本發(fā)明公開了一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，是屬于生產活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝技術領域。
背景技術：
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研究表明，人體的克山病，大骨節(jié)病，癌癥，心血管病，糖尿病，肌體免疫力肩托和衰老等80余種疾病均與缺硒有關，我國是個缺硒的國家，多數土壤中硒含量小于0.01μg/mL，這對于要達到人體預防疾病的需要量來說，是微不足道的。適量補硒對于人體有益。但是如果服用過量則會產生一定毒副作用，會出現(xiàn)疲倦，體重下降，嘔吐，口中有金屬味感，皮膚改變，脫發(fā)，聲音沙啞，牙齒脫落和指甲斷裂等癥狀。因此科學補硒，研究開發(fā)安全的富硒乳制品非常必要。
鍺是一種具有多種生物活性的微量元素，近年科學發(fā)現(xiàn)，鍺對于人體健康具有積極作用，有抗腫瘤，抗炎癥，抗病毒，抗衰老等生理作用。據瑞典和美國報道，有機鍺治療惡性淋巴癌，卵巢癌，子宮肌瘤，大腸癌，前列腺癌和黑色素癌均有較好的療效。因此，有機鍺被譽為“人類健康的保護神”。鍺主要由消化道吸收，吸收后的鍺經血液分布到體內各臟器，大部分位于細胞外血漿中，小部分在血細胞里，口服3h后小腸濃度最高，腎和肝濃度也較高，最后從尿和糞便排除體外，無明顯的蓄積作用。有機鍺的保健劑量為15-30mg/d。
大量的動物性實驗和臨床研究已證明有機鍺與生命具有重要的聯(lián)系。有機鍺Ge-132不僅是一種免疫強化劑，而且還是一種免疫調節(jié)劑。麻生等人實驗證明了Ge-132抗癌，抗高血壓，抗衰老作用是通過機體誘發(fā)干擾素及增強自然殺傷細胞(NK)細胞活性，巨噬細胞獲得實現(xiàn)的，有機鍺能增加機體免疫功能已被臨床證實。現(xiàn)在國內有學者進行用有機鍺治療艾滋病的嘗試。艾滋病患者獲得滿意療效。病人的癥狀及NK細胞活性，T細胞亞群等有明顯改善。
鍺能誘發(fā)干擾素，活化負責保衛(wèi)身體的細胞，從面調節(jié)免疫系統(tǒng)，故此對各類型癌癥都有顯著效果。
嗜酸乳桿菌是人體腸道中的重要微生物，與人體健康息息相關，它能改善調節(jié)人體腸道微生物群的平衡，增強機體的免疫力，減低膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥以及抑制腫瘤細胞的形成等，起到健康促進效果。近年來，隨著高新生物工程技術和食品科技的發(fā)展，一些含乳酸菌的保健食品相繼出現(xiàn)，同時也出現(xiàn)了一些硒強化食品，但是把兩者有機結合在一起的富硒活性乳酸菌功能性乳制品還未見報道，更未見有三者的結合本發(fā)明。通過研究開發(fā)富硒鍺活性乳酸菌功能性乳制品，將上述三者結合起來，更好發(fā)揮三者保健功能，從而推進乳業(yè)的發(fā)展，為人們預防疾病，提高健康水平起到積極的作用。
技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是在于提供一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝。
本發(fā)明的技術解決方案是：
1、一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：由富硒鍺活性普通酸乳發(fā)酵劑工藝，其工藝方法是：
嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的相對比列在1∶1～2∶1之間，通常為1∶1保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌之間存在共生現(xiàn)象，保加利亞乳桿菌由于具有較強的蛋白水解活性可在發(fā)酵初期分解乳中酪蛋白而形成纈氨酸等氨基酸和多肽以促進嗜熱鏈球菌的生長；在嗜熱鏈球菌生長過程中產生的甲酸和乳脲活動產生的CO2能夠刺激保加利亞乳桿菌生長。
在發(fā)酵初期，嗜熱鏈球菌生長快，發(fā)酵1h后與保加利亞乳桿菌的比例為(3～4)∶1.當pH值從6.5下降到5.5時，保加利亞乳桿菌的生長開始加快，而嗜熱鏈球菌的生長由于乳酸的抑制作用逐漸減慢，這是因為保加利亞乳桿菌對酸的生長由于乳酸的抑制作用逐漸減慢，這是因為保加利亞乳桿菌對酸的敏感性較差，在介質pH值在4.4，這時其新陳代謝活動才受到抑制。當pH值下降到5.0左右時，保加利亞乳桿菌控制了酸乳的發(fā)酵。當pH值下降到4.6左右時，酪蛋白開始凝聚，乳開始凝結，此時保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數量相近。而酸乳在冷藏等后酸化過程中，占優(yōu)勢的保加利亞乳桿菌繼續(xù)發(fā)酵乳糖產酸，當酸乳的pH值下降到3.5時，保加利亞乳桿菌細胞壁或細胞膜喪失了調節(jié)作用，細胞內外pH值趨于一致，從而使乳糖酶活性受到抑制。
2、一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：由富硒鍺活性益生菌的酸乳發(fā)酵劑工藝，其工藝特征是：
在發(fā)酵時間內酸乳的pH值低于4.4，嗜酸乳桿菌的菌數將下降2～4個數量級，而雙歧桿菌的接種量控制在5％左右，乳酸菌接種量為0.5％，以便延緩乳酸菌在培養(yǎng)過程中的對數生長期，阻止產酸過快與凝乳形成過早，以利于嗜酸乳桿菌和雙岐桿菌在混合培養(yǎng)中提前進入對數增殖過程。為了避免乳酸菌產酸過早對益生菌的生長產生不利影響，可采用兩步發(fā)酵法生產酸乳，使產品中益生菌數量提高4～5倍，貯存6周后產品中益生菌的數量仍可達107CFU/g。另外，提高酸乳中蛋白質，肽，氨基酸，抗壞血酸，半胱氨酸和β-半乳糖酶的含量，可明顯提高酸乳中益生菌的活菌數。
3、一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：由富硒鍺活性工藝直投是酸乳發(fā)酵劑工藝，其方法是：直投式酸乳發(fā)酵劑的生產過程，主要包括以下幾個步驟：
(1)優(yōu)良菌種的選育和保藏 生產優(yōu)質的商品化發(fā)酵劑關鍵在于使用優(yōu)良菌種。乳酸菌的篩選方向主要有：①篩選抗冷凍，抗干燥，抗剪切力等抗逆性強的菌株。②篩選乳糖和半乳糖利用率高的陽性菌株，以多產乳酸；③篩選黏性菌種以提高產胞外多糖等粘性物質，從而增加產品黏度，提高產品的濃厚質地，并減少凝膠斷裂及乳清析出等質量缺陷的發(fā)生；④酸乳發(fā)酵過程中會經常由于噬菌體的污染而導致發(fā)酵遲緩甚至發(fā)酵失敗，因此要求有相應的抗噬菌體菌株以備輪換⑤檸檬酸能夠被分解成為二乙酰等酸乳特有風味物質，所以檸檬酸利用菌能夠增強酸乳的特有風味；⑥篩選雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等益生菌時，菌株最好能耐受人的膽汁酸鹽和酸性環(huán)境，以增強其有效性。
篩選得到的純培養(yǎng)物置于超低溫冰箱或液氮罐中長期保藏，以保持其活性和穩(wěn)定性。
(2)菌種的移植 在進行發(fā)酵劑的工廠化生產以前在實驗室和菌種車間進行菌種的活化和移植，并進行種子液的擴大培養(yǎng)。
(3)培養(yǎng)基的配置和滅菌 制備直投是酸乳發(fā)酵劑，首先要對乳酸菌進行高濃度培養(yǎng)。在選擇好基礎培養(yǎng)基后，要找到合適的增強因子對培養(yǎng)基進行強化，得到優(yōu)化培養(yǎng)基，一是乳酸菌的繁殖達到最大。
(4)接種培養(yǎng) 制備直投是酸乳發(fā)酵劑需要獲得高濃度的細胞培養(yǎng)物。乳酸菌的高濃度培養(yǎng)方法通常如下：
①恒定pH值培養(yǎng)法 乳酸菌在發(fā)酵過程中，代謝產生的乳酸，醋酸等物質對其生長具有反饋抑制作用。發(fā)酵罐中培養(yǎng)液的pH值維持在5.8～6.0，已解除乳酸等物質對菌體生長的抑制作用，從而延長乳酸菌對數生長期，制備出含活菌數高的發(fā)酵液。
②膜滲析法 利用膜的選擇性將培養(yǎng)液與營養(yǎng)液進行成分交換，使培養(yǎng)液中的乳酸部分滲出，營養(yǎng)液中成分滲入培養(yǎng)液中，以維持乳酸菌正常的生長繁殖。采用此法所達到的菌體濃度高于第一種培養(yǎng)法。
(5)細胞濃縮 濃縮倍數在20～50倍以上，操作過程應盡量柔和，盡量降低剪切力和空氣的影響。
(6)真空冷凍干燥 現(xiàn)將細胞懸浮液凍結到共晶點溫度以下，使水分變成固態(tài)的冰，然后在適當的溫度和真空度下，使冰升華為水蒸氣，再用真空系統(tǒng)的捕水器(水汽凝結器)將水蒸氣冷凝，從而獲得干燥制品。實際上就是在減壓環(huán)境下利用升華現(xiàn)象除去水分。當菌體中的大部分水分被去出后，細胞的生理活動就會停止，從而達到了長期保藏的目的。
4、一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：有發(fā)酵劑條件的確定，感官化學酸度測定。
(1)發(fā)酵劑發(fā)酵條件的確定 以酸度作為評定標準，通過Lg(33)正交試驗確定發(fā)酵劑的最佳發(fā)酵條件。
(2)發(fā)酵劑感官檢驗 按要求對所制備的發(fā)酵劑進行感觀檢驗，評定其感官質量。
(3)發(fā)酵劑化學檢驗 槽用酸堿滴定法測定成品發(fā)酵劑的酸度。
(4)酸度的測定方法 培養(yǎng)5h后，采用酸堿滴定法。
5、一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是，由富硒鍺能力的測定。
(1)富硒能力的測定 亞甲藍還原法。
①原理：亞甲藍被硫化物還原，硒對該反應應有催化作用，使反應速度加快，硒質量濃度與亞甲藍還原速度呈相關的關系，從而得到硒的含量。
②硒標準儲備溶液(100μg/mL)：溶液分析純亞希酸鈉0.2190g與蒸餾水中，小心轉入1L容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，此溶液每毫升含稀100g。
③硒標準工作溶液(0.1μg/mL)：采用10倍稀釋法將硒標準儲備溶液(100g/mL)稀釋成0.1g/mL備用。
④硒轉化率測定結果
將4℃保藏3d后的發(fā)酵劑稀釋10倍，吸收3mL發(fā)酵劑，定容至10mL，用亞甲藍還原法，測得褪色時間為367.5s，由回歸方程及轉化率公式可得發(fā)酵劑的富硒率為50.38％。
⑤活菌數測定結果
測得發(fā)酵劑的活菌數為：7.2*108cfu/ml。
⑥發(fā)酵劑感官檢驗及預示結果
按最佳條件制備A2B1C3發(fā)酵劑，經感官檢驗符合感官質量要求，然后以市售鮮奶為原料乳，接種量7％，加糖量8％，39℃培養(yǎng)5h，成品酸奶硒轉化率達89.90％。將此酸奶置于4℃的冰箱冷藏后熟12h后品嘗堅定，此時酸奶風味良好，香味濃厚，酸甜柔和，甜酸比協(xié)調，酸奶組織均勻細膩。
(2)富硒鍺能力的測定。
①以靈芝鍺為主要原料的基質中加入經特殊處理的1％水溶性鍺，拌勻，裝入培養(yǎng)瓶，滅菌后接種靈芝菌，25℃培養(yǎng)一個月，在28℃培養(yǎng)室內培養(yǎng)子實體。培養(yǎng)基加鍺，1∶1000組比對照組增加4倍。
②菌絲體富集微量元素效果更佳，以菌絲體培養(yǎng)富鍺靈芝菌絲體，培養(yǎng)液中加不同濃度的二氧化鍺溶液，滅菌后于28℃，802pm培養(yǎng)，采用延期發(fā)酵法，結果絲菌體干粉鍺達到497～3300ug/g(對照13.2ug/g)增加40～250倍，較子實體富集優(yōu)越。
下面結合實施例對本發(fā)明進一步說明
具體實施方法：
實施例1：一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：由富硒鍺活性普通酸乳發(fā)酵劑工藝，其工藝方法是：
嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的相對比列在1∶1～2∶1之間，通常為1∶1保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌之間存在共生現(xiàn)象，保加利亞乳桿菌由于具有較強的蛋白水解活性可在發(fā)酵初期分解乳中酪蛋白而形成纈氨酸等氨基酸和多肽以促進嗜熱鏈球菌的生長；在嗜熱鏈球菌生長過程中產生的甲酸和乳脲活動產生的CO2能夠刺激保加利亞乳桿菌生長。
在發(fā)酵初期，嗜熱鏈球菌生長快，發(fā)酵1h后與保加利亞乳桿菌的比例為(3～4)∶1.當pH值從6.5下降到5.5時，保加利亞乳桿菌的生長開始加快，而嗜熱鏈球菌的生長由于乳酸的抑制作用逐漸減慢，這是因為保加利亞乳桿菌對酸的生長由于乳酸的抑制作用逐漸減慢，這是因為保加利亞乳桿菌對酸的敏感性較差，在介質pH值在4.4，這時其新陳代謝活動才受到抑制。當pH值下降到5.0左右時，保加利亞乳桿菌控制了酸乳的發(fā)酵。當pH值下降到4.6左右時，酪蛋白開始凝聚，乳開始凝結，此時保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數量相近。而酸乳在冷藏等后酸化過程中，占優(yōu)勢的保加利亞乳桿菌繼續(xù)發(fā)酵乳糖產酸，當酸乳的pH值下降到3.5時，保加利亞乳桿菌細胞壁或細胞膜喪失了調節(jié)作用，細胞內外pH值趨于一致，從而使乳糖酶活性受到抑制。
實施例2：一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：由富硒鍺活性益生菌的酸乳發(fā)酵劑工藝，其工藝特征是：
在發(fā)酵時間內酸乳的pH值低于4.4，嗜酸乳桿菌的菌數將下降2～4個數量級，而雙歧桿菌的接種量控制在5％左右，乳酸菌接種量為0.5％，以便延緩乳酸菌在培養(yǎng)過程中的對數生長期，阻止產酸過快與凝乳形成過早，以利于嗜酸乳桿菌和雙岐桿菌在混合培養(yǎng)中提前進入對數增殖過程。為了避免乳酸菌產酸過早對益生菌的生長產生不利影響，可采用兩步發(fā)酵法生產酸乳，使產品中益生菌數量提高4～5倍，貯存6周后產品中益生菌的數量仍可達107CFU/g。另外，提高酸乳中蛋白質，肽，氨基酸，抗壞血酸，半胱氨酸和β-半乳糖酶的含量，可明顯提高酸乳中益生菌的活菌數。
實施例3：一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：由富硒鍺活性工藝直投是酸乳發(fā)酵劑工藝，其方法是：直投式酸乳發(fā)酵劑的生產過程，主要包括以下幾個步驟：
(1)優(yōu)良菌種的選育和保藏生產優(yōu)質的商品化發(fā)酵劑關鍵在于使用優(yōu)良菌種。乳酸菌的篩選方向主要有：①篩選抗冷凍，抗干燥，抗剪切力等抗逆性強的菌株。②篩選乳糖和半乳糖利用率高的陽性菌株，以多產乳酸；③篩選黏性菌種以提高產胞外多糖等粘性物質，從而增加產品黏度，提高產品的濃厚質地，并減少凝膠斷裂及乳清析出等質量缺陷的發(fā)生；④酸乳發(fā)酵過程中會經常由于噬菌體的污染而導致發(fā)酵遲緩甚至發(fā)酵失敗，因此要求有相應的抗噬菌體菌株以備輪換⑤檸檬酸能夠被分解成為二乙酰等酸乳特有風味物質，所以檸檬酸利用菌能夠增強酸乳的特有風味；⑥篩選雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等益生菌時，菌株最好能耐受人的膽汁酸鹽和酸性環(huán)境，以增強其有效性。
篩選得到的純培養(yǎng)物置于超低溫冰箱或液氮罐中長期保藏，以保持其活性和穩(wěn)定性。
(2)菌種的移植 在進行發(fā)酵劑的工廠化生產以前在實驗室和菌種車間進行菌種的活化和移植，并進行種子液的擴大培養(yǎng)。
(3)培養(yǎng)基的配置和滅菌 制備直投是酸乳發(fā)酵劑，首先要對乳酸菌進行高濃度培養(yǎng)。在選擇好基礎培養(yǎng)基后，要找到合適的增強因子對培養(yǎng)基進行強化，得到優(yōu)化培養(yǎng)基，一是乳酸菌的繁殖達到最大。
(4)接種培養(yǎng) 制備直投是酸乳發(fā)酵劑需要獲得高濃度的細胞培養(yǎng)物。乳酸菌的高濃度培養(yǎng)方法通常如下：
①恒定pH值培養(yǎng)法 乳酸菌在發(fā)酵過程中，代謝產生的乳酸，醋酸等物質對其生長具有反饋抑制作用。發(fā)酵罐中培養(yǎng)液的pH值維持在5.8～6.0，已解除乳酸等物質對菌體生長的抑制作用，從而延長乳酸菌對數生長期，制備出含活菌數高的發(fā)酵液。
②膜滲析法 利用膜的選擇性將培養(yǎng)液與營養(yǎng)液進行成分交換，使培養(yǎng)液中的乳酸部分滲出，營養(yǎng)液中成分滲入培養(yǎng)液中，以維持乳酸菌正常的生長繁殖。采用此法所達到的菌體濃度高于第一種培養(yǎng)法。
(6)細胞濃縮 濃縮倍數在20～50倍以上，操作過程應盡量柔和，盡量降低剪切力和空氣的影響。
(6)真空冷凍干燥 現(xiàn)將細胞懸浮液凍結到共晶點溫度以下，使水分變成固態(tài)的冰，然后在適當的溫度和真空度下，使冰升華為水蒸氣，再用真空系統(tǒng)的捕水器(水汽凝結器)將水蒸氣冷凝，從而獲得干燥制品。實際上就是在減壓環(huán)境下利用升華現(xiàn)象除去水分。當菌體中的大部分水分被去出后，細胞的生理活動就會停止，從而達到了長期保藏的目的。
實施例4：一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是：有發(fā)酵劑條件的確定，感官化學酸度測定。
(1)發(fā)酵劑發(fā)酵條件的確定 以酸度作為評定標準，通過Lg(33)正交試驗確定發(fā)酵劑的最佳發(fā)酵條件。
(2)發(fā)酵劑感官檢驗 按要求對所制備的發(fā)酵劑進行感觀檢驗，評定其感官質量。
(3)發(fā)酵劑化學檢驗 槽用酸堿滴定法測定成品發(fā)酵劑的酸度。
(4)酸度的測定方法 培養(yǎng)5h后，采用酸堿滴定法。
實施例5：一種富硒鍺活性乳酸菌發(fā)酵劑工藝，其特征是，由富硒鍺能力的測定。
(1)富硒能力的測定 亞甲藍還原法。
①原理：亞甲藍被硫化物還原，硒對該反應應有催化作用，使反應速度加快，硒質量濃度與亞甲藍還原速度呈相關的關系，從而得到硒的含量。
②硒標準儲備溶液(100μg/mL)：溶液分析純亞希酸鈉0.2190g與蒸餾水中，小心轉入1L容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，此溶液每毫升含稀100g。
③硒標準工作溶液(0.1μg/mL)：采用10倍稀釋法將硒標準儲備溶液(100g/mL)稀釋成0.1g/mL備用。
④硒轉化率測定結果
將4℃保藏3d后的發(fā)酵劑稀釋10倍，吸收3mL發(fā)酵劑，定容至10mL，用亞甲藍還原法，測得褪色時間為367.5s，由回歸方程及轉化率公式可得發(fā)酵劑的富硒率為50.38％。
⑤活菌數測定結果
測得發(fā)酵劑的活菌數為：7.2*108cfu/ml。
⑥發(fā)酵劑感官檢驗及預示結果
按最佳條件制備A2B1C3發(fā)酵劑，經感官檢驗符合感官質量要求，然后以市售鮮奶為原料乳，接種量7％，加糖量8％，39℃培養(yǎng)5h，成品酸奶硒轉化率達89.90％。將此酸奶置于4℃的冰箱冷藏后熟12h后品嘗堅定，此時酸奶風味良好，香味濃厚，酸甜柔和，甜酸比協(xié)調，酸奶組織均勻細膩。
(2)富硒鍺能力的測定。
①以靈芝鍺為主要原料的基質中加入經特殊處理的1％水溶性鍺，拌勻，裝入培養(yǎng)瓶，滅菌后接種靈芝菌，25℃培養(yǎng)一個月，在28℃培養(yǎng)室內培養(yǎng)子實體。培養(yǎng)基加鍺，1∶1000組比對照組增加4倍。
②菌絲體富集微量元素效果更佳，以菌絲體培養(yǎng)富鍺靈芝菌絲體，培養(yǎng)液中加不同濃度的二氧化鍺溶液，滅菌后于28℃，802pm培養(yǎng)，采用延期發(fā)酵法，結果絲菌體干粉鍺達到497～3300ug/g(對照13.2ug/g)增加40～250倍，較子實體富集優(yōu)越。