本發(fā)明涉及一種冠突散囊菌株及其應(yīng)用，屬于益生菌篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：冠突散囊菌，俗稱“金花”，在茯磚茶內(nèi)部呈黃色閉囊殼，屬于真菌界，曲霉科，是茯磚茶發(fā)花過程中產(chǎn)生的一種自然益生菌體。冠突散囊菌的命名很復(fù)雜，最初叫“灰綠曲菌”，后來(lái)又稱“謝瓦氏曲菌”，再后來(lái)又改為“冠突散曲菌”，到了20世紀(jì)末才稱作“冠突散囊菌”。冠突散囊菌外觀看呈球形，黃色，在顯微鏡下觀察，可以明顯看到許多具小的子囊孢子和分生孢子，子囊孢子有兩個(gè)明顯的冠狀突起，看起來(lái)像是雙凸鏡。分生孢子外形看起來(lái)像是橢球形，頭部是灰綠色的，孢子外壁較粗糙，有刺狀的突起。散囊菌屬于茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌株，菌株的發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的抗氧化性，對(duì)乙酰膽堿酯酶具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、腸沙門氏菌均有抑制作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，而提供一種冠突散囊菌株及其應(yīng)用，從茯磚茶中分離出冠突散囊菌株。本發(fā)明的冠突散囊菌株(Eurotiumcristatum)于2016年的10月13日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13173。本發(fā)明的冠突散囊菌株用于制備冠突散囊菌株微生物制劑。本發(fā)明的冠突散囊菌株微生物制劑是通過下述方法制備而成的：(1)制備孢子懸液：將冠突散囊菌株接種于試管中的斜面PDA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-6天，待斜面上的菌落由白色變?yōu)榈S色再變?yōu)榛液稚笳f明孢子成熟；用生理鹽水沖洗斜面制備孢子懸液，混勻10min后，調(diào)整孢子懸液使其孢子濃度為1×108CFU/mL后備用；(2)發(fā)酵：將PDA液體培養(yǎng)基在三角瓶中進(jìn)行分裝，PDA液體培養(yǎng)基的裝液量(培養(yǎng)基的體積占三角瓶容積的百分比)為10-50％；于121℃條件下滅菌20min；滅菌后冷卻，放入提前紫外滅菌的無(wú)菌操作臺(tái)中，取步驟(1)得到的GT-1菌株孢子懸液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，接種量(孢子懸液的體積占發(fā)酵培養(yǎng)液體積的百分比)為0.5-2.5％；接種后，于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中在25℃、160r/min下發(fā)酵9-15天，得到GT-1菌株的發(fā)酵液；(3)粗提：將步驟(2)得到的GT-1菌株的發(fā)酵液過濾菌絲體，旋蒸液體的體積至原體積的1/10，然后向其中加入三倍體積的95％乙醇，沉淀大分子糖；12h后在5000r/min下離心10min，取上清液旋蒸并冷凍干燥，得到GT-1菌株發(fā)酵液粗提物，粗提物即為冠突散囊菌株微生物制劑。上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，所述的PDA固體培養(yǎng)基的制備方法為：馬鈴薯20g洗凈切塊，加入100ml蒸餾水煮沸20min，過濾取上清液并加水補(bǔ)足100mL；加入葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、KH2PO40.3g、MgSO4·7H2O0.25g、維生素B10.01g、瓊脂2g，pH自然(不用調(diào)節(jié))。上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，所述的孢子懸液制備完成后立即發(fā)酵，避免孢子失活。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的孢子懸液的裝液量?jī)?yōu)選為13％。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的孢子懸液的接種量?jī)?yōu)選為2.2％。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選為9天。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的PDA液體培養(yǎng)基的制備方法為：馬鈴薯20g洗凈切塊，加入100ml蒸餾水煮沸20min，過濾取上清液并加水補(bǔ)足100mL；加入碳源2g、氮源0.2g、KH2PO40.05g、MgSO4·7H2O0.1g。所述的碳源為麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖或果糖中的任意一種，優(yōu)選為麥芽糖；所述的氮源為硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、酵母膏或蛋白胨中的任意一種，優(yōu)選為酵母膏。本發(fā)明提供一種冠突散囊菌株微生物制劑在制備抗氧化方面的藥物、食品或保健品方面的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種冠突散囊菌株微生物制劑在制備抗老年癡呆方面的藥物、食品或保健品方面的應(yīng)用。本發(fā)明的冠突散囊菌株微生物制劑具有抗氧化作用(具有清除DPPH自由基的作用、清楚超氧陰離子作用、具有還原作用)，抑菌作用(抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、腸沙門氏菌)，以及抑制乙酰膽堿酯酶活性作用。附圖說明圖1：冠突散囊菌株P(guān)CR產(chǎn)物的電泳圖；圖2：發(fā)酵液中的碳源種類對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響；圖3：發(fā)酵液中的氮源種類對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響；圖4：發(fā)酵時(shí)間對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響；圖5：裝液量對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響；圖6：接種量對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響；圖7：冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的效果；圖8：冠突散囊菌株微生物制劑清除超氧陰離子的效果；圖9：冠突散囊菌株微生物制劑的還原力；圖10：冠突散囊菌株微生物制劑的抑制乙酰膽堿酯酶的效果。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的具體實(shí)施方式詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不限于以下描述內(nèi)容：實(shí)施例1：冠突散囊菌株的篩選與鑒定本發(fā)明的冠突散囊菌株分離于茯磚茶，包括以下步驟：(1)初篩：在無(wú)菌條件下，將茯磚茶上的金花閉囊殼接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落生長(zhǎng)為黃色時(shí)，挑取菌株進(jìn)行PDA平板劃線；待菌株進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛期，重復(fù)操作3次，直至菌株得到初步純化；挑取平板上的金黃色單菌落，接種到PDA固體培養(yǎng)平板上，繼續(xù)培養(yǎng)直至菌落生長(zhǎng)成黃色，得到目標(biāo)菌株；所述的PDA固體培養(yǎng)基的制備方法為：馬鈴薯20g洗凈切塊，加入100ml蒸餾水煮沸20min，過濾取上清液并加水補(bǔ)足100mL；加入葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、KH2PO40.3g、MgSO4·7H2O0.25g、維生素B10.01g、瓊脂2g，pH自然(不用調(diào)節(jié))。(2)復(fù)篩：挑取步驟(1)中的目標(biāo)菌株的黃色閉囊殼，放入裝有100mL滅菌生理鹽水與玻璃珠的錐形瓶中，輕輕搖動(dòng)錐形瓶，使菌液均勻，并進(jìn)行10倍梯度稀釋；取10-3—10-6稀釋倍數(shù)的稀釋液分別涂布到PDA培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3d，觀察菌落情況，選取長(zhǎng)有2個(gè)單菌落的平板，得到的菌落即為冠突散囊菌株(簡(jiǎn)稱GT-1)的目標(biāo)單菌落。對(duì)GT-1菌株進(jìn)行形態(tài)分析：GT-1菌株為邊遠(yuǎn)較為整齊的圓形菌落，培養(yǎng)初期，菌落為白色菌絲，隨著時(shí)間的增加，3天后菌落逐漸慢慢變?yōu)榈S色；最終成熟后菌落的邊緣為淡黃色，越往內(nèi)部顏色越深，呈淡褐色，菌落中心部位為褐色；菌落背面無(wú)脊無(wú)褶，呈深褐色。GT-1菌落由菌絲體及子囊果構(gòu)成，子囊果呈球形，內(nèi)部含有孢子，孢子呈球狀。GT-1菌落的菌落形態(tài)與已發(fā)現(xiàn)的散囊菌非常相似。GT-1菌株的電泳圖如圖1所示。經(jīng)18SrDNA序列測(cè)定可知，本發(fā)明的GT-1菌株為冠突散囊菌株(Eurotiumcristatum)，于2016年的10月13日保藏于北京的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13173。實(shí)施例2：發(fā)酵液中的碳源種類對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響是通過下述方法制備而成的：(1)制備孢子懸液：將冠突散囊菌株接種于試管中的斜面PDA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-6天，待斜面上的菌落由白色變?yōu)榈S色再變?yōu)榛液稚笳f明孢子成熟；用生理鹽水沖洗斜面制備孢子懸液，混勻10min后，調(diào)整孢子懸液使其孢子濃度為1×108CFU/mL后立即發(fā)酵，避免孢子失活；PDA固體培養(yǎng)基的制備方法為：馬鈴薯20g洗凈切塊，加入100ml蒸餾水煮沸20min，過濾取上清液并加水補(bǔ)足100mL；加入葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、KH2PO40.3g、MgSO4·7H2O0.25g、維生素B10.01g、瓊脂2g，pH自然(不用調(diào)節(jié))。(2)發(fā)酵：將PDA液體培養(yǎng)基在三角瓶中進(jìn)行分裝，PDA液體培養(yǎng)基的裝液量為40％；于121℃條件下滅菌20min；滅菌后冷卻，放入提前紫外滅菌的無(wú)菌操作臺(tái)中，取步驟(1)得到的GT-1菌株孢子懸液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，接種量為2％；接種后，于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中在25℃、160r/min下發(fā)酵9天，得到GT-1菌株的發(fā)酵液；所述的PDA液體培養(yǎng)基的制備方法為：馬鈴薯20g洗凈切塊，加入100ml蒸餾水煮沸20min，過濾取上清液并加水補(bǔ)足100mL；加入碳源2g、蛋白胨0.2g、KH2PO40.05g、MgSO4·7H2O0.1g。碳源分別為麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，各處理3個(gè)重復(fù)；(3)粗提：將步驟(2)得到的GT-1菌株的發(fā)酵液過濾菌絲體，旋蒸液體的體積至原體積的1/10，然后向其中加入三倍體積的95％乙醇，沉淀大分子糖；12h后在5000r/min下離心10min，取上清液旋蒸并冷凍干燥，得到GT-1菌株發(fā)酵液粗提物，粗提物即為冠突散囊菌株微生物制劑。分別測(cè)量不同碳源的粗提物清除DPPH自由基的作用：將GT-1菌株發(fā)酵液粗提物凍干粉配置成2.5mg/mL的溶液，測(cè)定其抗氧化性。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照管、樣品管、樣參管。向?qū)φ展芎蜆悠饭苤蟹謩e加入2.4mL0.1mMDPPH，樣參管中加入2.4mL無(wú)水乙醇，樣品管和樣參管分別加入0.5mL的樣品，用樣品的浸提試劑將各管補(bǔ)充至4mL。將各管充分混勻后，在黑暗處放置30min后測(cè)A517。DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照]×100％結(jié)果如圖2所示：發(fā)酵培養(yǎng)液中碳源的選擇，對(duì)發(fā)酵液活性物物質(zhì)DPPH自由基清除率有很大的影響。依次以麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖為碳源培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，麥芽糖為碳源的培養(yǎng)液對(duì)DPPH自由基清除率顯著高于其他組，達(dá)到93.1％。實(shí)施例3：發(fā)酵液中的氮源種類對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響方法步驟與實(shí)施例2基本相同，所不同的是，步驟(2)中，碳源為麥芽糖，而氮源分別為硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、酵母膏、蛋白胨，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，各處理3個(gè)重復(fù)；結(jié)果如圖3所示：以酵母膏為氮源的發(fā)酵液中菌株生長(zhǎng)良好，呈規(guī)則的球形，且DPPH自由基清除率顯著高于其他組別，清除率達(dá)到95.3％。以氯化銨、硫酸銨、酵母膏為氮源時(shí)發(fā)酵液粗提物對(duì)DPPH自由基清除率普遍在80％左右，且差異不顯著。實(shí)施例4：發(fā)酵時(shí)間對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響方法步驟與實(shí)施例2基本相同，所不同的是，步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)液中的碳源為麥芽糖、氮源為酵母膏；對(duì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間分別為3、6、9、12、15d，各處理3個(gè)重復(fù)；結(jié)果如圖4所示：隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，發(fā)酵液粗提物對(duì)DPPH自由基清除率也相應(yīng)的增加，在第6天后菌體量迅速增加，DPPH自由基清除率迅速增加，這與菌株生長(zhǎng)狀態(tài)相吻合。發(fā)酵粗提物的DPPH自由基清除率在第9天時(shí)達(dá)到最高，達(dá)到90.9％，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除逐漸下降。實(shí)施例5：裝液量對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響方法步驟與實(shí)施例2基本相同，所不同的是，步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)液中的碳源為麥芽糖、氮源為酵母膏，發(fā)酵時(shí)間為9天，對(duì)裝液量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，裝液量分別為10％、20％、30％、40％、50％，各處理3個(gè)重復(fù)；由圖5可知，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液粗提物對(duì)DPPH自由基清除率反而相應(yīng)的減小，裝液量為10％的時(shí)候，發(fā)酵粗提物的DPPH自由基清除率達(dá)到90.8％，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除逐漸下降。分析可能是由于裝液量低的時(shí)候，培養(yǎng)液中溶解的氧氣較多，利于抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生所致。實(shí)施例6：接種量對(duì)冠突散囊菌株微生物制劑清除DPPH自由基的影響方法步驟與實(shí)施例2基本相同，所不同的是，步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)液中的碳源為麥芽糖、氮源為酵母膏，發(fā)酵時(shí)間為9天，裝液量為10％；對(duì)接種量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，接種量分別為0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％，各處理3個(gè)重復(fù)；由圖6可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液粗提物對(duì)DPPH自由基清除率出現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，接種量為2％的時(shí)候，發(fā)酵粗提物的DPPH自由基清除率達(dá)到90％，之后隨著接種量的增加，DPPH自由基清除下降。實(shí)施例7：制備冠突散囊菌株微生物制劑以實(shí)施例2-6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考，根據(jù)正交試驗(yàn)要求，以發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量3個(gè)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交組合，正交表和結(jié)果表如下所示：表1：正交表表2：正交試驗(yàn)結(jié)果表由上述表1和2可知，在三個(gè)單因素對(duì)結(jié)果的影響順序?yàn)檠b液量＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間，數(shù)據(jù)得出的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間9天、裝液量13％、接種量2.2％，在此發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率為91.8％。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得，最優(yōu)條件下發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基的清除率達(dá)到92.9％。表3：試驗(yàn)結(jié)果方差分析因素偏差平方和自由度F比Fα(α＝0.05)顯著性發(fā)酵時(shí)間(d)7.76223.17919.000裝液量(％)109.262244.74319.000*接種量(％)46.549219.06219.000*誤差2.442注：*表示差異顯著。由表3可知，裝液量與接種量對(duì)GT-1菌株發(fā)酵液提取物清除DPPH自由基影響顯著，發(fā)酵時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。按照正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳條件制備冠突散囊菌株微生物制劑，方法步驟與實(shí)施例2基本相同，所不同的是，步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)液中的碳源為麥芽糖、氮源為酵母膏，發(fā)酵時(shí)間為9天，裝液量為13％，接種量為2.2％，最終得到冠突散囊菌株微生物制劑。應(yīng)用實(shí)施例一：實(shí)施例7得到的冠突散囊菌株微生物制劑的抗氧化作用(1)對(duì)DPPH自由基清除效果DPPH自由基由于結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，因此可以在環(huán)境中穩(wěn)定存在，在體外抗氧化試驗(yàn)中一般選取其為實(shí)驗(yàn)底物進(jìn)行抗氧化研究。DPPH溶于乙醇中顯紫色，在A517nm處有吸收峰。當(dāng)與自由基清除劑接觸后紫色會(huì)消退，在A517nm處吸收減小，吸光度減小的程度與清除劑的清除能力呈數(shù)量關(guān)系，清除能力越強(qiáng)吸光值越小。試管中預(yù)先加入DPPH的乙醇溶液2.4mL后加入樣品0.5mL，混合均勻。用蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至4mL，室溫暗處反應(yīng)0.5h，之后測(cè)定A517nm吸光值。DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照]×100％(2)對(duì)超氧陰離子清除效果采用鄰苯三酚自氧化方法測(cè)定，堿性條件下鄰苯三酚能迅速自氧化釋放超氧陰離子，在A316nm處有最大吸收峰。實(shí)驗(yàn)用4支試管，編號(hào)1、2、3、4，每支加入5mLTris-Hcl，1、2號(hào)加入50μL蒸餾水，2、3號(hào)加入50μL樣品，充分混勻于25℃條件下反應(yīng)20min；1、4號(hào)加入10mM鹽酸40μL，2號(hào)加入25mM鄰苯三酚40μL，計(jì)時(shí)30s后，3號(hào)加入25mM鄰苯三酚40μL,3min后向2號(hào)加入50μLDTT，3min30s后1、3、4號(hào)加入50μLDTT，室溫反應(yīng)15min后出的吸光值。超氧陰離子自由基清除率(％)＝(A2-A3+A4)/A2×100％(3)還原力測(cè)定采用鐵氰化鉀還原測(cè)定法測(cè)定，反應(yīng)體系中，樣品提供電子使Fe3+還原為Fe2+，根據(jù)700nm處吸光值的變化可以得知Fe3+含量的變化，即可反映出體系中還原反應(yīng)進(jìn)行的程度。試管中依次加入1mL樣品、0.2mL0.2mol/L的磷酸緩沖液、0.5mL1％鐵氰化鉀，混勻后50℃水浴20min，加入1mL10％TCA混勻，5000r/min離心10min取1.5mL上清液，加入0.2mL1％FeCl3以及3mL蒸餾水，靜置5min，蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定吸光值。結(jié)果如圖7、8、9所示，由圖7可知：隨著提取物濃度的增加其對(duì)DPPH自由基的清除率也隨之上升。當(dāng)發(fā)酵提取物濃度逐漸達(dá)到1.5mg/mL后，清除速率逐漸放緩，當(dāng)發(fā)酵液提取物的濃度達(dá)到2.5mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率達(dá)到了93.9％，其IC50值為0.78mg/mL。由圖8可知：隨著發(fā)酵液提取物濃度的增加其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率也隨之上升。當(dāng)發(fā)酵液提取物的濃50mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到了95.0％，其IC50值為10.70mg/mL。由圖9可知：發(fā)酵液提取物具有很強(qiáng)的還原性，隨著發(fā)酵液提取物濃度的增加其還原力越強(qiáng)。當(dāng)發(fā)酵液提取物濃度為3mg/mL時(shí)，其還原力為0.98。應(yīng)用實(shí)施例二：實(shí)施例7得到的冠突散囊菌株微生物制劑的抑制乙酰膽堿酯酶的效果用DMSO將提取物配置成不同濃度的溶液，對(duì)其抑制乙酰膽堿酯酶活性進(jìn)行測(cè)定。取4支試管分別編號(hào)1、2、3、4，分別添加pH8.0的磷酸緩沖液2950μL、2880μL、2880μL、2950μL，之后分別加入AchI20μL，DTNB100μL混勻；之后向1、2號(hào)中加入、DMSO100μL，3、4號(hào)中加入待測(cè)樣品100μL，2、3號(hào)中加入70μL乙酰膽堿酯酶，混勻；37℃水浴4min20s后分別添加40％SDS100μL，測(cè)定A412nm。AchE抑制率(％)＝[A2-(A3-A4)/A2]×100結(jié)果如圖10所示：GT-1發(fā)酵液提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的清除效果隨著提取物濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度增加到20mg/mL之后，其增長(zhǎng)速率趨于緩和。當(dāng)發(fā)酵液提取物濃度達(dá)到40mg/mL時(shí)，其對(duì)乙酰膽堿酯酶的清除率達(dá)到92.2％，其IC50值為14.17mg/mL。應(yīng)用實(shí)施例三：實(shí)施例7得到的冠突散囊菌株微生物制劑的抑菌的效果供試菌株的活化:將保藏的供試菌株劃線接種到LB瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h后4℃冰箱儲(chǔ)存。菌液制備：無(wú)菌條件下，挑取一環(huán)活化菌種接種于LB肉湯中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h。用生理鹽水對(duì)菌液進(jìn)行稀釋，使菌懸液細(xì)菌數(shù)量為106-108cfu/mL。打孔法抑菌:吸取制備好的菌懸液0.1mL加入到滅菌平板中，之后向平板中傾注適量的LB瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻，等待完全凝固后，用打孔器打孔。吸取10μL樣品，滴入孔中，37℃倒置培養(yǎng)8-12h，采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑，重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果如表4所示：表4GT-1菌株發(fā)酵液提取物的抑菌效果注：同列中相同上標(biāo)代表數(shù)值間差異不顯著，不同上標(biāo)代表數(shù)值間差異顯著(p＜0.05)由表可知，GT-1菌株發(fā)酵液提取物具有一定的抑菌效果，其抑菌效果隨著發(fā)酵液提取物濃度的增加而增加。上述實(shí)例只是為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思以及技術(shù)特點(diǎn)，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(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