本發(fā)明涉及微生物領域篩選生產(chǎn)特定產(chǎn)物的新菌株的方法，具體涉及一種具有細菌纖維素高生產(chǎn)能力的細菌菌株的篩選方法
背景技術(shù)：
細菌纖維素(bacterial cellulose，簡稱BC)是一種由革蘭氏陰性產(chǎn)酸菌合成的、優(yōu)良天然可降解纖維素，通常指由醋酸菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和八疊球菌屬(Sarcina)等微生物，在不同條件下合成的纖維素的統(tǒng)稱。BC和植物等產(chǎn)生的天然纖維素具有相同的分子結(jié)構(gòu)單元，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的高分子化合物，但細菌纖維素卻有許多更加優(yōu)異的性質(zhì)：具有巨大的表面積、較高持水率和壓縮性能，高抗張強度；微纖維直徑約為0.1μm，比木質(zhì)纖維小300倍【S.S.Kim，S.Y.Lee，K.J.Park，et al.Saudi Journal of Biological Sciences，2015】；高純度高結(jié)晶度；較高的生物相容性和良好的生物可降解性；合成時可調(diào)控性等等。因此BC已被廣泛應用于食品添加、包裝材料、造紙、生物醫(yī)藥、聲學器材等諸多領域【盧美歡，馬英輝，王銀存等.中國釀造，2013，32(7)：46-49】。
以椰子水等為原料篩選產(chǎn)BC菌株起步較早，發(fā)展較為迅速，利用椰子水的高營養(yǎng)成分進行產(chǎn)BC菌株的優(yōu)化培養(yǎng)以提高產(chǎn)量的研究均已發(fā)展較為成熟。隨著近年來椰子系列產(chǎn)品在食品市場上占據(jù)越來越多的份額，而椰子原產(chǎn)地在我國地域上十分受限，導致椰子的成本呈逐年遞增趨勢，除此之外，不同的椰子水，同樣的產(chǎn)纖維培養(yǎng)基配方，纖維素產(chǎn)量差異較大【王志國，鐘春燕，王錫彬等.中國釀造，2009，4：32-34】，經(jīng)濟上不利于發(fā)展BC的研究和生產(chǎn)工作。于是學者們將目光擴至營養(yǎng)豐富、來源廣泛的營養(yǎng)源上。在此方向上，學者們?nèi)諠u探索出一些用其他原料篩選細菌纖維素的方法。利用一些天然原料，如水果類原料、糖質(zhì)原料、低值淀粉類原料和廢棄纖維素類原料等均被用來嘗試作篩選產(chǎn)BC菌株的原料【謝健健，洪楓.纖維素科學與技術(shù)，2011，19(3)：68-74】。利用一些發(fā)酵生產(chǎn)廢水，如酒糟廢水、釀醋廢水【JM Wu，RH Liu.Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115(3)：284-290】或者農(nóng)林廢棄物及副產(chǎn)物【楊光，王彩霞.纖維素科學與技術(shù)，2015，(23)4：67】等作為篩菌原料，既能充分利用廢棄有機物質(zhì)中所含的豐富的碳源等成分，又在一定程度上緩解由于大量棄埋所形成的固體有機污染物垃圾以及生產(chǎn)污水排放污染，充分體現(xiàn)綠色環(huán)保的可持續(xù)原則?？紤]到我國水果物產(chǎn)豐富，且水果的生產(chǎn)具有明顯的季節(jié)性變化，容易發(fā)生水果大量腐敗而丟棄處理的浪費現(xiàn)象，選取腐敗水果作篩選產(chǎn)BC菌株的原料來源【周勝虎，薛齊佳，劉傳鳳等.湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52(15)：3514-3517】，成為深具潛力的發(fā)展趨勢。
自然篩選得到的產(chǎn)BC菌株的產(chǎn)量往往較低，相對于培養(yǎng)基成本其經(jīng)濟性較差，提高菌株產(chǎn)BC的能力成為迫切需要。研究者們關(guān)于BC的生產(chǎn)方式分別以靜態(tài)培養(yǎng)與動態(tài)培養(yǎng)兩種方式做了大量對比研究【朱宏陽，馮珊，楊宏芳等.海峽藥學，2015，27(12)：265-268】，分別能滿足不同的產(chǎn)品需求；常用單因素實驗、正交試驗【張雯，葛萬云，齊香君.食品研究與開發(fā)，2015，36(18)：106-110】以及響應面法【周蓮，盧紅梅，陳莉等.中國調(diào)味品，2016，41(2)：69-73】等來確定產(chǎn)細菌纖維素菌株的最佳碳氮源與培養(yǎng)基【Faranak Mohammadkazemia，Mehrdad Azinb，Alireza Ashoric.Carbohydrate Polymers，2015，117：518-523】等最優(yōu)生產(chǎn)條件。除此之外，等離子體注入誘變【張桂才，賈士儒，閆林等.現(xiàn)代食品科技，2010，26(12)：1354-1357】、紫外線與硫酸二乙酯復合誘變【張銀冰.食品工程，2014，2：42-45】【鄧毛程，李靜，王瑤等.食品工業(yè)科技，2015，36(4)：159-162】、高靜水壓處理誘變【林德慧，杜雙奎，李志西等.西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)，2011，39(3)：119-124】、低能N+離子束輻照誘變【張雯，李成濤，李彥軍等.現(xiàn)代食品科技，2015，31(5)：144-149】、紫外低溫復合誘變【王良等.生物化工，2016，2(2)：20-25】等方法，被應用到提高菌株產(chǎn)BC能力的研究中，均取得一定的積極成果，但也存在很多不足之處亟待改善。等離子體注入法誘變機制復雜，尚未全部被掌握，隨之可能發(fā)生誘變菌株最優(yōu)生產(chǎn)條件的改變，在實踐應用上帶來很大的不確定性；紫外誘變的操作要求嚴苛，必須在暗處進行，否則容易發(fā)生光修復使誘變效率低下；高靜水壓處理法對菌株的誘變方向不明確從而難以掌控，存在可能改變菌株的某些正常遺傳物質(zhì)而導致其他生理性狀的改變。誘變的方法普遍存在結(jié)果隨機性較大的不足之處，正向突變率極低導致工作量的增大，致使總的工作效率低下；大多的誘變操作不能保證傳代和遺傳的穩(wěn)定性，導致菌株產(chǎn)量波動較大，甚至會漸漸失去高產(chǎn)的優(yōu)異性質(zhì)，反而進一步增大生產(chǎn)成本；誘變法在實現(xiàn)BC產(chǎn)量提高的同時，可能導致菌株其他性能的變化以至于不再符合實際生產(chǎn)的需求。誘變法所得的高產(chǎn)菌株即使是在實驗室規(guī)模中取得較好的進步，其高產(chǎn)性能以及經(jīng)濟性在中試以及實際生產(chǎn)應用中仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。因此，采取有效的方法，從自然環(huán)境中直接篩選性能優(yōu)良的BC高產(chǎn)菌株尤為必要。目前已有不少研究者嘗試從不同菌源做產(chǎn)BC菌株的篩選，并對其培養(yǎng)條件做了優(yōu)化【王雪奇，應以堅，金亞倩等.輕工科技，2015，(11)：6-8】，但是成功篩選出高產(chǎn)BC菌株的實例仍屈指可數(shù)，且生產(chǎn)成本仍居高不下。篩選高產(chǎn)BC菌株的方法還有待深入研究。本發(fā)明提供一種具有BC高生產(chǎn)能力的細菌菌株的篩選方法，該方法從自然接種于空氣的富含豐富營養(yǎng)成分以及微量元素的腐敗水果中或從天然土壤中，進行BC高產(chǎn)菌株的篩選。該方法無額外引入繁雜的操作，低廉有效，并且從自然中取材，不產(chǎn)生任何污染，操作周期簡短，便于大規(guī)模的應用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種篩選具有BC高生產(chǎn)能力菌株的方法，具體步驟包括：
菌株來源于自然接種的腐敗水果或土壤，把土樣懸浮液及水果破碎過濾后稀釋的濾液接種至富集培養(yǎng)基中，30℃，150～200r/min振蕩培養(yǎng)24h，將制得的菌懸液10倍梯度稀釋后，選擇3個合適稀釋倍數(shù)的菌懸液各100～200μL，涂布在表面含有碳酸鈣層的分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各2～3個平行樣，30℃，pH＝6.8～7.0培養(yǎng)3～5d。挑取周邊有透明區(qū)域的菌落劃線培養(yǎng)，得到純菌單菌落。接種單菌落于HS發(fā)酵培養(yǎng)基，27～31℃，pH＝3.5～7.0，120～180r/min培養(yǎng)2～14d，將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株進行斜面保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明的優(yōu)勢在于：1.篩菌原材料取自菌種含量豐富且廣泛易得的土壤、營養(yǎng)豐富卻極易腐敗而導致大量有機固體垃圾、惡臭產(chǎn)生的水果。土壤是微生物的物種庫，為此類篩菌工作提供了極大的可行性，土壤的取材簡便易行，且隨取材地的不同提供不同種類優(yōu)良性狀的菌種。水果養(yǎng)分富裕但儲存運輸條件要求苛刻而容易腐敗，取材自腐敗的水果起到廢物利用的作用，充分發(fā)揮水果營養(yǎng)高的特點，體現(xiàn)綠色環(huán)保的發(fā)展規(guī)律。兩種材料皆成本低廉，廣泛易得，且利于菌種的富集。
2.本課題組采用該發(fā)明方法從自然接種于空氣的腐敗水果中或從天然土壤中進行高產(chǎn)BC菌株的篩選，并且取得了較理想的成果。該方法所篩出的產(chǎn)BC菌株產(chǎn)酸量明顯高于市場上購得的產(chǎn)BC菌株-木醋桿菌，并且產(chǎn)量也有很大幅度的提升。經(jīng)掃描電鏡圖像明顯看出，該方法所篩出的產(chǎn)BC菌株分子結(jié)構(gòu)、孔隙度等性能與市場所售木醋桿菌所產(chǎn)細菌纖維素存在明顯差異。
下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例1.制定篩選方案
實驗材料來自各處采集的土樣以及腐敗的蘋果、梨、西瓜、柑橘類、哈密瓜等10余種水果的果皮與果肉、茶水等。將采集的樣品分別進行預處理后，將其中或表面所含的菌種全部溶解在水中，制得菌懸液。將制得的菌懸液按梯度稀釋后選擇若干合適稀釋倍數(shù)的菌懸液進行稀釋涂布，用本課題組自制的分層的分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)出茂盛的菌落后，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。將所篩得的產(chǎn)酸菌接種至斜面培養(yǎng)基保存于冰箱。待用時從冰箱中取出斜面培養(yǎng)基先后接種至常溫下的保存培養(yǎng)基、種子活化液體培養(yǎng)基進行菌株復活。將活化后的種子液接入HS發(fā)酵培養(yǎng)基分別進行動態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)，對能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株作深度測試表征。
實施例2.不同培養(yǎng)基及溶液配方方案
(1)富集培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨3g，甘露醇25g，蒸餾水1000ml。pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(2)分離培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，酵母粉5g，輕質(zhì)碳酸鈣7g，瓊脂粉12g，蒸餾水1000ml，pH＝6.8～7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻到50℃后加無水乙醇5ml。
(3)斜面保存培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，酵母粉5g，瓊脂粉12g，蒸餾水1000ml。分裝后121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(4)HS發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉5g，檸檬酸1.15g，磷酸氫二鈉4g，蒸餾水1000ml。pH＝3.5～7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻到50℃后加無水乙醇20ml。
(5)種子活化培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO415g，蒸餾水1000ml。pH自然、121℃高壓蒸汽滅菌20min；冷卻到50℃后加無水乙醇20ml。
實施例3.土壤樣品產(chǎn)BC菌株的篩選與保存
(1)菌懸液的制備：實驗材料來自各處采集的土樣進行預處理，去除其中的粗礫雜草根等雜物質(zhì)，稱取10g左右經(jīng)預處理的土樣，用無菌水溶解于小燒杯，用玻璃棒充分攪拌，確保土樣中的菌種全部溶解在水中，對土樣懸濁液進行抽濾至燒杯中，可將過濾后的濾液進行適當稀釋。將土樣抽濾后的濾液接種至已滅菌處理的富集培養(yǎng)基中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，制得土樣菌懸液。
(2)稀釋涂布培養(yǎng)：將制得的土樣菌懸液按10倍梯度稀釋后選擇合適稀釋倍數(shù)，如10-6、10-7、10-8倍的菌懸液各100μL，涂布在已滅菌處理具有產(chǎn)酸菌篩選層的碳酸鈣分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各3個平行樣，在已除菌的超凈臺中30℃培養(yǎng)3d，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。每一株產(chǎn)酸菌單獨標記并接種至斜面保存培養(yǎng)基，置于無菌超凈臺內(nèi)生長至菌落茂盛后，轉(zhuǎn)移至-4℃冰箱中保存菌種。
(3)低溫保存的產(chǎn)酸菌株的活化：從冰箱中保存的斜面培養(yǎng)基接種菌株至新的已滅菌處理的斜面培養(yǎng)基，置于無菌超凈臺內(nèi)生長至菌落茂盛。
(4)種子液的制備：于活化的斜面試管培養(yǎng)基中接種2～3環(huán)菌苔，接種至已滅菌處理的種子活化液體培養(yǎng)基。30℃，130r/min振蕩培養(yǎng)24h。
(5)產(chǎn)凝膠狀產(chǎn)物菌株的篩選：以10％的接種量，將活化后的種子液接入已滅菌的裝有100mLHS發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL廣口瓶中，或直接接種產(chǎn)酸菌單菌落2～3環(huán)于已滅菌處理的HS發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布封口后，分別進行動態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)：靜態(tài)培養(yǎng)于超凈臺內(nèi)室溫靜置培養(yǎng)5d；動態(tài)培養(yǎng)為30℃，180r/min培養(yǎng)2d。將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株留用。
實施例4.水果產(chǎn)BC菌株的篩選與保存。
(1)菌懸液的制備：實驗材料來自各種腐敗的蘋果、梨、西瓜、柑橘類、哈密瓜等10余種水果的果皮與果肉。將采集的腐敗水果樣品進行預處理，稱取10g左右經(jīng)預處理的樣品，完全破碎后用無菌水沖洗至小燒杯，用玻璃棒充分攪拌，確保土樣中的菌種全部溶解在水中，將適當稀釋過濾后的濾液接種至已滅菌處理的富集培養(yǎng)基中，30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24h，水果樣品制得菌懸液。
(2)稀釋涂布培養(yǎng)：將制得的水果樣品菌懸液按10倍梯度稀釋后選擇3個合適稀釋倍數(shù)的菌懸液，如10-7、10-8、10-9倍的，各150μL，涂布在已滅菌處理具有產(chǎn)酸菌篩選層的碳酸鈣分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各3個平行樣，在已除菌的超凈臺中30℃培養(yǎng)4d，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。每一株產(chǎn)酸菌單獨標記并接種至斜面保存培養(yǎng)基，置于無菌超凈臺內(nèi)生長至菌落茂盛后，轉(zhuǎn)移至-4℃冰箱中保存菌種。
(3)低溫保存的產(chǎn)酸菌株的活化：從冰箱中保存的斜面培養(yǎng)基接種菌株至新的已滅菌處理的斜面培養(yǎng)基，置于無菌超凈臺內(nèi)生長至菌落茂盛。
(4)種子液的制備：于活化的斜面試管培養(yǎng)基中接種2～3環(huán)菌苔，接種至已滅菌處理的種子活化液體培養(yǎng)基。30℃，130r/min振蕩培養(yǎng)24h。
(5)產(chǎn)凝膠狀產(chǎn)物菌株的篩選：以10％的接種量，將活化后的種子液接入已滅菌的裝有100mLHS發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL廣口瓶中，或直接接種產(chǎn)酸菌單菌落2～3環(huán)于已滅菌處理的HS發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布封口后，分別進行動態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)：靜態(tài)培養(yǎng)于超凈臺內(nèi)室溫靜置培養(yǎng)7d；動態(tài)培養(yǎng)為30℃，180r/min培養(yǎng)7d。將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株留用。
實施例5.茶水樣品產(chǎn)BC菌株的篩選與保存
(1)菌懸液的制備：實驗材料來自各種用無菌水浸泡茶葉所得茶水等進行過濾等預處理，去除其中的固體物質(zhì)，充分浸泡出茶水中營養(yǎng)以及確保菌種全部溶解在水中，稱取10ml左右經(jīng)預處理的茶水于小燒杯，對茶水液進行適當稀釋。將稀釋后的濾液接種至已滅菌處理的富集培養(yǎng)基中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，制得茶水樣菌懸液。
(2)稀釋涂布培養(yǎng)：將制得的茶水樣菌懸液按10倍梯度稀釋后選擇合適稀釋倍數(shù)，如10-6、10-7、10-8倍的菌懸液各200μL，涂布在已滅菌處理具有產(chǎn)酸菌篩選層的碳酸鈣分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各3個平行樣，在已除菌的超凈臺中30℃培養(yǎng)5d，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。每一株產(chǎn)酸菌單獨標記并接種至斜面保存培養(yǎng)基，置于無菌超凈臺內(nèi)生長至菌落茂盛后，轉(zhuǎn)移至-4℃冰箱中保存菌種。
(3)低溫保存的產(chǎn)酸菌株的活化：從冰箱中保存的斜面培養(yǎng)基接種菌株至新的已滅菌處理的斜面培養(yǎng)基，置于無菌超凈臺內(nèi)生長至菌落茂盛。
(4)種子液的制備：于活化的斜面試管培養(yǎng)基中接種2～3環(huán)菌苔，接種至已滅菌處理的種子活化液體培養(yǎng)基。30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24h。
(5)產(chǎn)凝膠狀產(chǎn)物菌株的篩選：以10％的接種量，將活化后的種子液接入已滅菌的裝有100mLHS發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL廣口瓶中，或直接接種產(chǎn)酸菌單菌落2～3環(huán)于已滅菌處理的HS發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布封口后，分別進行動態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)：靜態(tài)培養(yǎng)于超凈臺內(nèi)室溫靜置培養(yǎng)14d；動態(tài)培養(yǎng)為30℃，180r/min培養(yǎng)14d。將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株留用。