本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中一種光合細(xì)菌菌劑及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：光合細(xì)菌(PhotosyntheticBacteria，簡(jiǎn)稱PSB)是自然界最廣泛存在的比較古老的、能進(jìn)行光合作用而不產(chǎn)氧的特殊生理類群的原核微生物的總稱，具有原始光能合成體系，能在厭氧條件下進(jìn)行不放氧的光合作用，是水體兼性厭氧層中主要的初級(jí)生產(chǎn)者，并在自然界的碳素、氮素、硫素轉(zhuǎn)化循環(huán)中起重要作用。它包括有紅螺菌科(Phodospirillaceae)、著色菌科(Chromati-aceae)、綠桿菌科(Chlorobiaceae)、綠色絲狀菌科(Chlo-roflexaceae)4科。沼澤紅假單胞菌是光合細(xì)菌的代表菌株之一，屬于紅螺菌科、紅假單胞菌屬，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布12種允許在飼料中直接添加的活體微生物之一。根據(jù)國(guó)家農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)GB20287-2006，液體光合細(xì)菌菌劑的有效活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為≥2.0億/ml,保質(zhì)期≥3個(gè)月。培養(yǎng)基的組成和配比對(duì)沼澤紅假單胞菌的繁殖速度和保藏期長(zhǎng)短均有重要的影響?，F(xiàn)有的研究表明沼澤紅假單胞菌在酵母膏存在的條件下菌體繁殖增快(張玲華,鄺哲師,陳薇,等高活性光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)特性初探[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001(4):37–391)。菌種是菌劑生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，限制沼澤紅假單胞菌菌劑發(fā)展的瓶頸就是高效菌種的選育問(wèn)題和沼澤紅假單胞菌菌劑的制備和保藏問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備成本低(菌株生長(zhǎng)速度快)、保質(zhì)期長(zhǎng)、既能提高雞生產(chǎn)性能又能提高雞免疫功能和雞肉品質(zhì)的光合細(xì)菌菌劑及其制備方法。為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種光合細(xì)菌菌劑。本發(fā)明所提供的光合細(xì)菌菌劑的活性成分是沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，所述沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的菌株號(hào)為981，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNo.10802，以下簡(jiǎn)稱沼澤紅假單胞菌981。所述光合細(xì)菌菌劑具體可由沼澤紅假單胞菌981和載體組成；所述載體具體可為稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮中的至少一種。本發(fā)明所提供的光合細(xì)菌菌劑的制備方法，包括將沼澤紅假單胞菌981在微生物培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到沼澤紅假單胞菌981，將培養(yǎng)得到的沼澤紅假單胞菌981作為光合細(xì)菌菌劑的活性成分，得到光合細(xì)菌菌劑。上述制備方法中，所述微生物培養(yǎng)基可為發(fā)酵培養(yǎng)基B，所述發(fā)酵培養(yǎng)基B由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)由豆芽汁和NaCl組成，所述豆芽汁是用水從豆芽中提取得到的水溶性物質(zhì)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基B中NaCl的含量為0.02-0.1g/L(如0.05g/L)，豆芽汁的含量以豆芽計(jì)是50-150g/L(如100g/L)。上述制備方法中，所述用水從豆芽中提取可為用水將豆芽煮沸30分鐘。上述制備方法中，所述水可為蒸餾水或去離子水。上述制備方法中，所述豆芽可為黃豆芽。本發(fā)明所提供的光合細(xì)菌菌劑的制備方法，包括將沼澤紅假單胞菌981在所述發(fā)酵培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的物質(zhì)，得到所述光合細(xì)菌菌劑。上文中，所述培養(yǎng)可在20-37℃(如28-37℃或30℃)每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1000-1500Lx(1200-1500Lx或1500Lx)的光照條件下培養(yǎng)3天-10天(如3-7天或3天)。由上述任一種制備方法制備的光合細(xì)菌菌劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述光合細(xì)菌菌劑的動(dòng)物飼料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述含有光合細(xì)菌菌劑的動(dòng)物飼料中，所述含有光合細(xì)菌菌劑的動(dòng)物飼料由雞普通飼料和所述光合細(xì)菌菌劑組成；所述雞普通飼料不含有所述光合細(xì)菌菌劑。上述含有光合細(xì)菌菌劑的動(dòng)物飼料中，所述光合細(xì)菌菌劑和所述雞普通飼料的配比滿足2.5×107-5×107cfu(菌落形成單位)沼澤紅假單胞菌981：100g所述雞普通飼料。上述含有光合細(xì)菌菌劑的動(dòng)物飼料中，所述光合細(xì)菌菌劑和所述雞普通飼料的具體配比滿足2.5×107cfu沼澤紅假單胞菌981：100g所述雞普通飼料。上述含有光合細(xì)菌菌劑的動(dòng)物飼料中，所述雞普通飼料除不含有上述光合細(xì)菌菌劑外，其它原料均可與雞常規(guī)飼料相同，如含有能量飼料、蛋白質(zhì)飼料、礦物質(zhì)飼料和維生素飼料；進(jìn)一步，所述雞普通飼料還可含有抗氧化劑。所述雞普通飼料可由能量飼料、蛋白質(zhì)飼料、礦物質(zhì)飼料和維生素飼料組成，也可由能量飼料、蛋白質(zhì)飼料、礦物質(zhì)飼料、維生素飼料和抗氧化劑組成，當(dāng)然，還可以在所述雞普通飼料中再加入防腐劑、著色劑、調(diào)味劑、藥物保健劑、生長(zhǎng)促進(jìn)劑等非營(yíng)養(yǎng)性添加劑。所述能量飼料可為常用的雞能量飼料，如可選自下述物質(zhì)中的至少一種：谷實(shí)、糠麩、薯、草籽和樹實(shí)等。所述蛋白質(zhì)飼料可為常用的雞蛋白質(zhì)飼料，如可選自下述物質(zhì)中的至少一種：大豆粕、棉籽粕、玉米胚芽粕、肉骨粉、菜籽粕、花生粕和葵粕等。所述礦物質(zhì)飼料可選自石粉、碳酸氫鈣、食鹽、貝殼粉、骨粉、磷酸氫鈣、碳酸鈣、食鹽、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸錳、碘化鉀、氧化鋅、亞硒酸鈉和氯化鈷等。所述維生素飼料可為常用的維生素飼料，如可選自下述物質(zhì)中的至少一種：維生素A，維生素D3，維生素E，維生素K3，維生素B1g，維生素B2，維生素B6，維生素B12，煙酸，D-泛酸鈣，生物素，氯化膽堿所述抗氧化劑可為維生素E(α-生育酚)或丁基羥基茴香醚(BHA)。上述光合細(xì)菌菌劑、上述制備方法或上述動(dòng)物飼料在制備提高雞免疫性能和/或提高雞生產(chǎn)性能和/或提高雞肉品質(zhì)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述產(chǎn)品可為微生態(tài)制劑或動(dòng)物飼料。上述光合細(xì)菌菌劑、上述制備方法或上述動(dòng)物飼料在提高雞生產(chǎn)性能和/或提高雞肉品質(zhì)和/或提高雞免疫性能中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述提高雞免疫性能可為下述I1)-I5)中的全部或部分：I1)提高肉雞胸腺指數(shù)；I2)提高肉雞脾臟指數(shù)；I3)提高肉雞法氏囊指數(shù)；I4)提高肉雞紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率；I5)提高肉雞紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率；所述生產(chǎn)性能為下述P1)-P6)中的全部或部分：P1)出欄率；P2)肉料比；P3)蛋白質(zhì)的表觀消化率；P4)鈣的表觀消化率；P5)磷的表觀消化率；P6)體重；所述提高雞肉品質(zhì)為下述Q1)-Q8)中的全部或部分：Q1)提高雞肉的纈氨酸含量；Q2)提高雞肉的蛋氨酸含量；Q3)提高雞肉的苯丙氨酸含量；Q4)提高雞肉的胱氨酸含量；Q5)提高雞肉的酪氨酸含量；Q6)提高雞肉的粗蛋白含量；Q7)降低雞肉的膽固醇含量；Q8)降低雞肉的脂肪含量。本發(fā)明還提供了一種提高雞生產(chǎn)性能和/或改善雞肉品質(zhì)和/或提高雞免疫性能的方法。本發(fā)明所提供的提高雞生產(chǎn)性能和/或改善雞肉品質(zhì)和/或提高雞免疫性能的方法，包括用含光合細(xì)菌菌劑日糧飼喂雞；所述含光合細(xì)菌菌劑日糧由雞普通日糧和所述光合細(xì)菌菌劑組成；所述雞普通日糧不含有所述光合細(xì)菌菌劑。所述含光合細(xì)菌菌劑日糧中，所述光合細(xì)菌菌劑和所述雞普通日糧的配比為滿足2.5×107-5×107cfu(菌落形成單位)所述沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)：100g所述雞普通日糧。上文中，所述動(dòng)物可為雞。所述雞可為肉雞，如艾維茵肉雞或愛拔益加肉雞。上文中，所述雞可為雛雞。本發(fā)明光合細(xì)菌菌劑的活性成分沼澤紅假單胞菌981繁殖速度快，在豆芽汁培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基B)中在30℃、每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1500Lx的光照條件下培養(yǎng)3天菌體含量(有效活菌數(shù))達(dá)2.03×1010cfu/ml，在含酵母提取物培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基A)中在30℃、每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1500Lx的光照條件下培養(yǎng)3天菌體含量(有效活菌數(shù))達(dá)8.37×109cfu/ml。本發(fā)明光合細(xì)菌菌劑在豆芽汁培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基B)中在20℃在每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為500Lx的光照條件下保質(zhì)期達(dá)120天，本發(fā)明光合細(xì)菌菌劑在該條件下保藏120天后，沼澤紅假單胞菌981的含量是26.625×109cfu/ml，是保藏0天的1.31倍。本發(fā)明光合細(xì)菌菌劑既能提高下述I1)-I5)這5種雞免疫性能，又能提高下述Q1)-Q8)這8種雞肉品質(zhì)，又能提高下述P1)-P6)這6種生產(chǎn)性能：I1)提高肉雞胸腺指數(shù)；I2)提高肉雞脾臟指數(shù)；I3)提高肉雞法氏囊指數(shù)；I4)提高肉雞紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率；I5)提高肉雞紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率；P1)出欄率；P2)肉料比；P3)蛋白質(zhì)的表觀消化率；P4)鈣的表觀消化率；P5)磷的表觀消化率；P6)體重；Q1)提高雞肉的纈氨酸含量；Q2)提高雞肉的蛋氨酸含量；Q3)提高雞肉的苯丙氨酸含量；Q4)提高雞肉的胱氨酸含量；Q5)提高雞肉的酪氨酸含量；Q6)提高雞肉的粗蛋白含量；Q7)降低雞肉的膽固醇含量；Q8)降低雞肉的脂肪含量。保藏說(shuō)明菌種名稱：沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)菌株編號(hào)：981保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CGMCC地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏日期：2015年5月11日保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCCNo.10802具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的分離鑒定1.1菌株分離從中國(guó)江蘇省無(wú)錫市的一個(gè)水池中采集水樣。采用vanNeil紫色非硫細(xì)菌富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，先后富集三次，直到培養(yǎng)基中光合細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)菌群。將富集以后的光合細(xì)菌樣品分別在光合細(xì)菌分離固體培養(yǎng)基上劃線分離單菌落，28℃厭氧罐內(nèi)光照培養(yǎng)24小時(shí)。將平板上的單菌落挑出到液體光合細(xì)菌分離培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。并重復(fù)以上的步驟，得到純化的菌株。取編號(hào)為981的菌株(菌株981)進(jìn)行下述鑒定。其中，vanNeil紫色非硫細(xì)菌富集培養(yǎng)基的配制方法如下:NH4Cl0.1g，NaCl0.2g，NaH2P040.05g，MgCl20.02g，酵母膏0.15g，將以上各組分溶解于100ml水，121℃蒸汽滅菌20min，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的10％NaHCO3水溶液50ml，過(guò)濾除菌的乙醇1.5ml，用過(guò)濾除菌的磷酸調(diào)pH值7.0。光合細(xì)菌分離培養(yǎng)基的配制方法如下:乙酸鈉3.0g，丙酸鈉0.3g，NaCl1.0g，(NH4)2SO40.3g，MgSO40.2g，KH2P040.5g，K2HSO40.3g，CaC1250mg，MnSO42.5mg，F(xiàn)eSO45mg，酵母膏0.1g，蛋白胨10mg，谷氨酸0.2mg，水1000ml，pH7.4。將以上組分溶于水后調(diào)pH，然后121℃蒸汽滅菌30min，如果配置固體培養(yǎng)基則在以上的成分中加入17g瓊脂再蒸汽滅菌，傾倒平板，做無(wú)菌檢測(cè)后用于分離單菌落。1.2菌株鑒定菌株981菌體桿狀，偶有微彎，大小為0.5-0.8×1.0-2.5um，端生單鞭毛運(yùn)動(dòng)的光能異養(yǎng)菌。革蘭氏陰性，光合內(nèi)膜系統(tǒng)呈片層狀。光照厭氧條件下培養(yǎng)物為深紅色，黑暗好氧則為淺紅色，老齡菌聚集成玫瑰花狀。對(duì)氨基苯甲酸為必需生長(zhǎng)因子。該菌具有菌綠素a和標(biāo)準(zhǔn)紫紅醚系的類紅蘿卜素，能利用甲酸鹽、乙酸鹽、丙酮酸、乳酸鹽、琥珀酸鹽、丙三醇、天冬氨酸、苯甲酸鹽、硫代硫酸鈉以及氫氣等小分子有機(jī)物為光合作用的電子供體，不能利用單糖、糖醇和硫化物。生長(zhǎng)pH范圍5.5-8.5，最適pH6.8-7.0。生長(zhǎng)溫度范圍20-37℃，最適溫度范圍28-37℃。菌株981的16SrRNA基因序列如序列表中的序列1所示，與沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的同源性最高，達(dá)到99％。因此，綜合以上特征確定菌株981為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981已于2015年05月11日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.10802。實(shí)施例2、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的培養(yǎng)本實(shí)施例采用發(fā)酵培養(yǎng)基A和發(fā)酵培養(yǎng)基B這兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802。發(fā)酵培養(yǎng)基A是目前認(rèn)為最適合沼澤紅假單胞菌的含酵母提取物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基B是本發(fā)明的發(fā)明人篩選到的培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基A的配制方法如下：將胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g和MgSO4·7H2O0.5g溶于蒸餾水后，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到培養(yǎng)基A。發(fā)酵培養(yǎng)基B的配制方法如下：將100g(鮮重)黃豆芽用蒸餾水煮沸30分鐘，過(guò)濾收集全部濾液，該濾液即為豆芽汁，向全部豆芽汁中加入0.05gNaCl，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到培養(yǎng)基B。其中，黃豆芽由胚根、胚芽、胚軸和子葉組成，胚根長(zhǎng)度為1-2cm。1、菌種的活化挑取沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802，對(duì)其用優(yōu)選固體培養(yǎng)基進(jìn)行斜面穿刺培養(yǎng)，保持溫度30℃光照強(qiáng)度為1200Lx條件下培養(yǎng)10d。優(yōu)選固體培養(yǎng)基是在發(fā)酵培養(yǎng)基A中加入瓊脂得到的固體培養(yǎng)基，具體配制方法如下：將胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g、MgSO4·7H2O0.5g和17g瓊脂溶于蒸餾水后，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到優(yōu)選固體培養(yǎng)基。2、制備種子液將步驟1活化的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802接種于裝有實(shí)施例2的發(fā)酵培養(yǎng)基A的無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍(lán)蓋，在30℃、每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1200Lx的光照條件下培養(yǎng)5天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液。3、發(fā)酵培養(yǎng)3.1利用發(fā)酵培養(yǎng)基B培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802將步驟2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液10ml接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基B的100ml無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍(lán)蓋，在30℃、每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1500Lx的光照條件下培養(yǎng)3天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基B的發(fā)酵液(簡(jiǎn)稱發(fā)酵液B)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)10個(gè)藍(lán)蓋試劑瓶。3.2利用發(fā)酵培養(yǎng)基A培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802該步驟與3.1的區(qū)別僅在于所用的發(fā)酵培養(yǎng)基不同，其它條件均相同，具體方法如下：將步驟2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液10ml接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基A的100ml無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍(lán)蓋，在30℃、每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1500Lx的光照條件下培養(yǎng)3天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基A的發(fā)酵液(簡(jiǎn)稱發(fā)酵液A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)10個(gè)藍(lán)蓋試劑瓶。對(duì)3.1的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基B的發(fā)酵液和3.2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基A的發(fā)酵液按照平板稀釋計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)：量取10ml(精確到0.01ml)發(fā)酵液，放入內(nèi)裝90ml無(wú)菌水的三角瓶中，置搖床振蕩30min，轉(zhuǎn)速200r/min。振蕩后靜置20min制成1：10的均勻稀釋液。采用10倍稀釋法稀釋。用滅菌吸管吸取1：10稀釋液5ml，注入含有45ml無(wú)菌水的三角瓶中，制成1：100的稀釋液，依次制成10倍遞增稀釋液。選取三個(gè)合適稀釋度懸液各取0.1ml，加至直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，倒入45℃優(yōu)選固體培養(yǎng)基，輕輕混勻，待凝固。每個(gè)稀釋度重復(fù)三次。保持溫度30℃光照強(qiáng)度為1200Lx條件下培養(yǎng)10d。計(jì)算菌數(shù)：菌體含量(cfu/ml)＝菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×基礎(chǔ)液體積/(樣品量×加樣量)。結(jié)果表明，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基A的發(fā)酵液中的菌體含量平均為8.37×109cfu/ml，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基B的發(fā)酵液中的菌體含量平均為2.03×1010cfu/ml，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基B的發(fā)酵液中的菌體含量是沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基A的發(fā)酵液中的菌體含量的2.42倍。表1、不同發(fā)酵液的菌體含量實(shí)施例3、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802增強(qiáng)肉雞免疫功能和體重1、材料1.1、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑的制備向?qū)嵤├?的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基B的發(fā)酵液中加入稻殼粉在50℃進(jìn)行干燥，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑。該沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑中的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量為1×109cfu/g。其中，稻殼粉事先經(jīng)過(guò)微粉化處理(90％的粉體粒度小于100μm，平均粒徑小于50μm，所述平均粒徑為50％粉體粒徑)。1.2、試驗(yàn)動(dòng)物選擇體重為50±5克的愛拔益加—快大型白羽肉雞的1日齡健雛，隨機(jī)均分為3個(gè)處理組，即對(duì)照組、菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組。每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)300只雞。1.3、日糧下述實(shí)施例中的肉雞普通日糧的配方如表2所示。表2、肉雞普通日糧組成及配比表2中，每千克預(yù)混料含:CuSO4·5H2O0.64g,FeSO4·H2O516g,ZnSO4·H2O4g,MnSO4·H2O318g,Na2SeO30.016g,VA16IU,VD3415IU,VE400IU,VK90mg,VB160mg,VB2200mg,煙酸550mg,泛酸鈣220mg,葉酸12mg，其余為石粉。表2中的“％”為質(zhì)量百分含量。肉雞育雛期日糧分為肉雞育雛期普通日糧、菌劑Ⅰ組育雛期日糧和菌劑Ⅱ組育雛期日糧。其中，肉雞育雛期普通日糧如表2所示；菌劑Ⅰ組育雛期日糧是在表2的肉雞育雛期普通日糧中添加是表2的肉雞育雛期普通日糧質(zhì)量的0.025％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧；菌劑Ⅱ組育雛期日糧是在表2的肉雞育雛期普通日糧中添加是表2的肉雞育雛期普通日糧質(zhì)量的0.05％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧。肉雞育成期日糧分為肉雞育成期普通日糧、菌劑Ⅰ組育成期日糧和菌劑Ⅱ組育成期日糧。其中，肉雞育成期普通日糧如表2所示；菌劑Ⅰ組育成期日糧是在表2的肉雞育成期普通日糧中添加是表2的肉雞育成期普通日糧質(zhì)量的0.025％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧；菌劑Ⅱ組育成期日糧是在表2的肉雞育成期普通日糧中添加是表2的肉雞育成期普通日糧質(zhì)量的0.05％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧。2、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞免疫器官指數(shù)和紅細(xì)胞免疫功能試驗(yàn)期28天，試驗(yàn)期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養(yǎng)條件完全相同。其中，對(duì)照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂。分別于14日齡、21日齡、28日齡測(cè)定肉雞的脾臟、胸腺和法氏囊指數(shù)。測(cè)定方法為：每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取20只雞，早晨空腹稱重，屠宰后摘取脾臟、法氏囊以及兩側(cè)胸腺，剔除脂肪后用電子天平稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)＝免疫器官重(mg)/體重(g)。按照如下方法測(cè)定21日齡肉雞紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)(E-C3bR)率和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)(E-ICR)率：每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取6只雞，采血抗凝，離心取紅細(xì)胞，配成1.25×107個(gè)/mL的紅細(xì)胞懸液，作為待測(cè)紅細(xì)胞懸液。將酵母菌用生理鹽水洗滌3次后，配成1％懸液，置水浴內(nèi)煮沸20min，充分混勻。用二層定性濾紙過(guò)濾，除去小凝塊，在低倍鏡下呈單個(gè)酵母菌細(xì)胞分散狀態(tài)。加等量小白鼠血清，混勻后置37℃水浴致敏15min。用生理鹽水洗滌一次，2500r/min離心10min。去盡上清，用生理鹽水重混懸。計(jì)數(shù)后配成1×108/ml補(bǔ)體(C3)致敏的酵母菌懸液。按照如下步驟進(jìn)行測(cè)定：(1)取兩支小試管，每管加待測(cè)紅細(xì)胞懸液100ul，第一管再加補(bǔ)體致敏酵母菌懸液100ul，第二管加未致敏的酵母菌懸液100ul，搖勻放37℃水浴30min；(2)取出用手腕輕輕搖勻，加生理鹽水200ul；(3)混勻后，再加0.25％戊二醛75μl并輕輕混勻；(4)分別取1/3量水平涂片、吹干、加甲醇固定；(5)用瑞氏法染色，油鏡下計(jì)數(shù)。涂片染色后RBC為紅色，酵母菌為藍(lán)色。紅細(xì)胞上粘附2個(gè)或2個(gè)以上酵母菌者為花環(huán)。分別計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，算出花環(huán)陽(yáng)性細(xì)胞百分率。第一管為RBC-C3b受體花環(huán)率，第二管為RBC-IC花環(huán)率?；ōh(huán)形成百分率(％)＝(紅細(xì)胞花環(huán)數(shù)/200)×100。試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如表3所示，14日齡和21日齡時(shí)，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的脾臟指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；14日齡時(shí)，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的胸腺指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組其它日齡的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肉雞脾臟、法氏囊和胸腺的發(fā)育具有促進(jìn)作用。表3、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響(mg/g)注：同行數(shù)據(jù)標(biāo)注不同小寫字母者差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注不同大寫字母者差異極顯著(P<0.01)。如表4所示，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的(E-C3bR)率和(E-ICR)率均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，并且菌劑Ⅰ組的(E-C3bR)率和(E-ICR)率均極顯著高于菌劑Ⅱ組。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)雞紅細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用。表4、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)21日齡肉雞紅細(xì)胞花環(huán)率的測(cè)定結(jié)果(％)注：同列數(shù)據(jù)標(biāo)注不同小寫字母者差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注不同大寫字母者差異極顯著(P<0.01)。3、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞體重試驗(yàn)期42天，試驗(yàn)期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養(yǎng)條件完全相同。其中，對(duì)照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進(jìn)行飼喂，在第29-42日齡用表2的肉雞育成期普通日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂，在第29-42日齡用菌劑Ⅰ組育成期日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂，在第29-42日齡用菌劑Ⅱ組育成期日糧進(jìn)行飼喂。測(cè)定試驗(yàn)期間肉雞的體重。測(cè)定方法為：分別于7日齡、14日齡、21日齡、28日齡、42日齡分別稱重一次，清晨禁食禁水稱重。稱重時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取100只雞，分別記錄。試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，7日齡時(shí)，各組肉雞體重差異不顯著(P＞0.05)；14日齡至42日齡時(shí)，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的肉雞活重均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)提高肉雞活重具有良好的促進(jìn)作用。表5、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肉雞活重的影響(g)日齡(d)對(duì)照組菌劑Ⅰ組菌劑Ⅱ組7196.2±3.84ab207.6±4.08a184.3±4.15b14312.5±6.53b338.7±6.25a332.1±7.99a21718.6±16.28b759.5±15.10a751.3±14.52a281168.1±18.77b1295.9±14.28a1265.2±16.22a351560.9±18.79b1714.2±21.35a1703.3±19.01a421898.9±21.02b2095.8±22.21a2085.2±20.12a注：表中同行的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無(wú)顯著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。實(shí)施例4、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞生產(chǎn)性能和改善肉雞肌肉品質(zhì)1、材料1.1、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑的制備向?qū)嵤├?的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基B的發(fā)酵液中加入稻殼粉在50℃進(jìn)行干燥，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑。該沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑中的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量為1×109cfu/g。其中，稻殼粉事先經(jīng)過(guò)微粉化處理(90％的粉體粒度小于100μm，平均粒徑小于50μm，所述平均粒徑為50％粉體粒徑)。1.2、試驗(yàn)動(dòng)物選擇體重為50±5克艾維茵—白羽肉雞的1日齡健雛，隨機(jī)均分為3個(gè)處理組，即對(duì)照組、菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組。每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)300只雞。1.3、日糧同實(shí)施例3的1.3。2、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞生產(chǎn)性能試驗(yàn)期47天，試驗(yàn)期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養(yǎng)條件完全相同。其中，對(duì)照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進(jìn)行飼喂，在第29-47日齡用表2的肉雞育成期普通日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅰ組育成期日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅱ組育成期日糧進(jìn)行飼喂。測(cè)定試驗(yàn)期間肉雞的死亡率、出欄率、采食量以及料肉比。于第36日齡至47日齡采集肉雞糞樣和日糧樣品，以內(nèi)源指示劑法(4mol/L鹽酸不溶灰分)測(cè)定肉雞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。日糧和糞樣中的粗蛋白(CP)含量采用GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測(cè)定方法，鈣含量采用NY/T1944-2010飼料中鈣的測(cè)定(原子吸收分光光譜法)，磷含量采用GB/T6437-2002飼料中總磷的測(cè)定(分光光度法)。計(jì)算公式如下：死亡率(％)＝死亡雞只數(shù)(只)/入舍雞只數(shù)(只)×100；出欄率(％)＝出欄雞只數(shù)(只)/入舍雞只數(shù)(只)×100；平均日采食量＝(配料總量—剩料量)/試驗(yàn)天數(shù)*每組雞數(shù)平均日增重＝(試驗(yàn)?zāi)┢骄w重—試驗(yàn)初平均體重)/試驗(yàn)天數(shù)料肉比＝平均日采食量/平均日增重。日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(％)＝[1-(b/a)×(c/d)]×100。其中，a為日糧中某營(yíng)養(yǎng)成分的含量(％)；b為糞便中某營(yíng)養(yǎng)成分的含量(％)；c為日糧中鹽酸不溶灰分的含量(％)；d為糞便中鹽酸不溶灰分的含量(％)。試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，菌劑Ⅰ組的料肉比顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表6)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981能夠降低肉雞料肉比。表6、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肉雞料肉比的影響處理料肉比對(duì)照組1.98a菌劑Ⅰ組1.83b菌劑Ⅱ組1.94ab注：同列標(biāo)注不同字母為差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的死亡率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的出欄率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表7)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981能夠降低肉雞死亡率，提高出欄率。表7、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肉雞死亡率的影響注：同列標(biāo)注不同字母為差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的粗蛋白(CP)表觀消化率、鈣(Ca)表觀消化率、磷(P)表觀消化率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表8)。說(shuō)明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981可提高肉雞粗蛋白表觀消化率、鈣表觀消化率和磷表觀消化率。表8、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肉雞日糧表觀消化率的影響注：同列標(biāo)注不同字母為差異顯著(P<0.05)。3、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802改善肉雞肌肉品質(zhì)試驗(yàn)期47天，試驗(yàn)期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養(yǎng)條件完全相同。其中，對(duì)照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進(jìn)行飼喂，在第29-47日齡用表2的肉雞育成期普通日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅰ組育成期日糧進(jìn)行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進(jìn)行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅱ組育成期日糧進(jìn)行飼喂。試驗(yàn)期結(jié)束前一天，每重復(fù)選取體重相近的雞3只，頸部放血屠宰，宰前禁食12h。測(cè)定雞全身肌肉中膽固醇含量、粗蛋白含量和氨基酸含量。3.1膽固醇含量按照GB/T5009.128-2003《食品中膽固醇的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。3.2粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定稱取肉樣，然后用組織搗碎機(jī)搗碎，放入烘箱恒溫烘干。在消解管中加入2g肉樣、2.5g抗氧化劑和10mL濃硫酸，然后在高溫消解爐上進(jìn)行樣品消化。應(yīng)用凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式為：粗蛋白％＝(A-A0)×0.014×6.25×0.1612/W×100％A0為空白對(duì)照，W為肉樣重(g)，0.1612為硫酸濃度，A為機(jī)讀數(shù)。3.3粗脂肪含量測(cè)定取肉樣，然后用組織搗碎機(jī)搗碎混勻，在烘箱中恒溫烘干，在濾紙筒內(nèi)放置1g樣品；烘干濾紙筒，直至稱量為恒重，在脂肪測(cè)定儀上進(jìn)行粗脂肪的測(cè)定。3.4氨基酸含量測(cè)定按照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的肌肉的膽固醇含量和粗脂肪含量顯著低于對(duì)照組，粗蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表9)。說(shuō)明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802可以有效地改善肉雞肉質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分。表9、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響檢測(cè)指標(biāo)對(duì)照組菌劑Ⅰ組菌劑Ⅱ組膽固醇(mg/100g)79.63±1.59a75.58±1.35b75.81±1.55b粗蛋白(％)24.71±0.26b26.72±0.21a26.39±0.27a粗脂肪(％)4.46±0.19a3.62±0.15b3.79±0.18b注：同行標(biāo)注不同字母為差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組肌肉的纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其它氨基酸含量沒有顯著差異(表10)。纈氨酸含量的增加，可以使血漿中丙氨酸升高，并且提高動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能；蛋氨酸含量的增加，可以提高機(jī)體免疫力、降低日糧粗蛋白質(zhì)水平，同時(shí)在一定的程度上提高生產(chǎn)性能；賴氨酸的升高，可以提高胃液分泌功效，起到增進(jìn)食欲、促進(jìn)生長(zhǎng)與發(fā)育的作用，提高鈣的吸收及其在體內(nèi)的積累，加速骨骼生長(zhǎng)。說(shuō)明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802可以提高雞肌肉的纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量。表10、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對(duì)肌肉氨基酸含量的影響注：同行標(biāo)注不同字母為差異顯著(P<0.05)。實(shí)施例4、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的保存1、菌種的活化挑取沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802，對(duì)其用優(yōu)選固體培養(yǎng)基進(jìn)行斜面穿刺培養(yǎng)，保持溫度30℃光照強(qiáng)度為1200Lx條件下培養(yǎng)10d。優(yōu)選固體培養(yǎng)基是在發(fā)酵培養(yǎng)基A中加入瓊脂得到的固體培養(yǎng)基，具體配制方法如下：將胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g、MgSO4·H2O0.5g和17g瓊脂溶于蒸餾水后，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到優(yōu)選固體培養(yǎng)基。2、制備種子液將步驟1活化的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802接種于裝有實(shí)施例2的發(fā)酵培養(yǎng)基A的無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍(lán)蓋，在30℃、每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1200Lx的光照條件下培養(yǎng)5天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液。3、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液10ml接入裝有100ml實(shí)施例2的發(fā)酵培養(yǎng)基B的100ml無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍(lán)蓋，在30℃、每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為1500Lx的光照條件下培養(yǎng)3天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發(fā)酵培養(yǎng)基B的發(fā)酵液(簡(jiǎn)稱發(fā)酵液B)，該發(fā)酵液B即為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)10個(gè)藍(lán)蓋試劑瓶。4、保藏將步驟3的發(fā)酵液B進(jìn)行B1和B2這兩種保藏：B1、在光照強(qiáng)度為500Lx的光照條件下進(jìn)行保藏將步驟3發(fā)酵剛結(jié)束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑轉(zhuǎn)入無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑裝至瓶口，擰緊藍(lán)蓋，置于20℃在每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為500Lx的光照條件下分別放置30天、60天、90天、120天、150天、180天和210天后，按照實(shí)施例2的平板稀釋計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。將步驟3發(fā)酵剛結(jié)束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑記為放置0天。每個(gè)處理重復(fù)三次，每次重復(fù)10個(gè)藍(lán)蓋試劑瓶。B2、在光照強(qiáng)度為10Lx的光照條件下進(jìn)行保藏該步驟與B1的區(qū)別僅在于光照強(qiáng)度不同，其它條件均相同，具體方法如下：將步驟3發(fā)酵剛結(jié)束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑轉(zhuǎn)入無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑裝至瓶口，擰緊藍(lán)蓋，置于20℃在每天24小時(shí)的光照強(qiáng)度為10Lx的光照條件下分別放置30天、60天、90天、120天、150天、180天和210天后，按照實(shí)施例2的平板稀釋計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。將步驟3發(fā)酵剛結(jié)束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑記為放置0天。每個(gè)處理重復(fù)三次，每次重復(fù)10個(gè)藍(lán)蓋試劑瓶。結(jié)果表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B1條件下保藏120天后，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(簡(jiǎn)稱沼澤紅假單胞菌981)的含量是26.625×109cfu/ml，是保藏0天的1.31倍，保藏150天后沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(簡(jiǎn)稱沼澤紅假單胞菌981)的含量是12.375×109cfu/ml，是保藏0天的0.61倍；沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B2條件下保藏60天后沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(簡(jiǎn)稱沼澤紅假單胞菌981)的含量是12.0×109cfu/ml，是保藏0天的0.59倍(表11)。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B1條件下的保質(zhì)期為120天，在B2條件下的保質(zhì)期為60天。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B1條件下滿足農(nóng)業(yè)微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)(GB20287-2006)中關(guān)于液體劑型菌劑有效活菌數(shù)大于等于2.0億cfu/ml，保質(zhì)期大于等于三個(gè)月的規(guī)定。表11、B1和B2保藏不同時(shí)間后的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑中沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3