本發(fā)明屬于食用菌菌種育種領域，特別涉及一種食用菌菌種的單克隆高效選育方法。

背景技術：

改革開放以來，我國食用菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計顯示，1978年我國食用菌產(chǎn)量不足10萬噸，產(chǎn)值不足1億元；1990年總產(chǎn)量突破100萬噸，達到108.3萬噸，占世界總產(chǎn)量的28.8％；2012年，我國食用菌產(chǎn)地已經(jīng)擴大到全國幾乎所有的省市自治區(qū)，其中產(chǎn)值千萬元以上的縣超過了500個，產(chǎn)值過億的縣達到100多個，各類食用菌專業(yè)合作社超過4千家，食用菌從業(yè)人員突破2000萬人，食用菌總產(chǎn)量達到2828萬噸，產(chǎn)值1722億元。參照國家統(tǒng)計局相關數(shù)據(jù)，食用菌總產(chǎn)量在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中的地位進一步提升，僅次于菜、糧、果、油，位居第五位。當前，食用菌產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國很多地方的“再就業(yè)工程”“奔小康工程”“富民強縣工程”的首選項目。

食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需要大量的菌種，菌種做為重要的生產(chǎn)資料，對產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起著至關重要的作用，但是由于菌種長期處于無性繼代培養(yǎng)，受培養(yǎng)代數(shù)、保藏條件、不良環(huán)境因素以及多年形成的分散生產(chǎn)方式，菌種生產(chǎn)缺乏規(guī)范等影響，菌種生產(chǎn)和質量出現(xiàn)這樣或那樣的問題。而且我國食用菌菌種混亂情況日趨嚴重,同種異名、異種同名現(xiàn)象普遍存在,既極大地損害了育種者和廣大菇農(nóng)的利益,也加速了我國食用菌生產(chǎn)菌種退化的速度。70年代推出的新菌種，一般可使用10-15年左右，而現(xiàn)在育出的新菌種3-5年便出現(xiàn)退化。隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展，菌種問題日益突出，成為阻礙食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一，甚至成為主產(chǎn)區(qū)社會不安定因素。選育優(yōu)良的食用菌菌種是解決食用菌菌種問題的根本方法。

食用菌菌種的選育備受科研人員重視，但研究工作多集中在食用菌菌種的育種方法的研究?，F(xiàn)有育種方法包括人工選擇育種、誘變育種、原生質體融合育種、雜交育種以及基因工程育種等，但對育種后所得到的育種菌株如何高效篩選沒有系統(tǒng)研究，現(xiàn)在方法主要是育種后的菌種作為一株菌種進行基培養(yǎng)，這種菌種作為出發(fā)菌株優(yōu)劣菌絲混雜在一起、菌絲一致性差，菌絲之間互相牽制，相互影響，判定菌種優(yōu)、劣的準確性差。而且要經(jīng)形態(tài)學鑒定、細胞學標記、生化標記和分子生物學技術鑒定后，才能選育出優(yōu)良菌種，周期長、篩選出的菌種不穩(wěn)定等問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種食用菌菌種的單克隆高效選育方法，該方法可保證出發(fā)菌株菌絲高純度、減少優(yōu)劣菌絲的混雜現(xiàn)象和相互影響，一致性好，單克隆制備同時可觀察到單克隆間的拮抗信息，縮短菌種鑒定時間，提高選育效率。

本發(fā)明的技術解決方案是：

一種食用菌菌種的單克隆高效選育方法，其具體步驟如下：

(1)單克隆制備緩沖液的制備

將9克氯化鈉溶液于1000mL蒸餾水或純水里，配置成質量體積比0.9％的生理鹽水作為單克隆制備緩沖液，分裝于試管；

試管緩沖液1：每支試管1.0mL，同時試管中加入不規(guī)則菌絲切割物，膠塞封口；

試管緩沖液2：每支試管0.9mL，同時試管中加入不規(guī)則菌絲切割物，膠塞封口；

試管緩沖液1和試管緩沖液2中，不規(guī)則菌絲切割物為不規(guī)則形狀的玻璃球或玻璃片；

分裝后的試管，121℃，高壓滅菌20分鐘-30分鐘，冷卻備用；

(2)將食用菌菌種，選取斜面培養(yǎng)或平皿培養(yǎng)前端菌絲，取3×3毫米菌絲塊，無菌條件下轉置步驟(1)制備的“試管緩沖液1”試管中，在1500rpm-2000rpm震蕩10分鐘-15分鐘，至菌絲塊均勻懸浮于試管；

(3)梯度稀釋步驟(2)“試管緩沖液1”菌液，即無菌條件下取“試管緩沖液1”0.1mL轉置“試管緩沖液2”中，稀釋成10^-2濃度菌液，高速震蕩3分鐘-5分鐘，依次稀釋至顯微鏡40倍物鏡觀察30個視野，菌絲分布單一，無菌絲聚合為止；

(4)單克隆制備

依據(jù)食用菌性質選用單克隆篩選培養(yǎng)基，121℃，高壓滅菌20分鐘-30分鐘；

將單克隆篩選培養(yǎng)基溫度降至40℃-50℃時，無菌條件加入平皿中，冷卻凝固，將步驟(3)制備的不同梯度菌液涂布在多個平皿中，每個平皿加入0.1mL菌液，均勻涂布，將步驟(3)制備的梯度稀釋液全部涂布平皿中，以保證選育菌種的完整性；將菌液中的食用菌在平皿中培養(yǎng)，直至單克隆的出現(xiàn)。

單克隆篩選培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基，加入量為30mL-35mL，平皿的規(guī)格為90mm×90mm。

試管緩沖液1和試管緩沖液2中，每個試管中不規(guī)則菌絲切割物的加入數(shù)量為2個-3個。

所述不規(guī)則菌絲切割物的規(guī)格為2mm×2mm×2mm-3mm×3mm×3mm。

步驟(2)的食用菌菌種是經(jīng)過人工選擇育種、誘變育種、原生質體融合育種、雜交育種以及基因工程育種所得到香菇、黑木耳、平菇、草菇、灰樹花、猴頭菇的食用菌菌種。

平皿和菌絲涂布器使用前進行滅菌，在180℃干熱滅菌2小時-3小時。

單克隆是指經(jīng)過本發(fā)明方法獲得的單一萌發(fā)菌斑，不同于食用菌接種塊和液體菌種菌球。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)該方法適用面廣，擔子菌、子囊菌均適用，具有普遍性；

(2)、該方法篩選菌種直觀快捷、簡單高效，短時間內(nèi)即可通過菌絲形態(tài)、生長速度、顯微形態(tài)等特征區(qū)分差異菌株，獲得大量生物育種材料；

(3)、該方法在菌種選育過程中可直接獲得菌株間拮抗生長信息，極大縮短選育時間，提高效率；

(4)、該方法篩選出的菌種純度高、一致性好，避免菌絲形態(tài)、生長速度等特征區(qū)分差異菌種混雜在一起，減少不良菌種的對目標菌種的干擾。

綜上所述，該方法在不同食用菌菌種選育中的應用能保證出發(fā)菌株菌絲高純度、減少優(yōu)劣菌絲的混雜現(xiàn)象和相互影響，一致性好。單克隆制備同時可觀察到單克隆間的拮抗信息，縮短菌種鑒定時間，提高選育效率，為食用菌菌種選育提供了新思路和新方法。

附圖說明

圖1和圖2是本發(fā)明(對應實施例1)遼香1號試管緩沖液40倍物鏡下顯微觀察結果圖；

圖3是本發(fā)明(對應實施例1)遼香1號單克隆培養(yǎng)平皿出現(xiàn)單克隆照片；

圖4是本發(fā)明(對應實施例1)遼香1號單克隆培養(yǎng)平皿單克隆拮抗現(xiàn)象照片；

圖5是常規(guī)育種方法遼香1號培養(yǎng)平皿照片；

圖6和圖7是本發(fā)明(對應實施例3)遼黑9號試管緩沖液40倍物鏡下顯微觀察結果圖；

圖8是本發(fā)明(對應實施例3)遼黑9號單克隆培養(yǎng)平皿出現(xiàn)單克隆照片；

圖9是本發(fā)明(對應實施例3)遼黑9號單克隆培養(yǎng)平皿單克隆拮抗現(xiàn)象照片；

圖10是常規(guī)育種方法遼黑9號培養(yǎng)平皿照片；

圖11和圖12是本發(fā)明(對應實施例3)遼平16#試管緩沖液40倍物鏡下顯微觀察結果圖；

圖13是本發(fā)明(對應實施例3)遼平16#單克隆培養(yǎng)平皿出現(xiàn)單克隆照片；

圖14是本發(fā)明(對應實施例3)遼平16#單克隆培養(yǎng)平皿單克隆拮抗現(xiàn)象照片；

圖15是常規(guī)育種方法遼平16#培養(yǎng)平皿照片。

具體實施方式

實施例1香菇菌種單克隆制備

(1)單克隆制備緩沖液的制備

將9克氯化鈉溶液于1000mL蒸餾水或純水里，配置成質量體積比0.9％的生理鹽水作為單克隆制備緩沖液，分裝于試管；

試管緩沖液1：每支試管1.0mL，同時試管中加入3個不規(guī)則形狀的玻璃球，規(guī)格為2mm×2mm×2mm-3mm×3mm×3mm，膠塞封口；

試管緩沖液2：每支試管0.9mL，同時試管中加入3個不規(guī)則形狀的玻璃球，規(guī)格為2mm×2mm×2mm-3mm×3mm×3mm，膠塞封口；

分裝后的試管，121℃，高壓滅菌20分鐘，冷卻備用；

(2)取“遼香1號”PDA斜面保存菌種，取3×3毫米菌絲塊無菌條件下接種于PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)至3cm-5cm，菌絲前端切取3×3毫米菌絲塊無菌條件下轉置步驟(1)制備的“試管緩沖液1”試管中，2000rpm震蕩10分鐘，至菌絲塊均勻懸浮于試管；

(3)梯度稀釋步驟(2)“試管緩沖液1”菌液，即無菌條件下取“試管緩沖液1”0.1ml轉置“試管緩沖液2”中，稀釋成10^-2濃度菌液，2000rpm震蕩3分鐘，依次稀釋至10^-3濃度菌液，顯微鏡40倍物鏡觀察30個視野，菌絲分布單一，無菌絲聚合現(xiàn)象；

(4)、單克隆制備

依據(jù)食用菌性質選用單克隆篩選培養(yǎng)基-PDA培養(yǎng)基，121℃，高壓滅菌20分鐘；

平皿和菌絲涂布器使用前進行滅菌，在180℃干熱滅菌2小時；

將PDA培養(yǎng)基溫度降至50℃時，無菌條件將PDA培養(yǎng)基加入平皿30mL，平皿的規(guī)格為90mm×90mm，冷卻凝固，將步驟(3)制備的不同梯度菌液(10^-2濃度菌液和10^-3濃度菌液)0.1mL均勻涂布在多個平皿中，將步驟(3)制備的梯度稀釋液全部涂布平皿中，以保證選育菌種的完整性，25℃溫度培養(yǎng)，直至單克隆的出現(xiàn)。

單克隆篩選標準及單克隆挑取方法：

3.1單克隆篩選標準

依據(jù)單克隆菌絲形態(tài)、生長速度、顯微形態(tài)、產(chǎn)孢能力等特征挑取差異菌株；

3.2單克隆挑取方法

依據(jù)標準挑取差異菌種，無菌條件下切取3×3毫米菌絲塊無菌條件下接種于適合培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)基上，適合條件培養(yǎng)，測定菌絲生長速度，同時進一步觀察菌絲形態(tài)、顯微形態(tài)、產(chǎn)孢能力等特性及拮抗信息，對單克隆進行初篩，為進一步生化指標、分子生物學指標鑒定提供生物育種材料。

按照本發(fā)明方法經(jīng)過3次實驗，獲得在菌絲生長速度、顯微形態(tài)、產(chǎn)孢能力等特性差異單克隆97株，單克隆制備平皿(如圖3和圖4所示)，可直接觀察出生長速度、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢能力及拮抗情況，不僅為優(yōu)良菌種選育提供了大量生物材料(常規(guī)方法能提供1株，如圖5所示，本方法可提供97株)，而且減少了菌種生長速度及拮抗實驗等鑒定過程，針對香菇菌種，縮短了育種時間10天-15天。

實施例2

本實施例使用的培養(yǎng)基選用PDA培養(yǎng)基，其配方(1000mL)：200g土豆煮水，20分鐘，取水煮液調體積至1000ml，加入20g葡萄糖、20g瓊脂，加熱溶解，分裝至三角瓶，121℃，102KPa高壓滅菌30分鐘；

(1)單克隆制備緩沖液的制備

將9克氯化鈉溶液于1000mL蒸餾水或純水里，配置成質量體積比0.9％的生理鹽水作為單克隆制備緩沖液，分裝于試管；

試管緩沖液1：每支試管1.0mL，同時試管中加入2個厚度為2mm不規(guī)則形狀的玻璃片，長度和寬度分別為2mm×2mm-3mm×3mm膠塞封口；

試管緩沖液2：每支試管0.9mL，同時試管中加入2個厚度為2mm不規(guī)則形狀的玻璃片，長度和寬度分別為2mm×2mm-3mm×3mm膠塞封口；

分裝后的試管，121℃，滅菌30分鐘，冷卻備用；

(2)取“遼黑9號”PDA斜面保存菌種，取3×3毫米菌絲塊無菌條件下接種于PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)至3cm-5cm，菌絲前端切取3×3毫米菌絲塊無菌條件下轉置步驟(1)制備的“試管緩沖液1”試管中，1500rpm震蕩15分鐘，至菌絲塊均勻懸浮于試管；

(3)梯度稀釋步驟(2)“試管緩沖液1”菌液，即無菌條件下取“試管緩沖液1”0.1mL轉置“試管緩沖液2”中，稀釋成10^-2濃度菌液，1500rpm震蕩5分鐘，顯微鏡40倍物鏡觀察30個視野，菌絲分布單一，無菌絲聚合現(xiàn)象；

(4)、單克隆制備

依據(jù)食用菌性質選用單克隆篩選培養(yǎng)基-PDA培養(yǎng)基；

平皿和菌絲涂布器使用前進行滅菌，在180℃干熱滅菌3小時；

將PDA培養(yǎng)基加熱溶解后，無菌條件將PDA培養(yǎng)基加入平皿35mL，平皿的規(guī)格為90mm×90mm，冷卻凝固，將不同梯度菌液0.1mL均勻涂布步驟(3)制備的平皿中，將步驟(3)制備的梯度稀釋液全部涂布平皿中，以保證選育菌種的完整性，25℃溫度培養(yǎng)，直至單克隆的出現(xiàn)。

本方法經(jīng)過3次實驗，獲得在菌絲生長速度、顯微形態(tài)、產(chǎn)孢能力等特性差異單克隆75株，單克隆制備平皿(如圖8和圖9所示)，可直接觀察出生長速度、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢能力及拮抗情況，不僅為優(yōu)良菌種選育提供了大量生物材料(原有方法能提供1株，本方法可提供75株)，而且減少了菌種生長速度及拮抗實驗等鑒定過程，針對黑木耳菌種，縮短了育種時間13-18天。

實施例3

(1)單克隆制備緩沖液的制備

將9克氯化鈉溶液于1000mL蒸餾水或純水里，配置成質量體積比0.9％的生理鹽水作為單克隆制備緩沖液，分裝于試管；

試管緩沖液1：每支試管1.0mL，同時試管中加入2個厚度為2mm不規(guī)則形狀的玻璃片，長度和寬度分別為2mm×2mm-3mm×3mm膠塞封口；

試管緩沖液2：每支試管0.9mL，同時試管中加入2個厚度為2mm不規(guī)則形狀的玻璃片，長度和寬度分別為2mm×2mm-3mm×3mm膠塞封口；

分裝后的試管，121℃，滅菌30分鐘，冷卻備用；

(2)取“遼平16#”PDA斜面保存菌種，取3×3毫米菌絲塊無菌條件下接種于PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)至3cm-5cm，菌絲前端切取3×3毫米菌絲塊無菌條件下轉置步驟(1)制備的“試管緩沖液1”試管中，1800rpm高速震蕩10分鐘，至菌絲塊均勻懸浮于試管；

(3)梯度稀釋步驟(2)“試管緩沖液1”菌液，即無菌條件下取“試管緩沖液1”0.1ml轉置“試管緩沖液2”中，稀釋成10^-2濃度菌液，1800rpm高速震蕩5分鐘，依次稀釋至10^-3濃度菌液，顯微鏡40倍物鏡觀察30個視野，菌絲分布單一，無菌絲聚合現(xiàn)象；

(4)、單克隆制備

依據(jù)食用菌性質選用單克隆篩選培養(yǎng)基-PDA培養(yǎng)基，121℃，102KPa滅菌25分鐘；

平皿和菌絲涂布器使用前進行滅菌，在180℃干熱滅菌2.5小時；

將PDA培養(yǎng)基溫度降至40℃時，無菌條件將PDA培養(yǎng)基加入平皿32mL，平皿的規(guī)格為90mm×90mm，冷卻凝固，將不同梯度菌液0.1mL均勻涂布步驟(3)制備的平皿中，將步驟(3)制備的梯度稀釋液全部涂布平皿中，以保證選育菌種的完整性，適合溫度培養(yǎng)，直至單克隆的出現(xiàn)。

本方法經(jīng)過3次實驗，獲得在菌絲生長速度、顯微形態(tài)、產(chǎn)孢能力等特性差異單克隆100株，單克隆制備平皿(如圖13和圖14所示)，可直接觀察出生長速度、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢能力及拮抗情況，不僅為優(yōu)良菌種選育提供了大量生物材料(原有方法能提供1株，本方法可提供100株)，而且減少了菌種生長速度及拮抗實驗等鑒定過程，針對平菇菌種，縮短了育種時間8-13天。

圖3是本發(fā)明實施例1的“遼香1號”單克隆培養(yǎng)平皿，圖8是本發(fā)明實施例2“遼黑9號”單克隆培養(yǎng)平皿，圖13是本發(fā)明實施例3“遼平16#”單克隆培養(yǎng)平皿；由圖3、圖8和圖13可以看出平皿中“平皿出現(xiàn)單克隆”照片中小菌斑為萌發(fā)慢，但菌絲一致性好的的單克?。痪叽蟮臑槊劝l(fā)快，但菌絲一致性差的單克隆。同時可以測定菌絲延伸速度?？梢砸罁?jù)選育目的確定所要選擇的單克隆。通過與圖5現(xiàn)有育種方法遼香1號菌種培養(yǎng)平皿、圖10現(xiàn)有育種方法遼黑9號菌種培養(yǎng)平皿和圖15現(xiàn)有育種方法遼平16#菌種培養(yǎng)平皿常規(guī)方法獲得的平皿對比，證明該方法篩選菌種直觀快捷、簡單高效，短時間內(nèi)即可通過菌絲形態(tài)、生長速度、顯微形態(tài)等特征區(qū)分差異菌株，獲得大量生物育種材料。

圖4遼香1號單克隆培養(yǎng)平皿、圖9遼黑9號單克隆培養(yǎng)平皿和圖14遼平16#單克隆培養(yǎng)平皿中“平皿單克隆拮抗現(xiàn)象”照片中，出現(xiàn)菌種之間的拮抗現(xiàn)象，說明該方法在單克隆培養(yǎng)過程中可直接獲得菌株間拮抗生長信息，極大縮短選育時間，提高效率。

以上僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。