本發(fā)明涉及生物技術領域，具體是一種從紅花醡漿草上分離高粱莖點霉(Phoma sorghina)的方法及應用。
背景技術：
紅花醡漿草俗稱銅錘草、四瓣菜、系醡漿草科多年生宿根性闊葉雜草，原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)，為全世界分布的一種惡性雜草，我國南北各地均有分布，貴州主要產(chǎn)于貴陽和獨山，在我國最初引進作為觀賞植物，現(xiàn)在也成為農(nóng)田惡性雜草；紅花醡漿草本身具有極強的繁殖能力和生長能力，主要以地下鱗莖繁殖，經(jīng)統(tǒng)計，紅花醡漿草危害嚴重的地塊可使辣椒減產(chǎn)50％-60％，玉米減產(chǎn)30-50％，花生、大豆等低矮作物減產(chǎn)50％-75％，受害最為嚴重的是露地西瓜，損失達50-85％，甚至有些地塊達到100％，防治紅花醡漿草已成為旱地雜草防除的重要工作，鑒于有關紅花醡漿草發(fā)生規(guī)律與防治方面的專門研究報道甚少，所以對于紅花醡漿草發(fā)生消長規(guī)律、生長發(fā)育及繁殖特性等進行系統(tǒng)的研究，為防治紅花醡漿草提供理論依據(jù)是目前迫切需要解決的問題。
所以針對上述問題，本發(fā)明提供了一種從紅花醡漿草上分離高粱莖點霉的方法及該霉的應用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種從紅花醡漿草上分離高粱莖點霉的方法及該霉的應用來防治旱地作物免受紅花醡漿草侵害，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
一種從紅花醡漿草上分離高粱莖點霉(Phoma sorghina)的方法，包括以下步驟：
1)分離：
1.1)采集罹病的紅花醡漿草，先用自來水沖洗表面；在病健交界處剪大小5×5mm組織若干塊；
1.2)將步驟1.1)中剪切的組織依次浸入酒精中30s，浸入質量分數(shù)為5％的次氯酸鈉溶液中45s，最后用滅菌水沖洗3次，并放在PDA培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5天；
1.3)將步驟1.2)中培養(yǎng)得到的不同形態(tài)的菌落分別轉接至新的PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)純化，并重復純化2-3次；
2)形態(tài)學鑒定：將步驟1.3)中純化好的菌落用直徑0.5cm的打孔器打下菌餅放在PDA培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7天，每天觀察菌落特征，包括形態(tài)、顏色、質地，菌絲和分子孢子形態(tài)；
3)分子生物學鑒定：采樣試劑盒提取步驟2)中菌落的DNA，首先使用ITS通用引物,進行PCR，PCR后進行膠回收測序，測序結果提交NCBI，Genbank號分別為：KX758542；根據(jù)ITS測序結果為莖點霉屬(Phoma sp.)，根據(jù)該屬的保守序列設計引物LSU和TUB設計2對引物，進行PCR，PCR后進行膠回收測序，測序結果提交NCBI，Genbank號分別為：、KY000557、KY000558。
作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟2)中，菌落形態(tài)為白色、輻射狀，致密；菌絲透明無隔；分生孢子為單孢、橢圓形；根據(jù)步驟2)中的形態(tài)學鑒定和步驟3)中的分子生物學鑒定，得出所述菌種為半知菌綱(Fungi Imperficti)，殼霉目(Sphaeropsicaceae)，莖點霉屬(Phoma sp.)高粱莖點霉(Phoma sorghina)。
以分離的純培養(yǎng)菌的分生孢子懸浮液接種至幼苗期的紅花醡漿草，接種后2d出現(xiàn)明顯的水浸狀斑點，之后葉片退綠發(fā)白，切取發(fā)病組織重新分離培養(yǎng)，所得的分離物與原接種病原物一致，完成了柯霍氏法則的驗證，證明分離物是紅花醡漿草的致病菌。
研究其轉化型發(fā)現(xiàn)該菌對甘蔗、水稻、小麥、玉米等作物安全，對牛筋草和馬唐沒有致病性，紅花醡漿草致病性強，顯示出對該菌有較大潛力開發(fā)成除草生防菌。
培養(yǎng)方法：該菌可以用下列培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并誘導產(chǎn)生分生孢子，
1、PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L；
2、紅花醡漿草浸汁培養(yǎng)基：紅花醡漿草葉片(曬干、粉碎、過200目篩)200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L；
3、玉米粉培養(yǎng)基玉：米粉30g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L
4、燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L。
作為本發(fā)明再進一步的方案：對于利用該方法得到的高粱莖點霉，其應用為利用高粱莖點霉(Phoma sorghina)進行紅花醡漿草防效實驗，實驗步驟如下：1)將高粱莖點霉在PDB培養(yǎng)基28℃條件下發(fā)酵7或14天，取發(fā)酵液噴霧處理紅花醡漿草；
2)可用用分生孢子或菌絲體水溶液處理紅花醡漿草葉片，濃度1×106-109conidia/ml，或者將分生孢子與各類輔助劑混合配置成懸浮液；
經(jīng)檢測，高粱莖點霉對紅花醡漿草防效在80％以上，顯示高粱莖點霉有效用于紅花醡漿草的防治。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種從發(fā)病的紅花醡漿草上分離出高粱莖點霉(Phoma sorghina)的方法，并通過形態(tài)學鑒定該菌在PDA上的形態(tài)特征：分生孢子器大小150-220μm，分子孢子大小3.5-8.5×2.2-3.0μm，通過分子生物學鑒定，DNA提取對ITS，LSU和TUB測序，結合形態(tài)學特征鑒定該菌為高粱莖點霉(Phoma sorghina)；該菌的培養(yǎng)條件適應性廣，在pH4-9和溫度15-35℃之間均可生長，培養(yǎng)基成本廉價易獲得，孢子在15-35℃之間均可萌發(fā)，對大部分作物安全，進一步的，通過對紅花醡漿草防效實驗，檢測得出該菌在濃度1×106-1×109conidia/ml時對紅花醡漿草防效在80％以上，證明從罹病紅花醡漿草中提取得到的高粱莖點霉能有效應用于對紅花醡漿草的防治領域。
附圖說明
圖1為本發(fā)明高粱莖點霉(Phoma sorghina)孢子在光學顯微鏡下結構示意圖。
具體實施方式
下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
請參閱圖1，一種從紅花醡漿草上分離高粱莖點霉(Phoma sorghina)的方法，包括以下步驟：
1)取樣：2015年3月在廣西上林縣農(nóng)田樣品采集罹病的紅花醡漿草，用塑料袋保存帶回實驗室備用；
2)分離：
2.1)樣品前處理：先用自來水沖洗樣品表面，接著使用滅菌剪刀剪切病健交界處組織，大小5mm*5mm，用鑷子轉移到帶有75％乙醇滅菌的離分杯中；
2.2)樣品處理：在裝有無水乙醇的分離杯中浸泡30s，轉移到裝有質量分數(shù)為5％的次氯酸鈉溶液滅菌分離杯中，浸泡45s，然后用滅菌水沖洗3次，轉移到PDA培養(yǎng)基上；
2.3)組織培養(yǎng)：將PDA培養(yǎng)基放置在28℃條件下的隔水式培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)5天；
2.4)純化：挑取不同形態(tài)的菌落轉接至新的PDA培養(yǎng)基上，在28℃條件下的隔水式培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)5天進行分離和純化，并重復純化2-3次；
3)形態(tài)學鑒定：將純化好的菌落用直徑0.5cm的打孔器打下菌餅放在PDA培養(yǎng)基上，在28℃條件下于隔水式培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7天，每天觀察菌落特征，包括形態(tài)、顏色、質地，菌絲和分子孢子形態(tài)；記錄菌落顏色、菌落質地，并用直尺測量生長速度；培養(yǎng)到第7天時，用接種針挑取菌絲和孢子在尼康Ni-E光學顯微鏡下檢測菌絲、子囊和孢子特征：菌落形態(tài)白色、輻射狀，致密；菌絲透明無隔；分生孢子為單孢、橢圓形；本發(fā)明高粱莖點霉(Phoma sorghina)在光學顯微鏡下結構特征如附圖1所示；
4)分子生物學鑒定：采樣試劑盒提取菌落的DNA，首先使用ITS通用引物進行PCR，PCR后進行膠回收測序；根據(jù)ITS測序結果,然后設計LSU和TUB設計2對引物，進行PCR，PCR后進行膠回收測序；測序結果提交NCBI，Genbank號分別為：KX758542、KY000557、KY000558，ITS設計引物序列為KX758542，LSU設計引物序列為KY000557，TUB設計引物序列為KY000558，引物基因序列如序列表所示。
根據(jù)形態(tài)學和分子生物學結果鑒定本發(fā)明分離得到的菌種為高粱莖點霉(Phoma sorghina)。
本發(fā)明分離出的高粱莖點霉(Phoma sorghina)用于對紅花醡漿草的防治，具體防效實驗如下：
孢子濃度1×106-1×109孢子/ml，或者1×106-1.0×109cfu/mL菌絲體懸浮液，噴霧處理。
1)從培養(yǎng)5d的菌落邊緣打取直徑5mm的菌餅接種到PDB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7和14d，取發(fā)酵液噴霧處理紅花醡漿草；
2)配制濃度為1×106-1.0×109cfu/mL的菌絲體懸浮液處理紅花醡醬草，每株噴施10mL。。
3)經(jīng)檢測，對紅花醡漿草防效在80％以上。
對其他雜草的致死率和致病性的情況如下：
致病性0代表不致??；1代表1-25％的組織壞死；2代表26-50％組織壞死；3代表51-75％組織壞死；4代表76-99％組織壞死；5代表全死。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種從發(fā)病的紅花醡漿草上分離出高粱莖點霉(Phoma sorghina)的方法，并通過形態(tài)學鑒定該菌在PDA上的形態(tài)特征：分生孢子器大小150-220μm，分子孢子大小3.5-8.5×2.2-3.0μm，通過分子生物學鑒定，DNA提取對ITS，LSU和TUB測序，結合形態(tài)學特征鑒定該菌為高粱莖點霉(Phoma sorghina)；該菌的培養(yǎng)條件適應性廣，在pH4-9和溫度15-35℃之間均可生長，培養(yǎng)基成本廉價易獲得，孢子在15-35℃之間均可萌發(fā)，對大部分作物安全，進一步的，通過對紅花醡漿草防效實驗，檢測得出該菌在濃度1×106-109conidia/ml時對紅花醡漿草防效在80％以上，證明從罹病紅花醡漿草中提取得到的高粱莖點霉能有效應用于對紅花醡漿草的防治領域。
對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。