本發(fā)明屬于藥學(xué)微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株，本發(fā)明還涉及該真菌菌株的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默病又稱老年癡呆癥(Alzheimer’sdisease，AD)是一種以進行性癡呆為主要特征的神經(jīng)元退變性疾病，主要表現(xiàn)為進行性認(rèn)知功能障礙、性格和行為改變、記憶力衰退等，導(dǎo)致患者在患病后7-10年間死亡。據(jù)國際阿爾茨海默病協(xié)會估算，2010年全世界約有3600萬癡呆患者，預(yù)計到2050年AD患病人數(shù)將達到1.15億。血管性癡呆(Vasculardementia，VD)是由各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的一種獲得性智能損害綜合癥，主要以腦缺血缺氧性或出血性腦損傷造成的病理組織學(xué)損傷為主，臨床表現(xiàn)為智能障礙包括認(rèn)知能力、記憶力、判斷和思維能力、計算能力和社會生活能力的減退，伴隨著情感、性格的改變。VD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)的第二大癡呆疾病。我國是腦血管病高發(fā)區(qū)，VD發(fā)病率也相對較高。目前乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物在AD和VD藥物市場上處于主導(dǎo)地位。石杉堿甲為從民間草藥蛇足石杉中分離獲得的新型石松類單體生物堿，是一種強效的可逆性的膽堿酯酶抑制劑，具有多靶點作用，對乙酰膽堿酯酶的抑制作用為毒扁豆堿的3倍、加蘭他敏的30倍，而且外周不良反應(yīng)低，是治療AD和VD臨床優(yōu)選藥物之一。源于天然植物的藥物開發(fā)歷史悠久且富有生命力，植物提取獲得石杉堿甲為最簡便方式，但天然蛇足石杉資源稀缺、生長周期長，且石杉堿甲在植株中含量甚微，僅靠天然植株提取遠遠滿足不了臨床需求；化學(xué)合成生產(chǎn)石杉堿甲仍是研發(fā)重要途徑之一，但化學(xué)合成工藝繁瑣、成本高，加之副產(chǎn)物多、純化困難，在臨床應(yīng)用中具有潛在毒性。因此利用從野生蛇足石杉內(nèi)生真菌中篩選分離具有產(chǎn)石杉堿甲能力的菌株對于治療AD和VD及保護植物資源意義重大。雖然目前國內(nèi)外已有對產(chǎn)石杉堿甲菌株進行開發(fā)和研究，但尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)具備產(chǎn)石杉堿甲功能卻鮮有報道。對已獲得的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)NSG-1株可通過生物技術(shù)改造菌株為石杉堿甲工業(yè)化生產(chǎn)提供新的菌種資源。同時，通過對其菌株產(chǎn)石杉堿甲機理的研究，構(gòu)建新的轉(zhuǎn)基因生物，使其獲得更優(yōu)良穩(wěn)定的產(chǎn)石杉堿甲性狀和能力。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株，解決植物提取獲得石杉堿甲面臨植物資源匱乏瓶頸；以及化學(xué)合成步驟繁瑣、代價昂貴，很難獲得純光學(xué)活性的合成物的問題。本發(fā)明的另一個目的是提供一種發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株，該菌株為從野生蛇足石杉(Huperziaserrata石杉科，石杉屬)內(nèi)生真菌中分離獲得，屬于鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)種NSG-1株，在實驗室傳代20代后具有遺傳穩(wěn)定性，其氨基序列如SEQIDNO：1所示。本發(fā)明的特點還在于，該真菌菌株高效表達石杉堿甲培養(yǎng)條件為：(1)培養(yǎng)基：采用PDA液體培養(yǎng)基，具體配方為：馬鈴薯300g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml；(2)培養(yǎng)條件：26℃，220r/min；(3)裝液量：250ml錐形瓶，裝液量為100ml；(4)培養(yǎng)時間：7-9天。該真菌菌株高效穩(wěn)定表達石杉堿甲時，該菌株的實驗室保存條件為：(1)菌株每次在PDA固體斜面?zhèn)鞔?，生長時間為60h；(2)保存菌種條件為4℃，12h后在將其放置-25℃冰箱中進行保存。本發(fā)明所采用的另一個技術(shù)方案是，一種發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株在生物合成制藥方面的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的第三個技術(shù)方案是，一種發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株的應(yīng)用，通過轉(zhuǎn)基因、誘變育種對真菌菌株進行基因改造，以獲得表達效率更高、遺傳穩(wěn)定性更好的系列菌株；但基因改造的技術(shù)手段并不限于此，也可以采用其他的生物技術(shù)進行基因改造方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株，作為治療AD和VD的生物菌株，將其優(yōu)良的產(chǎn)石杉堿甲高效表達基因轉(zhuǎn)入其他模式菌株中，通過基因改造獲得更多的優(yōu)良性狀，此外還可通過誘變育種達到菌株的進一步優(yōu)化。對其研究將會為生物合成工業(yè)化生產(chǎn)石杉堿甲，保護植物資源、解決臨床一線用藥需求、降低治療AD和VD醫(yī)藥費用有著巨大意義。附圖說明圖1為石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖；圖2為本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株高效液相色譜圖；圖3為本發(fā)明真菌菌株與標(biāo)準(zhǔn)品混合物高效液相色譜圖；圖4為瓊脂糖凝膠電泳檢測本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株中所抽提DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖，圖中，a為菌株檢測區(qū)，b為Marker對照區(qū)；圖5為本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株顯微鏡圖，圖中，a為菌株光學(xué)顯微鏡圖，b為菌株掃描電鏡圖；圖6為本發(fā)明真菌菌株與其他菌屬成員之間的進化分析(基于ITS序列分析)。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株，該菌株為從野生蛇足石杉(Huperziaserrata石杉科，石杉屬)內(nèi)生真菌中分離獲得，屬于鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)種NSG-1株，在實驗室傳代20代后具有遺傳穩(wěn)定性，其氨基序列如SEQIDNO：1所示。該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國普通微生物菌種保藏中心保藏。(一)本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株的分離方法如下：將新鮮蛇足石杉植株用自來水沖洗后，先用75％酒精進行表面消毒30s，無菌水沖洗4次，接著用10％NaClO浸泡5min，無菌水沖洗4次，最后再用75％乙醇表面消毒30s，無菌水沖洗4次后，用無菌刀片將莖切成0.5cm大小，葉片切成0.3cm×0.3cm小塊，接種到含有15μg/ml鏈霉素和1mg/ml脫氧膽酸鈉的PDA固體培養(yǎng)基上，倒置于28℃培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)。為了檢驗上述表面消毒是否徹底，同時把在消毒過程中最后一次沖洗組織塊的無菌水涂布在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。2～3d后，無菌操作法挑取在莖段和葉片切口上所長出的菌絲，平板劃線法轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA平板上，重復(fù)上述操作直到得到純化的內(nèi)生真菌為止。(二)發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株發(fā)酵液制備：將分離得到的純化內(nèi)生菌分別接入裝有100mlPDA培養(yǎng)基的250ml錐形瓶(每個菌株接3瓶)，置于搖床上，26℃、220r/min振蕩培養(yǎng)8d。設(shè)置3個重復(fù)。內(nèi)生真菌在振蕩培養(yǎng)8d后，發(fā)酵液于10000r/min離心15min。(三)發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株產(chǎn)物分析測定：取發(fā)酵液離心后的上清液50ml，采用氯仿和乙醚提取方法提取石杉堿甲，用甲醇定容到5ml，用高效液相法測定發(fā)酵上清液產(chǎn)石杉堿甲的含量。高效液相(HPLC)色譜柱為AgilentCl8柱(4.60mm×250mm，5μm)；色譜條件為：流動相為甲醇-0.1％甲酸(75：25)；流量1.0ml/min；柱溫25℃，進樣量20μl；檢測波長310nm。以石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品作對照。精密稱取石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品20mg，溶于20mL蒸餾水中，再依次制備成0.05，0.025，0.0125，0.006，0.003mg/ml質(zhì)量濃度，分別進樣20μl。每次5次重復(fù)，以確定精密度良好。以峰面積與對應(yīng)石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。通過線性回歸方程計算分離獲得產(chǎn)石杉堿甲菌株代謝產(chǎn)物含量。結(jié)果表明石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品出峰時9.819min，峰面積為141.393(圖1)，線性回歸方程為y＝－16.40713+1059.60431x，R＝0.99758。菌株NSG-1發(fā)酵液提取物出峰時間9.962min，峰面積14.5562(圖2)，二者出峰時間接近，當(dāng)向菌株NSG-1發(fā)酵液提取物中添加標(biāo)準(zhǔn)品后HPLC出峰時間重疊，出峰時間9.948min，峰面積83.9416(圖3)，結(jié)果表明NSG-1發(fā)酵液提取液中存在石杉堿甲，發(fā)酵液中產(chǎn)石杉堿甲含量為1.11mg/100ml。(四)發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株分子生物學(xué)鑒定：1.基因組DNA提取按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進行。1)取50-100mg新鮮真菌或菌絲用液氮研磨成粉末，加入1.5ml離心管中。加入200μlBufferDigestion和2μlβ-巰基乙醇，再加入20μlProteinaseK溶液，震蕩混勻。56℃水浴1h質(zhì)細胞完全裂解。2)加入100μlBufferPF，充分顛倒混勻，-20℃冰箱放置5min。3)室溫10000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。4)加入200μlBufferBD，充分顛倒混勻。5)加入200μl無水乙醇，充分顛倒混勻。6)將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，再10000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液。7)將吸附柱放回收集管，加入500μlPWSolution，10000rpm離心30s倒掉收集管中的廢液。8)將吸附柱放回收集管，加入500μlWashSolution，10000rpm離心30s倒掉收集管中的廢液。9)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm離心2min，離去殘留的WashSolution。10)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50μlTEBuffer靜置3min，12000rpm室溫離心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即進行下一步實驗。2.PCR擴增2.1真菌菌種鑒定通用引物：2.2PCR反應(yīng)體系：試劑體積(μl)Template(基因組DNA20-50ng/μl)0.510×Buffer(withMg2+)2.5dNTP(各2.5mM)1.0酶0.2F(10uM)0.5R(10uM)0.5加雙蒸H2O至252.3PCR循環(huán)條件3.凝膠電泳電泳條件：1％瓊脂糖電泳，150V、100mA、20min，電泳方向從上往下，Marker條帶組成：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp，3500bp，4000bp，5000bp，6000bp，8000bp，10000bp，其中500bp，1000bp，3000bp條帶加亮。電泳PCR產(chǎn)物結(jié)果(圖4，a)，Marker條帶堿基對大小(圖4，b圖)，其中，圖中a帶為菌株NSG-1檢測區(qū)，b帶為Marker檢測區(qū)。結(jié)果顯示：目的檢測NSG-1菌株DNA擴增條帶經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測定大小為1200-1500bp，且上下無雜帶。4.PCR產(chǎn)物結(jié)果鑒定，委托生工生物工程(上海股份有限公司)進行測序。根據(jù)blast結(jié)果，菌株NSG-1與Fusariumoxysporum親源關(guān)系最近。本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株具有下述特征：1.鏡下形態(tài)特征如圖5所示，大型分生孢子呈鐮刀狀，厚垣孢子尖生或頂生，球形(圖5a)，小型分生孢子著生于單生孢子梗頂端聚成球團，單胞，卵圓形，少許彎曲(圖5b)。2.在真菌用PDA培養(yǎng)基上的特征：菌絲發(fā)達，生長速度較快，培養(yǎng)4天后直徑約為3.5cm，6天直徑約為6.0cm，菌落正表面較松外圍呈白色至淺粉色的絮狀，中心呈紅褐色絮狀，背面成棕褐色。3.該真菌菌株高效表達石杉堿甲的培養(yǎng)條件為：(1)培養(yǎng)基：采用PDA液體培養(yǎng)基。具體配方為：馬鈴薯300g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml。(2)培養(yǎng)條件：26℃，220r/min。(3)裝液量：250ml錐形瓶，裝液量為100ml。(4)培養(yǎng)時間：8天。本發(fā)明的NSG-1株為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)種、鐮刀菌屬真菌，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)提取代謝產(chǎn)物，可獲得較高產(chǎn)量石杉堿甲。本發(fā)明真菌菌株的ITS與同屬的相同種的比對結(jié)果及進化樹(如圖6)：經(jīng)鑒定和進化樹分析本發(fā)明真菌菌株歸屬于尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)種，命名為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)種NSG-1株。該屬鮮有報道具有產(chǎn)石杉堿甲能力。通過對其機理研究，可以進一步加深菌株產(chǎn)石杉堿甲中高效表達基因的研究，從而構(gòu)建新的轉(zhuǎn)基因生物，使其獲得更高效的表達。鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)種NSG-1株作為一種新的產(chǎn)石杉堿甲菌株，將為生物合成途徑合成石杉堿甲提供新的菌種資源。序列表<110>西安醫(yī)學(xué)院<120>一種發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于治療癡呆癥的真菌菌株及其應(yīng)用<130>無<160>3<170>PatentInversion3.3<210>SEQIDNO:1<211>1301<212>DNA<213>尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）<400>1tacagcgaaactgcgaatggctcattatataagttatcgtttatttgatagtaccttact60acttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaatcccgacttcggaagg120gatgtatttattagattaaaaaccaatgccctccggggctcactggtgattcatgataac180tcctcgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttcttccctatcaact240ttcgatgtttgggtattggccaaacatggttgcaacgggtaacggagggttagggctcga300ccccggagaaggagcctgagaaacggctactacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaa360ttacccaatcccgactcggggaggtagtgacaataaatactgatacagggctcttttggg420tcttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagt480ctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgtggtt540aaaaagctcgtagttgaaccttgggcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgtactgg600tccggccgggcctttccctctgtggaaccccatgcccttcactgggtgtggcggggaaac660aggacttttactgtgaaaaaattagagtgctccaggcaggcctatgctcgaatacattag720catggaataatagaataggacgtgtggttctattttgttggtttctaggaccgccgtaat780gattaatagggacagtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttggatt840tattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaggaacga900aagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgac960tagggatcggacgatgttatattttgactcgttcggcaccttacgagaaatcaaagtgct1020tgggctccagggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcac1080caccaggggtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccag1140acacaatgaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatgg1200ccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaac1260ctgctaaatagcccgtattgctttggcagtacgctggcttc1301當(dāng)前第1頁1 2 3