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從紅花醡漿草上分離高粱莖點(diǎn)霉的方法及該霉的應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):12108411閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種從紅花醡漿草上分離高粱莖點(diǎn)霉的方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)分離:

1.1)采集罹病的紅花醡漿草,先用自來(lái)水沖洗表面;在病健交界處剪大小5×5mm組織若干塊;

1.2)將步驟1.1)中剪切的組織依次浸入酒精中30s,浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液中45s,最后用滅菌水沖洗3次,并放在PDA培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5天;

1.3)將步驟1.2)中培養(yǎng)得到的不同形態(tài)的菌落分別轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)純化,并重復(fù)純化2-3次;

2)形態(tài)學(xué)鑒定:將步驟1.3)中純化好的菌落用直徑0.5cm的打孔器打下菌餅放在PDA培養(yǎng)基上,在28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7天,每天觀察菌落特征,包括形態(tài)、顏色、質(zhì)地,菌絲和分子孢子形態(tài);

3)分子生物學(xué)鑒定:采樣試劑盒提取步驟2)中菌落的DNA,首先使用ITS通用引物,進(jìn)行PCR,PCR后進(jìn)行膠回收測(cè)序,測(cè)序結(jié)果提交NCBI,Genbank號(hào)分別為:KX758542;根據(jù)ITS測(cè)序結(jié)果為莖點(diǎn)霉屬(Phoma sp.),根據(jù)該屬的保守序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)SU和TUB設(shè)計(jì)2對(duì)引物,進(jìn)行PCR,PCR后進(jìn)行膠回收測(cè)序,測(cè)序結(jié)果提交NCBI,Genbank號(hào)分別為:KY000557、KY000558。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從紅花醡漿草上分離高粱莖點(diǎn)霉的方法,其特征在于,

所述步驟2)中,菌落形態(tài)為白色、輻射狀,致密;菌絲透明無(wú)隔;分生孢子為單孢、橢圓形;根據(jù)步驟2)中的形態(tài)學(xué)鑒定和步驟3)中的分子生物學(xué)鑒定,得出所述菌種為半知菌綱(Fungi Imperficti),殼霉目(Sphaeropsicaceae),莖點(diǎn)霉屬(Phoma sp.)高粱莖點(diǎn)霉(Phoma sorghina),以分離的純培養(yǎng)菌的分生孢子懸浮液接種至幼苗期的紅花醡漿草,接種后2d出現(xiàn)明顯的水浸狀斑點(diǎn),之后葉片退綠發(fā)白,切取發(fā)病組織重新分離培養(yǎng),所得的分離物與原接種病原物一致,完成了柯霍氏法則的驗(yàn)證,證明分離物是紅花醡漿草的致病菌;

研究其轉(zhuǎn)化型發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)甘蔗、水稻、小麥、玉米等作物安全,對(duì)牛筋草和馬唐沒(méi)有致病性,紅花醡漿草致病性強(qiáng),顯示出對(duì)該菌有較大潛力開(kāi)發(fā)成除草生防菌;

培養(yǎng)方法:該菌可以用下列培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并誘導(dǎo)產(chǎn)生分生孢子,

1.PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L

2.紅花醡漿草浸汁培養(yǎng)基:紅花醡漿草葉片(曬干、粉碎、過(guò)200目篩)200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L

3.玉米粉培養(yǎng)基:玉米粉30g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L

4.燕麥培養(yǎng)基:燕麥片30g、葡萄糖20g、瓊脂15g、水1L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的利用從紅花醡漿草上分離高粱莖點(diǎn)霉的方法得到的高粱莖點(diǎn)霉的應(yīng)用,其特征在于,

1)將高粱莖點(diǎn)霉在PDB培養(yǎng)基28℃條件下發(fā)酵7或14天,取發(fā)酵液噴霧處理紅花醡漿草;

2)可用分生孢子或菌絲體水溶液處理紅花醡漿草葉片,濃度1×106-1×109conidia/ml,或者將分生孢子與各類(lèi)輔助劑混合配置成懸浮液。

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