本發(fā)明涉及微生物學(xué)及生物納米硒制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用枯草芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硒(Selenium)元素是動(dòng)物和人類所必須的一種微量元素，與人體內(nèi)多種代謝途徑相關(guān)。人體缺硒會(huì)造成多種疾病，如肌肉萎縮、心血管、骨骼或免疫系統(tǒng)疾病，并增加患癌風(fēng)險(xiǎn)，而硒過量也會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重毒害。人體對(duì)硒有比較窄的適應(yīng)范圍，中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)及FAO/WHO/IAEA聯(lián)合專家委員會(huì)確定人體攝入量適宜范圍為60-250μg/d，安全劑量為400μg/d，中毒劑量為800μg/d。由于我國版圖存在一條天然的缺硒帶，硒分布極不均衡，缺硒地區(qū)人群每日硒攝入量嚴(yán)重不足，安全高效補(bǔ)硒對(duì)我國缺硒地區(qū)人群來說已刻不容緩。

自然界中硒具有多種形態(tài)，負(fù)二價(jià)的硒化物包括硒化氫(H₂Se)、金屬硒化物、甲基硒和硒代氨基酸等；四價(jià)硒主要有SeO₂、H₂SeO₃和SeO₃^2-幾種形態(tài)；六價(jià)硒主要有H₂SeO₄和SeO₄^2-。在工業(yè)生產(chǎn)中，灰色單質(zhì)硒可通過氧化負(fù)二價(jià)形態(tài)的硒和還原四價(jià)、六價(jià)形態(tài)的硒制得。近年來，人們通過化學(xué)、物理的方法制備出紅色納米硒，也發(fā)現(xiàn)多種微生物(真菌、細(xì)菌、放線菌)可以轉(zhuǎn)化六價(jià)及四價(jià)無機(jī)硒鹽為紅色納米硒。

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠口服亞硒酸鈉的半致死量約為7mg/kg，硒甲基半胱氨酸的半致死量約為15mg/kg，硒代蛋氨酸的半致死量約為26mg/kg，而化學(xué)合成的納米硒的半致死量約為105mg/kg。由于納米硒與硒代蛋氨酸在血液、肝臟、腎臟等器官中的生物活性無明顯差異，且納米硒在抑制腫瘤方面效果顯著且優(yōu)于硒代蛋氨酸，因此，納米硒具有相對(duì)于無機(jī)及有機(jī)硒更為安全有效的補(bǔ)硒優(yōu)勢(shì)。

生物納米硒是通過微生物轉(zhuǎn)化還原無機(jī)硒并經(jīng)過分離純化得到的單質(zhì)態(tài)納米硒。生物納米硒自身低毒、生物活性高、比表面積大、安全高效等特點(diǎn)，更優(yōu)于其他硒源。由于生物納米硒在人體補(bǔ)硒方面的優(yōu)勢(shì)顯著，以及微生物轉(zhuǎn)化具有安全高效環(huán)保等特點(diǎn)，現(xiàn)已有許多關(guān)于微生物轉(zhuǎn)化納米硒的研究報(bào)導(dǎo)。但是已有報(bào)道都未進(jìn)行后期工廠化生產(chǎn)及應(yīng)用的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從土壤中分離得到一株可耐受較高濃度亞硒酸鈉的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)S12，菌株S12現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)CGMCC No.11741，保藏日期2015年11月26日。

本發(fā)明還提供含有所述枯草芽孢桿菌S12的復(fù)合微生物菌劑。

本發(fā)明還提供利用所述枯草芽孢桿菌S12生物合成納米硒的方法，所述方法是向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加六價(jià)和/或四價(jià)無機(jī)硒鹽，發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌S12，并從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化納米硒。所述發(fā)酵產(chǎn)物包括發(fā)酵液經(jīng)離心所得菌體沉淀，菌懸液以及菌體裂解液。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基中六價(jià)和/或四價(jià)無機(jī)硒鹽的濃度為0.001-70mM，優(yōu)選1-20mM。更優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加濃度為5mM的亞硒酸鈉。

本發(fā)明提供的利用枯草芽孢桿菌S12生物合成納米硒的方法，包括以下步驟：

S1、菌種活化

用PD培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，PD培養(yǎng)基配方為：葡萄糖8g/L，酵母膏10g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，MgSO4﹒7H₂O 0.3g/L，瓊脂18g/L，pH 7.0-7.2；將菌株S12接種于PD培養(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)36小時(shí)；

S2、種子液的制備

種子培養(yǎng)用AW液體培養(yǎng)基，AW液體培養(yǎng)基配方為：酵母膏10g/L，玉米漿4g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.25g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，pH 7.0-7.2；將活化好的菌株S12用無菌生理鹽水配制成10⁸CFU/mL的菌懸液，以1％的接種量接種于AW液體培養(yǎng)基中，28℃搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為24h；

S3、發(fā)酵罐發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)采用SD發(fā)酵培養(yǎng)基，SD發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，Mg₂SO₄﹒7H₂O 1g/L，Na₂SeO₃ 5mM，pH 7.0-7.2；控制培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的70％，將種子液按照2.5％的接種量接入發(fā)酵罐，控制發(fā)酵溫度為28℃，攪拌速度為260rpm，通氣量為1：0.3-0.6(發(fā)酵液體積：每分鐘通氣量體積)，罐壓1.4-1.8F/cm²，發(fā)酵96-108小時(shí)。納米硒產(chǎn)量可達(dá)3mM；

S4、從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化納米硒。

從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化生物納米硒的方法如下：

方案I：

發(fā)酵液下罐，4000-8000rpm離心20-30min收集菌體及納米硒。將收集的紅色沉淀用無菌生理鹽水4000-8000rpm離心20-30min清洗2-3遍，并用發(fā)酵液1/10體積的水(優(yōu)選純凈水)重懸沉淀，濃縮納米硒濃度為發(fā)酵濃度的10倍，達(dá)到30mM。所得菌懸液經(jīng)冷凍干燥，即得納米硒干粉。

方案II：

a、發(fā)酵液下罐，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至大燒杯中，置于碎冰上。利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，設(shè)置變幅桿為Φ10，占空比40-50％，功率500-600W，頻率20KHz，啟停間隔3-8s，破碎25-45min(優(yōu)選30min)。

b、菌體裂解液于4000-8000rpm離心10-25min使納米硒沉淀，無菌生理鹽水4000-8000rpm離心20-30min清洗2-3遍；重懸于1/2原體積的無菌水(優(yōu)選無菌純凈水)中，納米硒的濃度濃縮至60mM，得到納米硒懸液。

c、轉(zhuǎn)移生物納米硒懸液至萃取塔中，按照發(fā)酵液0.25-0.5倍體積的量加入正己烷萃取3-5次，收集下層水相，4000-6000rpm離心10-25min，所得沉淀用無菌生理鹽水清洗2-3遍，4000-6000rpm離心10-15min清洗2-3遍；冷凍干燥，即得納米硒干粉。

d、獲得高純度、分散性較好生物納米硒懸液，透射電子顯微鏡觀察結(jié)果見圖5。

冷凍干燥與生物納米硒制備：將方案I中制備的生物納米硒，用液氮冷凍10min，放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強(qiáng)20-100Pa，加熱板溫度為20-35℃，樣品厚度為10-25mm；干燥時(shí)間在48-72小時(shí)，生物納米硒干粉A。

將方案II中制備的生物納米硒，用液氮冷凍10min，放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強(qiáng)20-65Pa，加熱板溫度為20-25℃，樣品厚度為10-14mm；干燥時(shí)間在36-48小時(shí)，純生物納米硒干粉B。

本發(fā)明還提供由所述枯草芽孢桿菌S12發(fā)酵制備的生物納米硒。

本發(fā)明進(jìn)一步提供由所述枯草芽孢桿菌S12生物合成的納米硒在制備食品、保健品、藥品、畜禽飼料以及農(nóng)用肥料中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供由所述生物納米硒制備的富硒功能食品、富硒保健品和硒藥片以及富硒肥料、富硒飼料。其中，生物納米硒所占含量分別為10-2500μg/kg，10-500mg/kg，50-800mg/kg，50-800μg/kg和0.2-10g/L。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，將生物納米硒干粉A和B分別懸浮于純凈水中，配制成含硒量為100g/L的母液；在攪拌器中加入1/99體積比例的母液與純凈水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍渲瞥?g/L的富硒肥料，分別為富硒肥料A和富硒肥料B。

在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，將以下原料按照所示比例稱取，玉米粉55.5％、粗蛋白19.5％、四號(hào)粉7.0％、麩皮3.0％、豆粕21.0％、魚粉3.0％、玉米蛋白粉5.0％、酵母粉2.0％、磷酸氫鈣1.2％和石粉1.0％，食鹽0.3％。稱取好的原料投入混合機(jī)，并分別將生物納米硒干粉A和B按照100-500μg/kg比例與原料混合均勻，利用裝料機(jī)分別將富硒飼料A與B以10kg每包裝入包裝袋，配制成富硒飼料A和富硒飼料B，封口儲(chǔ)存。

在本發(fā)明的又一個(gè)具體實(shí)施方式中，將小米面粉、植物油、純凈水按照55％、10％、35％的重量比例投入混合機(jī)，并將生物納米硒干粉B按照40-200μg/kg的比例加入到混合機(jī)中與原料混合均勻備用。開機(jī)30min，使機(jī)器預(yù)熱，待螺桿部位溫度穩(wěn)定在120-150℃后，將預(yù)混料均勻的加入到膨化機(jī)中擠壓膨化。待?？跀D壓力達(dá)到3.0-10Mpa，調(diào)質(zhì)器與膨化腔蒸汽壓力分別穩(wěn)定在0.20-0.25Mpa和0.50-0.60Mpa時(shí)，開始擠出膨化產(chǎn)品，并設(shè)置高速切刀轉(zhuǎn)速為500-800rpm，可根據(jù)產(chǎn)品的需要調(diào)整?？谛吞?hào)和切刀轉(zhuǎn)速控制產(chǎn)品形狀。膨化產(chǎn)品水分含量一般在6.5％～8％左右，可將其在80～90℃的烘箱中烘干20-30min，使其水分含量控制在4-5％左右。干燥后的膨化產(chǎn)品進(jìn)行抽樣檢測(cè)硒含量，將合格產(chǎn)品進(jìn)行真空充氮?dú)廛洶b。

在本發(fā)明的再一個(gè)具體實(shí)施方式中，將生物納米硒干粉B與淀粉按照100-250mg/kg的比例混合均勻，加入潤濕劑，在制粒機(jī)中將原料制成微粒，在80～90℃干燥箱中干燥，使其水分控制在1.0％左右，將微粒在整粒機(jī)中除去團(tuán)結(jié)塊狀不合格微粒并將微粒過80目網(wǎng)篩，合格微粒在混合機(jī)中與潤滑劑混合均勻，混合機(jī)轉(zhuǎn)速20rpm，混合時(shí)間20-30min。在自動(dòng)加樣機(jī)中將原料微粒填充到膠囊殼中，控制每粒膠囊重0.3-0.6g。正式生產(chǎn)后抽檢平均片重，并取樣作含量測(cè)定。半成品膠囊裝瓶，每瓶100粒，封口包裝入庫，即得富硒保健品。

將生物納米硒干粉B與植物蛋白粉按照100-250mg/kg的比例混合均勻，再將粘合劑加入到混勻的干粉中，在混合機(jī)中攪拌均勻。粘合劑HPMC濃度為5％，粘合劑與干粉質(zhì)量比例為15％，混合機(jī)轉(zhuǎn)速20rpm，混合時(shí)間20-30min?；靹蚝蟮脑弦笪罩蓤F(tuán)，觸之則散。將原料投入壓片機(jī)中開車壓片，壓片機(jī)壓力70KN，片重0.4g。

片劑成品置于80～90℃干燥箱中干燥，使其水分含量控制在1.0％左右。正式生產(chǎn)后抽檢平均片重，并取樣作含量測(cè)定。合格半成品藥片裝瓶，每瓶100粒，封口包裝入庫，即得生物納米硒藥片。

本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌S12合成生物納米硒，對(duì)生物納米硒進(jìn)行分離純化，大量制備生物納米硒，并在肥料、飼料、富硒功能食品加工、保健品及醫(yī)藥產(chǎn)品中應(yīng)用。采用生物發(fā)酵工藝制備納米硒，具有環(huán)境友好，產(chǎn)率高，安全高效等特點(diǎn)，生產(chǎn)獲得的生物納米硒用于富硒肥料、富硒飼料，施肥或飼喂后，作物、瓜果、蔬菜、肉蛋奶富硒效果顯著。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中菌株S12的系統(tǒng)進(jìn)化樹，A為16S rDNA基因進(jìn)化樹，B為gyrA基因進(jìn)化樹。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中菌株S12對(duì)不同亞硒酸鈉濃度的耐受性。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中菌株S12在不同亞硒酸鈉濃度下的硒產(chǎn)量(A)及對(duì)應(yīng)濃度下的轉(zhuǎn)化率(B)。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中添加5mM亞硒酸鈉時(shí)枯草芽孢桿菌S12透射電子顯微鏡(TEM)照片(A)和生物納米硒能譜(EDX)分析圖(B是對(duì)A圖中箭頭所指顆粒進(jìn)行分析)。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中枯草芽孢桿菌S12轉(zhuǎn)化生成的納米硒顆粒純化后透射電子顯微鏡(TEM)照片。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1枯草芽孢桿菌S12的分離純化及鑒定

1.1菌株S12的分離純化

從土壤中分離得到一株可耐受較高濃度亞硒酸鈉的菌株S12。

1.2菌株S12的鑒定

1.2.1 PCR擴(kuò)增16S rDNA、gyrA基因序列并測(cè)序：

將菌株S12接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，取0.2mL滅菌PCR管，加入10μL ddH₂O，

無菌牙簽挑取單個(gè)菌落到PCR管中攪拌混勻。

1.2.2構(gòu)建PCR反應(yīng)體系：

16S rDNA：以8F(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)及1506R(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)為引物，PCR擴(kuò)增獲得16S rDNA基因序列。PCR反應(yīng)體系為：ddH₂O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL，dNTPMix，2μL；8F，0.5μL；1506R，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq DNA聚合酶，0.5μL；

PCR反應(yīng)條件為：94℃10min；94℃40s，56℃40s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

gyrA：以p～gyrA～F(5’～CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT～3’)及p～gyrA～R(5’～CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT～3’)為引物，PCR擴(kuò)增獲得gyrA基因序列。PCR反應(yīng)體系為：ddH₂O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL；dNTPMix，2μL；p～gyrA～F，0.5μL；p～gyrA～R，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq DNA聚合酶，0.5μL；

PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃1min，55～62℃1min，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

將PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段進(jìn)行純化，并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件拼接。將測(cè)得的16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)、gyrA基因序列(SEQ ID NO:2)，應(yīng)用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.blm.nih.gov/blast.cgi)中已有的細(xì)菌的16S rDNA序列、gyrA基因進(jìn)行相似性比較分析，結(jié)果顯示16S rDNA序列與Bacillus subtilis PY79的一致性達(dá)到99％，gyrA基因與Bacillus subtilis D12-5一致性達(dá)到100％，S12菌株16S rDNA進(jìn)化樹見圖1A，gyrA基因進(jìn)化樹見圖1B。由此確定S12菌株為枯草芽孢桿菌，定名為Bacillus subtilis S12，并保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號(hào)：CGMCC No.11741。

實(shí)施例2枯草芽孢桿菌S12對(duì)亞硒酸鈉的耐受濃度

2.1制備固體LB不同濃度含硒培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂15g，去離子水1L)，121℃高壓滅菌20min；配制1M的亞硒酸鈉母液，過濾滅菌，加入亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng)基中亞硒酸鈉含量分別0mM、10mM、25mM、35mM、55mM、70mM、80mM。

2.2將S12菌株挑取單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中搖培8h(150rpm，28℃)取上述菌液，稀釋為OD₆₀₀＝0.8的母液備用；將母液分別稀釋至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，分別在含硒平板上滴加2.5μL不同濃度的菌液，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)48h，觀察菌落生長(zhǎng)及顏色變化。

結(jié)果見圖2，從結(jié)果可以看出10mM、25mM、35mM亞硒酸鈉對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)沒有明顯抑制作用；55mM和70mM亞硒酸鈉對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)有較明顯抑制作用；80mM亞硒酸鈉存在時(shí)，枯草芽孢桿菌S12不生長(zhǎng)，由此得到枯草芽孢桿菌S12對(duì)亞硒酸鈉耐受濃度為70mM。

實(shí)施例3枯草芽孢桿菌S12對(duì)亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化效率

3.1制備不同濃度含硒液體LB培養(yǎng)基，取5mL分裝于試管中，121℃高壓滅菌20min；配制1M的亞硒酸鈉母液，過濾除菌，加入亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng)基中亞硒酸鈉含量分別1mM、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、20mM，每個(gè)濃度梯度3個(gè)重復(fù)。

3.2將S12菌株挑取單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中搖培8h(150rpm，28℃)取上述菌液，稀釋至OD₆₀₀＝0.8；將稀釋好的菌液按照0.1％接種量接種于LB培養(yǎng)基(含有Na₂SeO₃)中，搖培48小時(shí)。

3.3用蒸餾水配置1M的Na₂S溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)；取1ml的菌與納米硒懸浮液于1.5ml離心管內(nèi)，12000rprn離心5min，去上清，清洗3次，然后加入1ml的1M Na₂S溶液，混勻后充分反應(yīng)1h，再12000r/min離心2min；然后取上清液在500nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品測(cè)定3次。

3.4根據(jù)納米硒吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線換算可知樣品中納米硒含量及S12菌株在不同亞硒酸鈉濃度下的轉(zhuǎn)化率(圖3)。S12菌株在較低濃度下可將亞硒酸鈉較大程度地轉(zhuǎn)化為納米硒，在5mM時(shí)S12合成納米硒的產(chǎn)量達(dá)到最高，為2.90mM，對(duì)亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率為58.1％。

實(shí)施例4生物納米硒特征分析

4.1活化枯草芽孢桿菌S12，轉(zhuǎn)接0.1％的菌液(OD₆₀₀＝0.8)于滅菌后的含LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入1M Na2SeO3母液，終濃度為5mM，置于搖床內(nèi)，28℃，150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為48h。

4.2將搖培48h后的紅色菌液取出，在常溫下4000r/min離心10分鐘，去上清，用生理鹽水重懸浮沉淀，離心沖洗3遍，取約20μL的菌與納米硒的紅色混合液，滴加在碳支持膜銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余水分，晾干，在透射電鏡下(TEM,JEM-1230,Japan)觀察，并利用能譜分析儀(EDX)對(duì)該納米顆粒進(jìn)行分析。

結(jié)果如圖4A及4B所示：透射電鏡下，S12細(xì)胞膜上可見球形納米硒顆粒，粒徑約150nm左右。通過EDX能譜分析紅色箭頭所指的納米顆粒知硒的特定吸收峰分別出現(xiàn)在1.37，11.22和12.49keV處，說明S12菌將亞硒酸鈉還原后形成的納米顆粒是納米硒。

實(shí)施例5生物納米硒發(fā)酵工藝

5.1菌種活化

用PD培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，PD培養(yǎng)基配方為：葡萄糖8g/L，酵母膏10g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，MgSO4﹒7H₂O 0.3g/L，瓊脂18g/L，pH 7.0-7.2；將菌株S12接種于PD培養(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)36小時(shí)。

5.2種子液的制備

種子培養(yǎng)用AW液體培養(yǎng)基，AW液體培養(yǎng)基配方為：酵母膏10g/L，玉米漿4g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.25g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，pH 7.0-7.2；將活化好的菌株S12用無菌生理鹽水配制成10⁸CFU/mL的菌懸液，以1％的接種量接種于AW液體培養(yǎng)基中，28℃搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為24h。

5.3發(fā)酵罐發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)采用SD發(fā)酵培養(yǎng)基，SD發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，Mg₂SO₄﹒7H₂O 1g/L，Na₂SeO₃ 5mM，pH 7.0-7.2；控制培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的70％，將種子液按照2.5％的接種量接入發(fā)酵罐，控制發(fā)酵溫度為28℃，攪拌速度為260rpm，通氣量為1：0.3-0.6，罐壓1.4-1.8F/cm²，發(fā)酵96-108小時(shí)。納米硒產(chǎn)量達(dá)到3mM。

5.4生物納米硒的分離純化

(1)納米硒的收集、清洗與濃縮

發(fā)酵液下罐，4000rpm離心20min收集菌體及納米硒。將收集的紅色沉淀用無菌生理鹽水離心清洗3遍(4000rpm，20min)，并用發(fā)酵液1/10體積的純凈水重懸沉淀，濃縮納米硒濃度為發(fā)酵濃度的10倍，達(dá)到30mM。

(2)生物納米硒的分離純化

a、發(fā)酵液下罐，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至大燒杯中，置于碎冰上。利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，設(shè)置變幅桿為Φ10，占空比40％，功率500W，頻率20KHz，啟停間隔3s，破碎30min。

b、4000rpm離心10min使納米硒沉淀，無菌生理鹽水4000rpm離心20min清洗3遍；重懸于1/2原體積的無菌純凈水中，納米硒的濃度濃縮至60mM。

c、轉(zhuǎn)移生物納米硒懸液至萃取塔，按照1/4體積的正己烷加入到生物納米硒懸液中進(jìn)行萃取3-5次，收集下層水相。

d、獲得高純度、分散性較好生物納米硒懸液，透射電子顯微鏡觀察結(jié)果見圖5。

(3)冷凍干燥與生物納米硒制備

將步驟(1)中制備的生物納米硒，用液氮冷凍10min，放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強(qiáng)20-100Pa，加熱板溫度為20-35℃，樣品厚度為10-25mm；干燥時(shí)間在48-72小時(shí)，生物納米硒干粉A。

將步驟(2)中制備的生物納米硒，用液氮冷凍10min，放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強(qiáng)20-65Pa，加熱板溫度為20-25℃，樣品厚度為10-14mm；干燥時(shí)間在36-48小時(shí)，純生物納米硒干粉B。

實(shí)施例6生物納米硒在肥料中的應(yīng)用

將生物納米硒干粉A和B分別懸浮于純凈水中，配制成含硒量為100g/L的母液；在攪拌器中加入1/99體積比例的母液與純凈水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，配制?g/L的富硒肥料，分別為富硒肥料A和富硒肥料B。

肥料A在富硒小麥、水稻、玉米等糧食作物，富硒大豆、花生、谷子、紅薯等雜糧，在富硒金針菇、香菇、木耳等食用菌中施用，富硒番茄、茄子、黃瓜等黃瓜，富硒蘋果、獼猴桃等水果以及富硒茶葉中的用量分別為2L/畝、0.5L/畝、1.5L/噸基質(zhì)、4L/畝、8L/畝、0.5L/畝，各個(gè)作物的硒含量分別為小麥287.2μg/kg、水稻214.4μg/kg、玉米260.1μg/kg、大豆237.1μg/kg、花生238.1μg/kg、谷子225.5μg/kg、紅薯60.8μg/kg、金針菇435.5μg/kg、香菇1977.4μg/kg、木耳2853.2μg/kg、番茄97.9μg/kg、茄子76.2μg/kg、黃瓜49.7μg/kg、蘋果37.3μg/kg、獼猴桃168.8μg/kg、茶葉3438.6μg/kg。

肥料B在富硒小麥、水稻、玉米等糧食作物，富硒大豆、花生、谷子、紅薯等雜糧，富硒金針菇、香菇、木耳等食用菌，富硒番茄、茄子、黃瓜等黃瓜，富硒蘋果、獼猴桃等水果，富硒茶葉中的用量分別為2.3L/畝、0.6L/畝、1.7L/噸基質(zhì)、4.4L/畝、8.6L/畝、0.6L/畝；各個(gè)作物的硒含量分別為小麥279.01μg/kg、水稻282.9μg/kg、玉米217.4μg/kg、大豆218.6μg/kg、花生197.6μg/kg、谷子214.3μg/kg、紅薯45.3μg/kg、金針菇405.3μg/kg、香菇1887.9μg/kg、木耳2743.4μg/kg、番茄87.9μg/kg、茄子66.1μg/kg、黃瓜42.7μg/kg、蘋果39.2μg/kg、獼猴桃138.8μg/kg、茶葉3382.7μg/kg。

實(shí)施例7生物納米硒在富硒飼料中的應(yīng)用

將以下原料按照所示比例稱取，玉米粉55.5％、粗蛋白19.5％、四號(hào)粉7.0％、麩皮3.0％、豆粕21.0％、魚粉3.0％、玉米蛋白粉5.0％、酵母粉2.0％、磷酸氫鈣1.2％和石粉1.0％，食鹽0.3％。稱取好的原料投入混合機(jī)，并分別將生物納米硒干粉A或B按照50-800μg/kg比例與原料混合均勻，利用裝料機(jī)分別將富硒飼料A與B以10kg每包裝入包裝袋，配制成富硒飼料A和富硒飼料B，封口儲(chǔ)存。

富硒飼料A飼喂蛋雞、肉雞、豬、羊、牛等畜禽后，雞蛋、雞肉、豬肉、羊肉、牛肉中的硒含量分別為210-617.43μg/kg、233.45-543.37μg/kg、157.32-397.08μg/kg、167.82-368.59μg/kg、120.45-274.22μg/kg。

富硒飼料B飼喂蛋雞、肉雞、豬、羊、牛等畜禽后，雞蛋、雞肉、豬肉、羊肉、牛肉中的硒含量分別為198.21-504.38μg/kg、232.72-493.49μg/kg、125.73-326.84μg/kg、132.86-329.11μg/kg、104.52-258.62μg/kg。

實(shí)施例8生物納米硒在富硒功能食品中的應(yīng)用

將小米面粉、植物油、純凈水按照55％、10％、35％的重量比例投入混合機(jī)，并將生物納米硒干粉A或B按照10-2500μg/kg的比例加入到混合機(jī)中與原料混合均勻備用。

開機(jī)30min，使機(jī)器預(yù)熱，待螺桿部位溫度穩(wěn)定在120-150℃后，將預(yù)混料均勻的加入到膨化機(jī)中擠壓膨化。待?？跀D壓力達(dá)到3.0-10Mpa，調(diào)質(zhì)器與膨化腔蒸汽壓力分別穩(wěn)定在0.20-0.25Mpa和0.50-0.60Mpa時(shí)，開始擠出膨化產(chǎn)品，并設(shè)置高速切刀轉(zhuǎn)速為800rpm，可根據(jù)產(chǎn)品的需要調(diào)整?？谛吞?hào)和切刀轉(zhuǎn)速控制產(chǎn)品形狀。

膨化產(chǎn)品水分含量一般在6.5％～8％左右，可將其在80～90℃的烘箱中烘干30min，使其水分含量控制在5％左右。干燥后的膨化產(chǎn)品進(jìn)行抽樣檢測(cè)硒含量，將合格產(chǎn)品進(jìn)行真空充氮?dú)廛洶b。

膨化玉米、蕎麥、豆粉的加工工藝與膨化小米工藝相同，以此工藝可加工制得膨化小米、玉米、蕎麥、豆粉富硒功能食品。

實(shí)施例9生物納米硒在保健品和藥品中的應(yīng)用

9.1膠囊劑保健品

將生物納米硒干粉B與淀粉、維生素E和β胡蘿卜素混合，每公斤混合物中含有生物納米硒10-500mg，維生素E 0-22g，β胡蘿卜素0-5g，余量用淀粉補(bǔ)足，混合均勻，加入潤濕劑，在制粒機(jī)中將原料制成微粒，在80～90℃干燥箱中干燥，使其水分控制在1.0％左右，將微粒在整粒機(jī)中除去團(tuán)結(jié)塊狀不合格微粒并將微粒過80目網(wǎng)篩，合格微粒在混合機(jī)中與潤滑劑混合均勻，混合機(jī)轉(zhuǎn)速20-30rpm，混合時(shí)間20-30min。

在自動(dòng)加樣機(jī)中將原料微粒填充到膠囊殼中，控制每粒膠囊重0.3-0.6g。正式生產(chǎn)后抽檢平均片重，并取樣作含量測(cè)定。半成品膠囊裝瓶，每瓶100粒，封口包裝入庫。

9.2生物納米硒藥片

將生物納米硒干粉B與淀粉和植物蛋白粉(淀粉和植物蛋白粉的重量比為95：4.9)混合均勻，每kg混合物中含有生物納米硒干粉B50-800mg，再將粘合劑HPMC加入到上述混合物中，在混合機(jī)中攪拌均勻，混合機(jī)轉(zhuǎn)速20rpm，混合時(shí)間20min?；靹蚝蟮脑弦笪罩蓤F(tuán)，觸之則散。將原料投入壓片機(jī)中開車壓片，壓片機(jī)壓力70KN，片重0.4-0.6g。

片劑成品置于80～90℃干燥箱中干燥，使其水分含量控制在1.0％左右。正式生產(chǎn)后抽檢平均片重，并取樣作含量測(cè)定。合格半成品藥片裝瓶，每瓶100粒，封口包裝入庫。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。