專利名稱：利用冠突散囊菌改善初烤煙葉質(zhì)量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物促進烤煙煙葉微生物醇化(發(fā)酵)方法。
背景技術：
煙葉醇化(發(fā)酵)是煙草加工中改善煙葉品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，其實質(zhì)上是在一定的溫度和濕度條件下，促使煙葉理化特性發(fā)生變化，煙葉香氣和品質(zhì)明顯改善的加工過程。煙葉醇化(發(fā)酵)主要有3個方面的作用:氧化作用，微生物作用，煙葉本身所具有的酶的作用。然而3種作用對煙葉發(fā)酵貢獻如何、主次原因還沒有統(tǒng)一的定論。但研究發(fā)現(xiàn)微生物是推動煙葉醇化發(fā)酵、提高煙葉品質(zhì)香氣不可忽視的重要原因之一。我國學者用從烤煙煙葉上分離鑒定的4個優(yōu)勢菌種處理煙葉，不僅大大縮短了發(fā)酵時間，而且使煙葉品質(zhì)及色香味均有一定的提高。用芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌混合配制成生物制劑(TFA)用于煙葉發(fā)酵，可加速烤煙發(fā)酵，提高煙葉品質(zhì)，并且具有抑制煙葉霉變的作用。也有學者利用4種由優(yōu)勢增香菌種和高生物活性的α-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的煙草發(fā)酵增質(zhì)劑，對人工發(fā)酵和自然陳化過程中的烤煙煙葉的增質(zhì)、增香效果進行了對比研究。發(fā)現(xiàn)煙草發(fā)酵增質(zhì)劑具有促進煙葉內(nèi)部有機物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，加速煙葉發(fā)酵過程、縮短發(fā)酵周期。枯草芽孢桿菌對煙葉的還原糖和蛋白氨基酸含量的變化影響顯著，并使得煙葉發(fā)酵后，雜氣減少，刺激性有所降低，香味略有增加，余味舒適。另外食用菌中的一些菌株對初烤煙葉品質(zhì)的改善也值得關注。微生物發(fā)酵不僅能夠顯著地縮短煙葉醇化時間，而且在一定程度上可以提高煙葉的內(nèi)在質(zhì)量。目前，對煙葉人為添加各種優(yōu)勢微生物及酶制劑來加快煙葉醇化進程、降低有害物質(zhì)、改善煙葉品質(zhì)、提高煙葉吸食安全性、降低生產(chǎn)成本是生物技術在煙葉醇化上應用的熱點。冠突散囊菌ti.um crisiaiw )屬灰綠曲霉,是獲磚茶發(fā)花過程中的優(yōu)勢菌種，對茯磚茶獨特品質(zhì)的形成具有重要的作用。在茶葉發(fā)花過程中冠突散囊菌從茶葉中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，進行自身代謝轉(zhuǎn)化，同時產(chǎn)生各種胞外酶催化茶葉中各種相關物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合、降解、轉(zhuǎn)化，基本完成茯磚茶特有的色、香、味品質(zhì)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化。該菌好氣耐干燥高滲透能力強，生長的pH范圍在3-6，最適生長pH為5，最適生長溫度為28-30°C，最高生長溫度為38°C。冠突散囊菌最主要的特征是具冠狀突起及表面明顯粗糙具小疣的子囊孢子和具小刺的分生孢子，是產(chǎn)生有性型(子囊孢子)和無性型(分生孢子)的全型真菌。溫瓊英將冠突散囊菌接種在以淀粉、單寧、葡萄糖為碳源的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，結果表明該菌能分解老茶中的淀粉和單寧物質(zhì)，減低茶葉苦澀味，使茶葉滋味醇和。冠突散囊菌在發(fā)酵茶葉過程中對部分真菌、細菌和酵母的生長具有不同程度的抑制作用。肖文軍等研究了速溶茯磚茶對小鼠與大鼠的毒理特性，結果表明，茯磚茶屬無毒物。王志剛等研究表明，冠突散囊菌的培養(yǎng)液對鹵蟲無毒性。1994年，王志剛等又用鹵蟲生物法研究了冠突散囊菌的毒性，發(fā)現(xiàn)10株冠突散囊菌菌體提取物在蔗糖酵母浸汁培養(yǎng)`基上培養(yǎng)后均未發(fā)現(xiàn)明顯產(chǎn)毒，進一步證實冠突散囊菌確實是無毒的。在煙葉發(fā)酵與陳化過程中伴隨大量微生物參與活動，通過煙葉的微生物發(fā)酵作用，使煙葉中的一些化學成分發(fā)生變化，微生物消耗或轉(zhuǎn)化了煙葉中的有關成分，同時又產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物或生物量，從而能增強煙葉的抗感染能力，消除煙葉本身的不利因素，提高煙葉的香味質(zhì)量。但在微生物發(fā)酵過程中，還存在微生物誘香安全性的問題，利用微生物改善煙葉內(nèi)在品質(zhì)，煙葉安全性評價是不容忽視的問題。將食品微生物應用于煙葉發(fā)酵，減少有害物質(zhì)的來源，提高煙葉吸食安全性對于煙草行業(yè)發(fā)展有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是:將食品微生物應用于煙葉發(fā)酵，減少有害物質(zhì)的來源，提高煙葉吸食安全性對于煙草行業(yè)發(fā)展有重要作用。本發(fā)明的技術方案是:利用冠突散囊菌改善初烤煙葉質(zhì)量的方法，包含以下步驟:
(1)冠突散囊菌菌株的活化培養(yǎng)
將冰箱保存的斜面菌株置于30°c的培養(yǎng)箱中48小時，用接種針將其接種于新配制的PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)待其菌落長滿斜面后備用；
(2)產(chǎn)分生孢子菌落的培養(yǎng)
制作分生孢子培養(yǎng)基，并將分生孢子培養(yǎng)基制平板，將步驟(I)中菌株斜面的菌落點種于平板上，倒置培養(yǎng)；待菌落長滿平板；
(3)孢子懸液的制備及接種
將步驟(2)的制備的分生孢子，用無菌水洗下并制成孢子懸液；將孢子懸液作為接種體，均勻噴施于初烤煙葉。所述的分生孢子培養(yǎng)基:蔗糖400g，麥芽20g，酵母膏5 g，瓊脂20g，水IOOOmL,121°C 滅菌 30min。所述的步驟(3)中發(fā)酵的最優(yōu)條件為:溫度30°C、濕度70%±2%的條件下接種孢子濃度為IO6個/mL或IO7個/mL并發(fā)酵50天。本發(fā)明的有益效果:理化指標:發(fā)酵的樣品還原糖、水溶性多糖變化幅度較大，蛋白質(zhì)含量有所下降，糖/堿、氮/堿比例變得更為協(xié)調(diào)，在一定程度上降低煙堿含量。說明冠突散囊菌對煙葉的助醇、降害方面效果顯著。人工評吸指標:冠突散囊菌處理后的樣品在香氣質(zhì)、香氣量、吃味上有很大改善，甜感增加，更加柔和，雜氣、刺激性明顯降低?？傮w效果:利用冠突散囊菌發(fā)酵處理后的煙葉質(zhì)量的改觀很明顯，可使香氣前體物質(zhì)、還原性糖含量增加，煙堿和石油醚提取物有不同程度的降低，使化學成分趨于協(xié)調(diào)平衡，雜氣和刺激性減輕，香氣外露，對煙葉品質(zhì)的改善具較明顯的促進作用，并形成獨特的煙質(zhì)特點。
具體實施例方式冠突散囊菌的活化培養(yǎng)
將冰箱保存的斜面菌株置于30°c的培養(yǎng)箱中48小時，用接種針將其接種于新配制的PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)待其菌落長滿斜面后備用。產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)
l.M40y培養(yǎng)基(分生孢子培養(yǎng)基):蔗糖400g，麥芽20g，酵母膏5 g，瓊脂20g，水IOOOmL, pH 自然，121°C滅菌 30min ；2.將M40y培養(yǎng)基制平板，用接種針挑取適量閉囊殼點種于平板中央，于30°C下倒置培養(yǎng)，待菌落長滿平板；
3.平板產(chǎn)生表面黃色、顏色較淺，較密集，有灰綠色分生孢子子的菌落。孢子懸液的制備及接種
挑取活化后的冠突散囊菌采用點接法接種到M40y培養(yǎng)基上，于30°C下培養(yǎng)7天，待產(chǎn)生足夠的分生孢子后，用無菌水洗平板上的菌落，分別制成108，IO7, IO6個/mL三種濃度的孢子懸液，將三種孢子懸液均勻噴施于煙葉。冠突散囊菌DNA提取與擴增
總DNA的提取按照真菌DNA提取的方法進行，采用真菌5.8S rDNA的通用引物ITS4和ITS5:
ITS4 (5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )
ITS5 (5’ -GGT GAGAGATTTCTGTGC-3’ )
以冠突散囊菌DNA為模板，利用PCR反應擴增其5.8rDNA片段。M4ciy培養(yǎng)基上菌落為黃色，菌株形成的菌落較密集，顏色較淺，鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌落基本由菌絲組成，并有灰綠色分生抱子頭產(chǎn)生。
冠突散囊菌是產(chǎn)生有性型(子囊孢子階段)和無性型(分生孢子階段)的全型真菌。閉囊殼球形或近球形，黃色， 直徑90-310 μ m ;子囊球形至近球形,壁薄易破，10.0-17.5 μ m ；子囊孢子雙凸鏡形，具有兩個明顯的冠狀突起，大小為4.0-6.0X 3.0-5.8 μ m，凸面明顯粗糙，具小疣。分生孢子頭輻射狀到柱頭，灰綠色，直徑一般為25-160 μ m，壁光滑；頂囊近球形或燒瓶形，直徑一般為10-45 μ m,瓶梗3.8-9.06X4.0 μ m ;分生孢子橢圓形，少數(shù)近球形，壁粗糙具小刺，大小為3.0-6.0X2.5-5.8 μ m。 冠突散囊菌ITS4-5.8S-1TS5的堿基序列
ATAGAGCTACTGATCGAGGTCACCTGGTTAAAAAGATTGGTTGCGAGGCTAGCTGCCAGCTGGACCTACGGGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCAGACATGGTGCCGCCACTGCCTTTTGGGCCCGTCCCCGTTGCCAGGGACGGAAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAATTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACGATTGTTTAACTAAAAACTCAGACTGCAAACTTCAGACAGCGTTCAAATGTTAGTCTCCGGCGGGCCGTGGCCACGCCGAAGCAACAGGGTACAGATAGACA CGGATGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGCTTTTTTACCTTCCAGGTTACCAACTGAAATTAAGCAAAAAATTTGCACGTTAAAAAAACCACCCAAGGGTCTC在3個溫度和3個孢子濃度的冠突散囊菌孢子對煙葉進行發(fā)酵，實施結果如下:
冠突散囊菌IO6個/mL孢子濃度處理，煙葉在25°C、30°C兩個溫度下，冠突散囊菌對還原糖，水溶性總糖含量提高顯著，有效降低煙堿和蛋白含量，見表1，原因在于在此溫度下該菌分泌的降解酶類將煙葉中的碳水化合物和含氮化合物進行了降解。該菌處理后煙葉經(jīng)評吸測試后，能夠提高香氣質(zhì)和香氣量，改進吃味，減少刺激性和雜氣，增加煙葉甜感和細膩度。但在35°C的發(fā)酵條件下，化學指標檢測結果不如25°C和30°C，原因在于，35°C接近該菌的最高耐受溫度，導致對煙葉處理效果不夠理想，見表I和表2。其中在孢子濃度IO6個/mL,發(fā)酵溫度30°C,處理效果最好。
表I濃度為IO6個/mL的孢子懸液對煙葉發(fā)酵后化學分析檢測結果(％)
權利要求
1.利用冠突散囊菌改善初烤煙葉質(zhì)量的方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)冠突散囊菌菌株的活化培養(yǎng) 將冰箱保存的斜面菌株置于30°c的培養(yǎng)箱中48小時，用接種針將其接種于新配制的PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)待其菌落長滿斜面后備用； (2)產(chǎn)分生孢子菌落的培養(yǎng) 制作分生孢子培養(yǎng)基，并將分生孢子培養(yǎng)基制平板，將步驟(I)中菌株斜面的菌落點種于平板上，倒置培養(yǎng)；待菌落長滿平板； (3)孢子懸液的制備及接種 將步驟(2)的制備的分生孢子，用無菌水洗下并制成孢子懸液；將孢子懸液作為接種體，均勻噴施于初烤煙葉。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用冠突散囊菌改善初烤煙葉質(zhì)量的方法，其特征在于:分生孢子培養(yǎng)基:蔗糖400g，麥芽20g，酵母膏5 g，瓊脂20g，水1000mL，121°C滅菌30min。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用冠突散囊菌改善初烤煙葉質(zhì)量的方法，其特征在于:步驟(3)中發(fā)酵的最優(yōu)條件為:溫度30°C、濕度70%±2%的條件下接種孢子濃度為IO6個/mL或IO7個/mL并發(fā)酵50天。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用冠突散囊菌改善初烤煙葉質(zhì)量的方法，其包含以下步驟(1)冠突散囊菌菌株的活化培養(yǎng)；(2)產(chǎn)分生孢子菌落的培養(yǎng)制作分生孢子培養(yǎng)基，并將分生孢子培養(yǎng)基制平板，將步驟(1)中菌株斜面的菌落點種于平板上，倒置培養(yǎng)5-7天；待閉菌落長滿平板；(3)孢子懸液的制備及接種按步驟(2)的制備的分生孢子，用無菌水洗下并制成孢子懸液；將孢子懸液作為接種體，均勻噴施于初烤煙葉。當處理條件為培養(yǎng)溫度為30℃，孢子濃度為106，107時，初烤煙葉的香氣質(zhì)變好,雜氣和刺激性減輕,煙氣甜感增大、細膩且醇和,余味變得純凈舒適，煙堿有所下降，煙葉總體質(zhì)量得到提高。
文檔編號C12N1/14GK103110180SQ201210565069
公開日2013年5月22日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權日2012年12月24日
發(fā)明者鄒曉, 瞿嬌嬌, 施鳴, 劉仁祥, 張曉敏, 楊輝, 石志發(fā), 曾池, 白興, 劉愛英 申請人:貴州大學, 貴州中煙工業(yè)有限責任公司