本發(fā)明屬于微生物制備聚羥基脂肪酸酯的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株木質(zhì)素降解細(xì)菌的用途，具體涉及一種利用木質(zhì)素降解菌合成生物塑料前體—聚羥基脂肪酸酯的方法。

背景技術(shù)：

石油化工類塑料已成為人類應(yīng)用最多的一種材料。2010年，全球塑料生產(chǎn)量達(dá)到近3×10⁸t，預(yù)計(jì)2050年將達(dá)到近4×10⁸t。然而，國(guó)際石油儲(chǔ)量卻在逐年降低，同時(shí)石油化工類塑料的環(huán)境污染逐漸加重。因此，開(kāi)發(fā)新型石油化工類塑料的替代品刻不容緩。聚羥基脂肪酸酯具有與傳統(tǒng)塑料相似的力學(xué)性能，可被微生物等完全降解進(jìn)入自然界生態(tài)循環(huán)，被認(rèn)為是重要的石油化工類塑料的替代品。聚羥基脂肪酸酯還具有多變性、壓電性能、熱塑性、生物可降解性、良好的生物相容性等特點(diǎn)，使其在生物降解材料、日用化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域都具有很好的應(yīng)用前景。值得一提的是，聚羥基脂肪酸酯是唯一一個(gè)完全由微生物合成的天然高分子基材料。因此，聚羥基脂肪酸酯的微生物制備方法引起了世界科學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注。然而，微生物發(fā)酵制備聚羥基脂肪酸酯的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還未能實(shí)現(xiàn)，當(dāng)前的生產(chǎn)能力遠(yuǎn)滿足不了巨大的市場(chǎng)需求，其原因在于微生物合成聚羥基脂肪酸酯的生產(chǎn)成本比用化學(xué)法合成石油化工類塑料高得多。研究表明，聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)工藝中，含碳原料費(fèi)用>40％，因此降低碳源及其預(yù)處理成本是實(shí)現(xiàn)聚羥基脂肪酸酯工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化的當(dāng)務(wù)之急。

木質(zhì)素是一種自然界中廣泛存在的芳香性高聚物，也是造紙工業(yè)廢水主要成分，目前國(guó)內(nèi)外正在不斷開(kāi)發(fā)木質(zhì)素降解及再利用技術(shù)。已有研究表明微生物以芳香族為碳源合成的聚羥基脂肪酸酯具有較好的熱穩(wěn)定性。通常，微生物利用木質(zhì)素作為碳源時(shí)，培養(yǎng)基中需要添加共基質(zhì)(如葡萄糖)以促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)和提高酶活性。然而，共基質(zhì)的存在會(huì)增加水中有機(jī)物的含量，且不利于后續(xù)聚羥基脂肪酸酯的提純和分離。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)能夠以木質(zhì)素為單一碳源進(jìn)行降解，同時(shí)形成聚羥基脂肪酸酯的微生物。本發(fā)明利用從被微生物腐蝕的三國(guó)吳簡(jiǎn)浸泡液中分離得到的一株木質(zhì)素降解菌(Cupriavidus basilensis B-8)CGMCC No.4240則實(shí)現(xiàn)了這一目標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用木質(zhì)素降解菌簡(jiǎn)單、高效合成生物塑料前體—聚羥基脂肪酸酯的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的：一株木質(zhì)素降解細(xì)菌的用途，所述的木質(zhì)素降解細(xì)菌(Cupriavidus basilensis B-8)的保藏編號(hào)為CGMCC No.4240，用于生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯。生產(chǎn)時(shí)用的培養(yǎng)基采用堿木質(zhì)素作為唯一碳源。堿木質(zhì)素碳源無(wú)需任何預(yù)處理。堿木質(zhì)素濃度為1～6g/L。氮源濃度低于60mg/L。具體的培養(yǎng)基配方為堿木質(zhì)素1～6g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCl₂ 0.1g，F(xiàn)eSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH值為7.0～7.4。

具體操作是在試管中加入5mL的LB培養(yǎng)基，接入Cupriavidus basilensis B-8菌株的單菌落，30℃和150rpm條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，直至細(xì)菌在600nm處的光密度達(dá)到1.0；將培養(yǎng)物離心、沖洗，再接種至含有100mL生產(chǎn)時(shí)用的培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃和150rpm條件下振蕩培養(yǎng)48h。形成的聚羥基脂肪酸酯為聚羥基丁酸的均聚物。

本發(fā)明提供的木質(zhì)素降解菌為從被微生物腐蝕的三國(guó)吳簡(jiǎn)浸泡液中分離得到的Cupriavidus basilensis B-8。

根據(jù)菌落菌體形態(tài)特征和基于細(xì)菌16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，將該菌鑒定為Crpriavidus菌，命名為Curpriavidus sp.。該菌已于2010年10月22日保藏在地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No.4240。該菌可直接利用為經(jīng)過(guò)任何物化處理的堿木質(zhì)素作為碳源。

發(fā)明人根據(jù)湖南長(zhǎng)沙簡(jiǎn)牘博物館收藏的一批走馬樓出土的三國(guó)時(shí)期吳國(guó)竹簡(jiǎn)，在出土后保存過(guò)程中，爆發(fā)了竹簡(jiǎn)蝕斑病，竹簡(jiǎn)竹體被微生物侵蝕，其中的木質(zhì)素、纖維素被某種或某群微生物所降解，蝕斑中的竹簡(jiǎn)竹體變?yōu)榘胪该髂钗镔|(zhì)，并且容易破裂脫落，從該批竹簡(jiǎn)的浸泡液中分離篩選出本發(fā)明菌株。

本發(fā)明菌株的分離、純化和篩選過(guò)程為：

將長(zhǎng)沙簡(jiǎn)牘博物館密封保藏的竹簡(jiǎn)浸泡液分別接種豐富培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)物以稀釋平板法結(jié)合劃線分離法在相應(yīng)的固體平板上進(jìn)行分離，直至獲得各種微生物的純培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為30℃。將分離得到的菌株純培養(yǎng)接種到以木質(zhì)素為唯一碳源的固定平板篩選培養(yǎng)基上，放入生化培養(yǎng)箱中在30℃下恒溫靜置培養(yǎng)，每天觀察，根據(jù)平板上菌株的生長(zhǎng)情況，再劃線分離得到最終的純培養(yǎng)菌株。

所述的豐富培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000mL，pH值為7.0～7.4。

所述的唯一碳源培養(yǎng)基組成為堿木質(zhì)素3g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄0.2g，CaCl₂ 0.1g，F(xiàn)eSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH值為7.0～7.4。

本發(fā)明利用分離篩選的Cupriavidus basilensis B-8菌以堿木質(zhì)素為唯一碳源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯，即將Cupriavidus basilensis B-8菌在以堿木質(zhì)素為唯一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。其中，堿木質(zhì)素濃度為1～6g/L，氮源濃度低于60mg/L。

所述的唯一碳源培養(yǎng)基為堿木質(zhì)素1～6g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄0.2g，CaCl₂ 0.1g，F(xiàn)eSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH值為7.0～7.4。

本發(fā)明以木質(zhì)素降解菌Cupriavidus basilensis B-8為生產(chǎn)菌株，利用堿木質(zhì)素作為唯一碳源合成聚羥基脂肪酸酯，且無(wú)需對(duì)木質(zhì)素碳源進(jìn)行任何預(yù)處理。本發(fā)明方法極大的降低了聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)的碳源及其預(yù)處理成本，且發(fā)酵條件和過(guò)程簡(jiǎn)單，為聚羥基脂肪酸酯的工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化提供了新思路。

附圖說(shuō)明

圖1：Cupriavidus basilensis B-8形成的聚羥基脂肪酸酯熒光顯微鏡圖；

圖2：Cupriavidus basilensis B-8形成的聚羥基脂肪酸酯氣質(zhì)聯(lián)用譜圖；

圖3：Cupriavidus basilensis B-8形成的白色聚羥基脂肪酸酯數(shù)碼照片圖；

圖4：不同堿木質(zhì)素培養(yǎng)基濃度所得細(xì)胞干重和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

在L-試管中，加入5mL的LB培養(yǎng)基，接入Cupriavidus basilensis B-8菌株的單菌落，30℃和150rpm條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，直至細(xì)菌在600nm處的光密度達(dá)到1.0。將前培養(yǎng)物離心、沖洗，再接種至含有100mL不同濃度堿木質(zhì)素培養(yǎng)基(1～6g/L)的三角瓶中，30℃和150rpm條件下振蕩培養(yǎng)48h。其中，培養(yǎng)基配制方法：堿木質(zhì)素1～6g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCl₂ 0.1g，F(xiàn)eSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH值為7.0～7.4。

收集2mL樣品，棄上清液，并將細(xì)胞重新懸浮于150μL的去離子水和50μL的二甲亞砜中。將5μL的Nile Red(0.15mg/mL)加入懸浮液中染色30min。然后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果附圖1所示，證實(shí)在細(xì)菌細(xì)胞中形成了聚羥基脂肪酸酯的內(nèi)含體。

發(fā)酵結(jié)束后，菌體在12000rpm無(wú)菌離心15min，用去離子水沖洗兩次，再冷凍干燥48h。然后用氯仿法提純分離PHA，將提純后的PHA(0.5～2mg)置于2mL含15％硫酸和2mL氯仿的甲醇溶液中，100℃下甲醇化4h。然后用氣-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)確定聚合物為聚-3-羥基丁酸(PHB)的均聚物(如圖2所示)，單體組成和含量分別為98.3mol％的S-3-羥基丁酸(S3HB)、1.3mol％的R-3-羥基丁酸(R3HB)和0.4mol％的3-羥基丁酸(3HB)。提純后的白色PHB產(chǎn)物如附圖3所示。此外，不同濃度堿木質(zhì)素濃度培養(yǎng)基所得細(xì)胞干重和PHB產(chǎn)率如附圖4所示，可見(jiàn)所有濃度條件下PHB的含量約為細(xì)胞干重的15.5～18.5％。當(dāng)堿木質(zhì)素培養(yǎng)基濃度為5g/L時(shí)，細(xì)菌濃度可達(dá)到最大值735.6mg/L，此時(shí)PHB的體積產(chǎn)率為0.128g/L。