǎng)基中，在170rpm、30±1℃的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，4h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20h到達(dá)穩(wěn)定期，菌濃度OD600約為1.4。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌在水相中對(duì)汞的耐受性及鈍化能力在200ml的LB液體培養(yǎng)基中加入1體積％的制備例得到的菌液，并加入一定量的HgCl2，使其最終濃度分別為5mg/L、15mg/L、30mg/L和50mg/L。在恒溫振蕩器中30℃、170rpm下培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間段取樣測(cè)定菌濃度OD600、用冷原子吸收汞分析儀測(cè)定汞剩余量并計(jì)算汞降解率。48h時(shí)不同Hg2+濃度下汞去除率的結(jié)果如表1所示，不同Hg2+濃度下菌株的生長(zhǎng)狀況如圖1所示。由表1可知，48h時(shí)，Hg2+濃度為30mg/L時(shí)達(dá)到最大降 解率85.5％；由圖1可知，本發(fā)明的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌的最大汞耐受濃度高達(dá)30mg/L，高于此濃度此菌生長(zhǎng)受到抑制。表明本發(fā)明的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌能夠耐受高達(dá)30mg/L濃度的汞污染，而且還有高達(dá)85.5％的汞降解能力。表1濃度(mg/L)汞去除率(％)581.21583.13085.55060.1實(shí)施例2本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌在土壤中對(duì)汞的鈍化效果將100mlLB液體培養(yǎng)基在121℃下滅菌15min，然后接入1體積％的制備例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培養(yǎng)12h。將前述菌液加入到1kg汞污染土壤(Hg2+含量為25mg/kg)中，并添加無(wú)菌去離子水，混合均勻，培養(yǎng)15天，并保證每天土壤的含水量為20％。15天后，取土壤樣品在40℃下烘干，研磨呈均勻粉末狀，采用冷原子吸收汞分析儀測(cè)定最終汞剩余量。結(jié)果顯示，土壤中Hg2+由最初的25mg/kg降至5.47mg/kg，表明該菌株在土壤中能對(duì)Hg2+產(chǎn)生較強(qiáng)的降解作用，從而降低汞對(duì)土壤的危害性。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的保藏號(hào)為CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌在水相中不同形態(tài)對(duì)汞的鈍化效果將100mlLB液體培養(yǎng)基在121℃下滅菌15min，然后接入1體積％的制備例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培養(yǎng)12h。將菌液平均分成2份，一份4℃離心取上清，即為上清樣品；另一份121℃滅菌15min，然后將菌液4℃離心取上清，即為高溫滅菌樣品。用10mmol/LTris-HCI緩沖液(pH7.0)洗滌與上清樣品對(duì)應(yīng)的離心得到的菌體2次后重懸，然后在冰浴條件下超聲破碎，超聲頻率為25KHz，超聲時(shí)間為20min，4℃離心取上清，即為細(xì)胞內(nèi)提取物樣品。3份樣品分別加入一定量的HgCl2使Hg2+濃度為30mg/L。24h后離心并測(cè)定上清液中的Hg2+濃度，二價(jià)汞去除率結(jié)果如表2所示。表2項(xiàng)目Hg2+去除率上清樣品23.6％高溫滅菌樣品12.9％細(xì)胞內(nèi)提取物樣品88.3％由表2可以看出，細(xì)胞內(nèi)提取物樣品對(duì)Hg2+去除率高達(dá)88.3％，遠(yuǎn)高于上清樣品和高溫滅菌樣品，表明本發(fā)明的CGMCCNO：10850的陰溝腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)提取物樣品能夠更有效的鈍化汞。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說(shuō)明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3