本發(fā)明涉及優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選及微生物發(fā)酵飼料技術(shù)，特別涉及一株分離自豬腸道的1可用于生產(chǎn)發(fā)酵飼料的唾液乳桿菌的分離篩選，以及用其接種全價(jià)飼料或飼料原料生產(chǎn)的發(fā)酵飼料。
技術(shù)背景
自上世紀(jì)50年代以來(lái)，飼用抗生素在養(yǎng)殖生產(chǎn)上被大規(guī)模使用，無(wú)論在抗病、防病方面，還是在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)方面都發(fā)揮了巨大的作用。但隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化生產(chǎn)的發(fā)展，添加飼用抗生素帶來(lái)的微生物耐藥性不斷增強(qiáng)及農(nóng)產(chǎn)品中藥物殘留的負(fù)面影響逐步凸顯，世界上許多發(fā)達(dá)國(guó)家已宣布禁用飼用抗生素。隨著我國(guó)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)中飼用抗生素的管制不斷加強(qiáng)，生產(chǎn)中可利用的飼用抗生素種類不斷下降，因此，尋找飼用抗生素替代品也成為當(dāng)前畜牧生產(chǎn)的一大熱點(diǎn)問(wèn)題。在眾多飼用抗生素替代品中，益生素由于具有綠色安全的特點(diǎn)，成為當(dāng)前飼用抗生素的主要替代品。但人們?cè)趯?shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，一些微生態(tài)產(chǎn)品由于劑量太低以及其對(duì)環(huán)境的抗性較差，導(dǎo)致在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果不穩(wěn)定，而且其產(chǎn)品的貨架期也較短。實(shí)際上，微生態(tài)制劑的主要作用機(jī)制在于微生物的代謝產(chǎn)物以及微生物菌體對(duì)宿主的有益效應(yīng)。所以，一些學(xué)者認(rèn)為，如將益生菌株作為接種物，對(duì)飼料進(jìn)行發(fā)酵，使益生素的代謝產(chǎn)物以及益生菌能夠保留在發(fā)酵飼料中，可以使動(dòng)物獲得其代謝產(chǎn)物以及益生菌菌體的雙重功能，這種方法可能會(huì)對(duì)動(dòng)物發(fā)揮更好的效果。因此，研究開(kāi)發(fā)新型益生菌及其制作的發(fā)酵飼料具有廣闊的應(yīng)用前景。
研究表明，發(fā)酵飼料pH一般在4.5以下，含有大量的乳酸等有機(jī)酸、乳酸菌以及其他有益微生物，而發(fā)酵飼料中的有害微生物會(huì)被酸性環(huán)境以及其他抑菌物質(zhì)抑制。當(dāng)前，眾多學(xué)者與生產(chǎn)者認(rèn)為，發(fā)酵飼料將在我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。為獲取可用于發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌株，我們從豬腸道內(nèi)分離獲得一株能抑制大腸桿菌K88、K99以及雞白痢沙門(mén)氏菌且具有良好發(fā)酵性能的唾液乳桿菌，并利用該株乳酸菌發(fā)酵制作發(fā)酵飼料。當(dāng)前，唾液乳桿菌主要用于人類食品以及保健品中，在動(dòng)物養(yǎng)殖上使用的研究很少，本發(fā)明在該菌的分離篩選、性能測(cè)定以及發(fā)酵飼料制作等方面的做了大量研究工作，驗(yàn)證了實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用效果，擬為這株唾液乳桿菌在發(fā)酵飼料中的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本研究的目的在于提供一株能抑制大腸桿菌K88、K99以及雞白痢沙門(mén)氏菌且具有良好發(fā)酵性能唾液乳桿菌，該乳酸菌株可用于生產(chǎn)發(fā)酵飼料，該菌株在發(fā)酵飼料時(shí)可產(chǎn)生大量乳酸，顯著增加飼料中乳酸菌的含量，降低飼料中大腸桿菌的數(shù)量。
一株制作發(fā)酵飼料的唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株和菌種名稱。
本發(fā)明還提供一種制作乳酸菌類發(fā)酵飼料的方法，其特點(diǎn)為制作出的發(fā)酵飼料pH值低于4.5，乳酸濃度高于150mmol/g，含有大量的乳酸菌。
發(fā)酵飼中的乳酸菌數(shù)量可達(dá)到1×108cfu/g。
本發(fā)明提供了制作乳酸菌發(fā)酵飼料的方法，主要包括以下步驟：取活化后的唾液乳桿菌株復(fù)壯，將復(fù)狀菌液以總量8％與2％的糖蜜、20％的水和70％的飼料底物充分混勻，再將混勻物充分混合，將上述混合物放入含有單向閥的塑料袋中壓實(shí)，密封，在37℃條件下發(fā)酵48h，發(fā)酵飼料中水分含量約37％。
菌株的培養(yǎng)活化流程：取保存良好的乳酸菌菌株5％接種至10mL標(biāo)準(zhǔn)MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)24h，按1％數(shù)量接種至復(fù)壯液中，復(fù)壯液具體組分：葡萄糖1.25％；膨化玉米2.5％；糖蜜1.25％；水95％，37℃培養(yǎng)18h-24h，pH值達(dá)到4.5以下即為活化后的種子液。
具體實(shí)施方法
實(shí)例1、豬源乳酸桿菌菌株的獲得
1.1豬源唾液乳桿菌的分離篩選以及鑒定
取大白×長(zhǎng)白二元雜交母豬新鮮糞便，在實(shí)驗(yàn)室中用生理鹽水梯度稀釋至10-4-10-6，而后涂布到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24-36h后，待單菌落出現(xiàn)，挑取菌落進(jìn)行進(jìn)一步劃線純化，菌株純化2-3次，將所獲培養(yǎng)物在4℃冰箱保存，用于形態(tài)學(xué)觀察與生化鑒定。
取干凈載玻片，用接種環(huán)取一環(huán)無(wú)菌生理鹽水于玻片，挑取少量細(xì)菌，在玻片上涂勻，干燥、固定，再染色，鏡檢(16×100)。挑取視野清晰、形態(tài)典型的細(xì)菌涂片，光鏡觀察茵體形態(tài)和純度。革蘭氏染色參照凌代文《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行，共分離乳酸桿菌104株。
乳酸菌的產(chǎn)酸能力測(cè)定，具體過(guò)程如下：取保存的乳酸菌菌株5％接種至10mL標(biāo)準(zhǔn)MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)24h，如此活化兩代。取100uL的活化后的乳酸菌，接種到10mL包含0.01g/L的溴酚藍(lán)指示劑的改良MRS肉湯，30℃條件下厭氧培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)物的顏色(由紫色變?yōu)辄S色)變化時(shí)間，在90h后測(cè)定pH值。為測(cè)定最大產(chǎn)乳酸量，取100uL活化后的乳酸菌接種至10mL含2％CaCO3(w/v)的mMRS培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)48h后取樣，測(cè)定乳酸濃度，每株菌3個(gè)重復(fù)。乳酸的濃度用乳酸試劑盒測(cè)定。
革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧無(wú)芽孢桿菌的鑒定試驗(yàn)包括：過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)。如上述試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，則可初步定為乳酸桿菌屬。
50uL體系用于擴(kuò)增菌株DNA，根據(jù)GenBank中細(xì)菌的16srDNA的序列設(shè)計(jì)通用引物：5′-AGA GTTTGATCCTGG CTC AG-3′，R：5′-GGCTACCTTGTTACG A-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1502bp。引物由Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50uL，94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，59℃退火30s，68℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送華大基因科技有限公司測(cè)序，將所得序列提交GenBank進(jìn)行Blast分析。
初步分離出9株具有良好產(chǎn)酸性能的乳桿菌。
1.2豬源乳酸菌的抗逆性及益生性
乳酸菌要想在腸道發(fā)揮益生作用，要具有快速的生長(zhǎng)速度，這有助于益生菌在腸道的生長(zhǎng)繁殖，而良好產(chǎn)酸性能有助于抑制腸道的有害菌，除此之外，乳酸菌還要能耐受強(qiáng)酸，以保證通過(guò)胃部的強(qiáng)酸性環(huán)境。依據(jù)以上篩選原則，初步分離出9株具有良好產(chǎn)酸性能的乳桿菌進(jìn)行了生長(zhǎng)、耐酸以及體外抑制有害菌試驗(yàn)，針對(duì)乳酸菌菌株的安全性方面，由于細(xì)菌耐藥性的潛在風(fēng)險(xiǎn)以及可能存在的有害性，乳酸菌的耐藥性以及對(duì)小鼠的急性毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
將活化的乳酸菌按1％的接種量接種MRS培養(yǎng)基，分別于接種后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的吸光值(OD)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪出生長(zhǎng)曲線(見(jiàn)圖1)。
將供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)24h，以5％的接種量加入到兩份用鹽酸調(diào)pH為2.5和6.2的MRS培養(yǎng)基中(pH為6.2的培養(yǎng)基為空白對(duì)照)，第一份用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板涂板，置于37℃，培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。第二份37℃處理3h后，再用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板涂板，置于37℃培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即3h的活菌數(shù)，并計(jì)算出乳酸菌的存活率(見(jiàn)表1)。存活率(％)＝(3h的活菌數(shù)/0h的活菌數(shù))×100。
乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h活化2代，將活化好的菌液離心(10000g，4℃，10min)，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾收集備用。將指示菌分別于LB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h。然后，離心(10000g，4℃，10min)，棄上清液，菌體懸浮于滅菌生理鹽水中，再次離心洗滌，最后制成濃度約為3.0×108CFU/mL的菌懸液，備用。將含菌數(shù)為3.0×108CFU/mL的200μL指示菌菌懸液分別接種到瓊脂培養(yǎng)基上，放置2h。 待瓊脂板凝固后用直徑為8mm的牛津杯在瓊脂培養(yǎng)基上打孔，以少量滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂封底。為排除有機(jī)酸的干擾，供試菌上清液應(yīng)經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后分兩組，一組不調(diào)pH，一組用1mol/L的NaOH調(diào)pH為6.5。分別取處理過(guò)的上清液100μL加入到瓊脂板上的孔中，室溫?cái)U(kuò)散3-5h，37℃培養(yǎng)48h。測(cè)量抑菌圈的直徑，每組3個(gè)重復(fù)，取抑菌圈直徑的平均值(見(jiàn)表2)。
在MRS液體培養(yǎng)基中接種5％已活化的菌種，37℃厭氧培養(yǎng)2代，取活化后的菌液進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，耐藥性試驗(yàn)過(guò)程參照ISO 10932/IDF 233標(biāo)準(zhǔn)(ISO.2010)。將各種抗生素稀釋到測(cè)定濃度，再按比例添加到培養(yǎng)皿中，與溫度約為60℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，待其冷卻凝固，即為不同濃度抗生素的MRS瓊脂培養(yǎng)基平皿，根據(jù)各濃度抗生素菌落的生長(zhǎng)情況來(lái)確定最低抑菌濃度(MIC)，各抗生素測(cè)定范圍：氨芐西林(0.065-64μg/mL)，青霉素(0.25-128μg/mL)，紅霉素(0.12-128μg/mL)，恩諾沙星(0.065-64μg/mL)，氟苯尼考(0.5-128μg/mL)，氯霉素(0.25-128μtg/mL)，萬(wàn)古霉素(0.12-256μg/mL)，四環(huán)素(0.25-256μg/mL)，慶大霉素(1-256μg/mL)，鏈霉素(1-256μg/mL)(見(jiàn)表3)。
菌株活化準(zhǔn)備：將乳酸菌在普通MRS瓊脂上活化后，挑取菌落在MRS肉湯中于37℃培養(yǎng)24h備用。參照《現(xiàn)代藥物試驗(yàn)方法》中對(duì)生物制劑的毒性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，選擇純系小白鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，采用經(jīng)口灌胃和腹腔注射途徑對(duì)菌株進(jìn)行毒性試驗(yàn)。分別設(shè)灌胃組、腹腔注射組和空白對(duì)照組，各組隨機(jī)選取健康小鼠10只，雌雄各半。灌胃組：每只灌胃0.5ml/次，調(diào)整菌液活菌數(shù)約4×109CFU/ml，連續(xù)3d，觀察10d，稱重；腹腔注射組：每只腹腔注射菌液0.3ml，菌液活菌數(shù)約3×109CFU/ml，觀察10d，稱重；空白對(duì)照組：灌胃或腹腔注射等量的生理鹽水。動(dòng)物飼養(yǎng)管理：各組嚴(yán)格隔離，采用籠養(yǎng)，自由采食和飲水，環(huán)境溫度保持在25～28℃。期間觀察小白鼠的精神和生理狀態(tài)并記錄。10日后，剖檢小白鼠觀察內(nèi)臟情況(見(jiàn)表4)。
L71號(hào)菌株乳酸較其他菌株對(duì)pH 2.5的耐受能力更強(qiáng)；對(duì)胃環(huán)境的有較強(qiáng)的耐受性；具有良好的產(chǎn)酸特性、抗逆性以及益生特性，表現(xiàn)出不耐藥性并且對(duì)小白鼠無(wú)急性毒性，具備用作發(fā)酵飼料生產(chǎn)接種菌的潛力。對(duì)該菌進(jìn)行16srDNA測(cè)序，經(jīng)比對(duì)顯示，該菌為唾液乳桿菌。
圖1乳酸菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果
表1乳酸菌對(duì)pH 2.5的耐受性結(jié)果
注：右肩標(biāo)相同字母表示無(wú)差異(P＞0.05)，間隔的表示差異顯著(P＜0.05)。
表2乳酸菌對(duì)大腸桿菌及雞白痢菌的抑菌性結(jié)果
注：NE，無(wú)抑制；+，抑菌圈直徑在0-3mm；++，抑菌圈直徑在3-6mm.
表3 9株乳酸菌對(duì)不同抗生素的最低抑制濃度結(jié)果
注：A氨芐西林Ampicillin，P青霉素Penicillin，Er紅霉素Erythromycin，En恩諾沙星Enrolloxacin，F(xiàn)氟苯尼考Florfenicol，C氯霉素Chloramphenicol，V萬(wàn)古霉素Vancomycin，T四環(huán)素Tetracycline
表4乳酸菌對(duì)飼養(yǎng)小鼠體增重的影響項(xiàng)目
注：右肩標(biāo)相同字母表示無(wú)差異(P＞0.05)，間隔的表示差異顯著(P＜0.05)。
1.3乳酸菌發(fā)酵飼料
將L71作為接種物，對(duì)飼料進(jìn)行發(fā)酵，使其代謝產(chǎn)物以及益生菌能夠保留在發(fā)酵飼料中，可以使動(dòng)物獲得其代謝產(chǎn)物以及益生菌菌體的雙重功能，這種方法可能會(huì)有效解決益生素效果不穩(wěn)定的問(wèn)題，乳酸菌類發(fā)酵飼料要保證飼料內(nèi)含有足夠大量的乳酸菌并盡可能減少飼料中的有害菌。
篩選出的L71乳酸菌菌株，主要包括以下步驟：乳酸菌菌株經(jīng)活化后，菌株的培養(yǎng)活化流程：取保存的乳酸菌菌株5％接種至10mL標(biāo)準(zhǔn)MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)24h，1％接種至復(fù)壯液中，復(fù)壯液具體組分：葡萄糖1.25％；膨化玉米2.5％；糖蜜1.25％：水95％，37℃培養(yǎng)18h-24h，pH值達(dá)到4.5以下即為活化后的種子液。取復(fù)壯的種子液以總量8％與2％的糖蜜、20％的水和70％的飼料底物充分混勻，再將混勻物充分混合，將上述混合物放入含有單向閥的塑料袋中壓實(shí)，密封，在37℃條件下發(fā)酵48h，發(fā)酵飼料中水分含量約37％。
發(fā)酵前后對(duì)發(fā)酵瓶稱重，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵飼料的pH值，同時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵飼料中的乳酸含量和常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)(見(jiàn)表5、6)。
將發(fā)酵飼料在無(wú)菌條件下取出到離心管中，加入等量的生理鹽水，混勻后進(jìn)行梯度稀釋10-5-10-8，取稀釋液100μL分別在MRS以及麥康凱瓊脂平板上涂板，置于37℃，乳酸菌厭氧培養(yǎng)48h，大腸桿菌培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每組做四個(gè)平行(結(jié)果見(jiàn)表7)。
L71菌種組的發(fā)酵飼料pH值低于4.2，在乳酸含量上，L71組的乳酸含量達(dá)到了234mmol/g。發(fā)酵飼料中的乳酸菌可達(dá)到1.6×108cfu/g顯著高于原飼料，大腸桿菌可減少到1×102cfu/g以下顯著低于原飼料。顯示出接種L71號(hào)菌株的發(fā)酵飼料具有良好的飼用性質(zhì)。
表5發(fā)酵飼料干物質(zhì)消失率、pH值和乳酸含量；
注：右肩標(biāo)相同字母表示無(wú)差異(P＞0.05)，間隔的表示差異顯著(P＜0.05)。
表6飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平
注：右肩標(biāo)相同字母表示無(wú)差異(P＞0.05)，間隔的表示差異顯著(P＜0.05)。
表7發(fā)酵飼料中乳酸菌和大腸桿菌計(jì)數(shù)的結(jié)果
注：右肩標(biāo)相同字母表示無(wú)差異(P＞0.05)，間隔的表示差異顯著(P＜0.05)。