本發(fā)明涉及菌株培育
技術(shù)領(lǐng)域：
，更為具體地說，涉及一株枯草芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：土傳病害是指病原體如真菌、細(xì)菌、線蟲和病毒隨病殘體生活在土壤中，條件適宜時從作物根部或莖部侵害作物而引起的病害。包括立枯、紋枯、青枯、枯萎、疫病、猝倒、根腐、軟腐、根結(jié)線蟲、胞囊線蟲等眾多植物的土傳病害。這些病害通常侵染植物根部或莖部，從而引起作物根莖部乃至全株發(fā)病，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前主要是通過化學(xué)藥劑對土傳病害進(jìn)行防控，而化學(xué)藥劑的長期使用，會造成水源土壤污染、生態(tài)平衡被破壞、農(nóng)藥殘留、次要病害猖獗和使病源微生物產(chǎn)生抗藥性等一系列嚴(yán)重的后果。隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，對食品安全問題的重視，以及對生態(tài)環(huán)境建設(shè)，保護(hù)生物多樣性和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求，使得生物防控土傳病害成為當(dāng)前研究和開發(fā)的熱點。芽孢桿菌(Bacillussp.)是一類產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，好氧或兼性厭氧生活，能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和抗有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，所產(chǎn)芽孢可制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型，且與化學(xué)農(nóng)藥混用后不失活，是理想的生防菌篩選對象。在芽孢桿菌中，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌，該枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能力，能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，因而具有較好的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目是在于提供一株枯草芽孢桿菌IBFCBF-4及其在防治真菌病害中的應(yīng)用，使用本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌及其所生產(chǎn)的發(fā)酵液能夠有效防治植物土傳真菌病害。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一株枯草芽孢桿菌菌株，所述枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌IBFCBF-4，且所述枯草芽孢桿菌IBFCBF-4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.11233。所述枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的菌落呈微黃色，不透明，圓形或不規(guī)則形，邊緣不整齊，表面粗糙褶皺。所述的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的制備方法，包括以下步驟：步驟1，采集土樣，土樣要求鹽堿地pH值9.5～10.5，鹽堿度0.60～0.70％；步驟2，將土樣制成不同濃度的土壤懸浮液；步驟3，將所述土壤懸浮液加入到NA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布處理，培養(yǎng)得到菌落；步驟4，挑選形態(tài)不一的單菌落進(jìn)行劃線保種，培養(yǎng)得到分離菌；步驟5，將病原菌菌塊接種到PDA培養(yǎng)基平板的中心，在距平板中心等距離處接種所述分離菌，培養(yǎng)后選擇抑菌圈最大的為枯草芽孢桿菌IBFCBF-4。所述病原菌菌塊為油茶炭疽病原菌菌塊。在一個具體實施方式中，步驟3培養(yǎng)溫度為28～32℃，步驟5培養(yǎng)溫度為23～27℃。所述的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的應(yīng)用，所述枯草芽孢桿菌IBFCBF-4及所述枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的發(fā)酵液應(yīng)用于防治真菌病害。進(jìn)一步的，所述真菌病害為土傳菌病害。優(yōu)選的，所述土傳菌病害為油茶炭疽病原菌、立枯絲核菌、亞麻炭疽菌、尖鐮孢亞麻?；?、辣椒疫霉菌、番茄灰霉菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、禾谷絲核菌、早疫病菌、禾頂囊殼菌或核盤菌。在一個具體實施方式中，所述解枯草孢桿菌IBFCBF-4的發(fā)酵液的制備包括：將枯草芽孢桿菌IBFCBF-4接種在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25-30℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖床震蕩2-4天，得到枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的發(fā)酵液。在一個具體實施方式中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基按照濃度包含以下組分：8～12g/L的胰蛋白胨，2～4g/L的牛肉粉，15～25g/L的葡萄糖，4～6g/L的NaCl，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.2-7.4。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌株IBFCBF-4具有抗真菌范圍廣、拮抗效果顯著的特性，因而具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。同時，本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌株IBFCBF-4對農(nóng)作物具有很好的促生長效果。尤其是，IBFCBF-4對油茶炭疽病原菌具有明顯的抑制作用，田間試驗表明IBFCBF-4對油茶炭疽的防治效果顯著高于IBFCBF-1。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的制備流程圖；圖2是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的菌落形態(tài)圖；圖3是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的革蘭氏染色圖；圖4是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的芽孢染色圖；圖5是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；圖6是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的16S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖7是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4與IBFCBF-1平板拮抗油茶炭疽病原菌對比示意圖；圖8是本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4防治辣椒疫病的示意圖。具體實施方式本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌菌株，使本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌及其所生產(chǎn)的發(fā)酵液能夠有效防治植物土傳真菌病害。為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，并使本發(fā)明實施例的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌IBFCBF-4，所述枯草芽孢桿菌IBFCBF-4于2015年8月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵政編碼：100101)，保藏編號為CGMCCNo.11233。請參考附圖1，附圖1示出了本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的制備流程圖。本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的制備步驟為：S01：通過多點采樣法采集土樣，并將采集到的土樣研細(xì)，本發(fā)明實施例中的土樣取自吉林長嶺，鹽堿地pH值10.0，鹽堿度0.65％。；S02：將研細(xì)的土樣放入裝有無菌水的離心管中充分震蕩，制成濃度為10-1的土壤懸浮液；S03：將所述土壤懸浮液梯度稀釋，得到不同濃度的土壤懸浮液；S04：選取濃度為10-5、10-6和10-7的土壤懸浮液，并加入到NA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布處理，放到30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到菌落；S05：挑選形態(tài)不一的單菌落進(jìn)行劃線保種，培養(yǎng)24小時，得到分離菌，將所述分離菌置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫籗06：用直徑0.5cm的打孔器將亞麻立枯、辣椒疫酶、油茶炭疽病原菌菌塊分別接種于不同的PDA培養(yǎng)基平板中心(亞麻立枯、辣椒疫酶菌塊是作為對比)，在距平板中央2.5cm十字交叉處等距離接種不同的分離菌，以不接種分離菌為對照(CK)，每次處理進(jìn)行3次重復(fù)實驗，在溫度為25℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)對照組(CK)長滿全部器皿時，記錄抑菌圈的大小，選擇對油茶炭疽病原菌抑菌圈最大的為枯草芽孢桿菌IBFCBF-4。其中，NA培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，該營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的組成按照濃度包括10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉，5g/L的NaCl，20g/L的瓊脂。NA培養(yǎng)基在制備時的pH值為7.2～7.4，并經(jīng)過20min的滅菌處理，且滅菌時的溫度為121℃。PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。本發(fā)明實施例提供了枯草芽孢桿菌IBFCBF-4和IBFCBF-1(專利申請?zhí)?01510867702.4)拮抗油茶炭疽病原菌的對比示意圖，示意圖請參考附圖7(左側(cè)為IBFCBF-4)。從附圖7中能夠看出，當(dāng)對照組全部長滿器皿時，接種有枯草芽孢桿菌IBFCBF-4分離菌的PDA培養(yǎng)基上出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，且抑菌圈的直徑均在2.0cm以上，其抑菌圈大小顯著高于IBFCBF-1對油茶炭疽的抑菌圈大小1.2cm。由抑菌圈的出現(xiàn)能夠說明本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4對油茶炭疽病原菌具有明顯的抑制作用，因而能夠很好的應(yīng)用于防治真菌病害，田間試驗表明IBFCBF-4對油茶炭疽的防治效果達(dá)74.40％，顯著高于IBFCBF-1的防治效果40.69％。表1：IBFCBF-1與IBFCBF-4處理后油茶炭疽病發(fā)生情況處理施藥前病情指數(shù)施藥后14d病情指數(shù)防治效果(％)清水對照20.63±1.45a38.52±2.42a—IBFCBF-122.13±1.33a32.74±2.27b40.69±4.69bIBFCBF-419.27±0.88a23.85±2.18c74.40±2.23a其中防治效果％＝[(對照組施藥前病情指數(shù)-對照組施藥后病情指數(shù))-(處理組施藥前病情指數(shù)-處理組施藥后病情指數(shù))]/(對照組施藥前病情指數(shù)-對照組施藥后病情指數(shù))×100。本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的發(fā)酵液的制備包括：將枯草芽孢桿菌IBFCBF-4接種在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25-30℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖床震蕩2-4天，得到枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的發(fā)酵液。其中，搖床震蕩的轉(zhuǎn)速為180r/min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基按照濃度包含以下組分：10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉，20g/L的葡萄糖，5g/L的NaCl。液體發(fā)酵培養(yǎng)基在制備時的pH值為7.2～7.4，并經(jīng)過20min的滅菌處理，且滅菌時的溫度為121℃。本發(fā)明對本發(fā)明實施例提供的菌株進(jìn)行了鑒定，該鑒定包括以下內(nèi)容：1、形態(tài)學(xué)鑒定將本發(fā)明實施例提供的菌株劃線到NA培養(yǎng)基平板上，然后將平板倒轉(zhuǎn)，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)24h，觀察并記錄平板上菌落的生長情況。本發(fā)明實施例提供的菌株的菌落形態(tài)圖請參考附圖2。從附圖2中能夠看出，本發(fā)明實施例提供的菌株的菌落呈微黃色，不透明，圓形或不規(guī)則形，邊緣不整齊，表面粗糙褶皺。進(jìn)一步，用試劑盒對本發(fā)明實施例提供的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，并在油鏡下觀察菌株和對菌株進(jìn)行拍照。該菌株的革蘭氏染色和芽孢染色請參考附圖3和附圖4。從附圖3中能夠看出，經(jīng)革蘭氏染色后，本發(fā)明實施例提供的菌株為桿狀，且呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌。從附圖4中能夠看出，經(jīng)芽孢染色后，本發(fā)明實施例提供的菌株菌體顯藍(lán)色，芽孢顯紅色，由此說明本發(fā)明提供的菌株能夠產(chǎn)生芽孢。2、生理生化鑒定(1)接觸酶實驗在菌株的液體培養(yǎng)液中直接滴加3％的過氧化氫，立即觀察。若有大量氣泡產(chǎn)生，則為陽性；若不產(chǎn)生氣泡，則為陰性。本發(fā)明提供的菌株立即產(chǎn)生大量氣泡，實驗結(jié)果為陽性。(2)氧化酶實驗取白色潔凈濾紙一角，蘸取少量的菌株菌落，加入濃度為1％的鹽酸二甲基對苯二胺水溶液一滴，陽性者立即呈粉紅色，且顏色會逐漸加深。在此次實驗中，菌落呈粉紅色，顏色逐漸加深，實驗結(jié)果為陽性。(3)淀粉水解實驗將菌株的菌種點接到淀粉培養(yǎng)基上，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)24h，滴加少量碘液在淀粉培養(yǎng)基平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻分布在淀粉培養(yǎng)基平板上，觀察菌落周圍的情況。若菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈表明有水解淀粉的能力，反之，則沒有。本菌株菌落的周圍有透明圈產(chǎn)生，由此能夠說明本菌株具有水解淀粉的能力。(4)甲基紅MR實驗挑取少量的本菌株，并接種于通用培養(yǎng)基上，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)3～5天，培養(yǎng)結(jié)束后取培養(yǎng)液1ml，并加入甲基紅指示劑1～2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。在此次實驗中，菌液變黃，所以為陰性。(5)VP實驗挑取少量的本菌株，并接種于通用培養(yǎng)基，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)4天，培養(yǎng)結(jié)束后取培養(yǎng)液2.5ml先加入a萘酚純酒精溶液0.6ml，再加入濃度為40％的氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動2-5min，陽性菌通常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或30℃的恒溫箱中，若2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色，則可判定為陰性。在此次實驗中，菌液立即變紅，所以為陽性。(6)明膠液化實驗取本菌株，穿刺接種于明膠中，并使本菌株位于明膠深度的2/3處。在溫度為20℃的條件下培養(yǎng)5-7d。每天觀察結(jié)果本菌株是否被細(xì)菌液化，若被液化，則為試驗陽性；若不被液化，則為陰性。在此次實驗中，明膠被液化，因此本菌株為陽性。(7)硝酸鹽還原實驗將本菌株接種于硝酸鹽肉湯中，在溫度為28℃的條件下?lián)u床培養(yǎng)3d，然后取5mL培養(yǎng)液，按試劑盒(海博生物技術(shù)有限公司硝酸鹽還原試劑盒)說明加入顯色劑，變黃為陽性，反之，不變色為陰性。在此次實驗中，菌液變黃，說明本菌株為陽性。(8)產(chǎn)硫化氫實驗將本菌株穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中，在溫度為35℃的條件下培養(yǎng)24～48h，并觀察結(jié)果。若培養(yǎng)基變黑，則為陽性；不變黑，則為陰性。在此次實驗中，培養(yǎng)基變色，說明本菌株為陽性。(9)檸檬酸鹽利用實驗挑本菌株在西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上劃線接種,在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)3-7天。若培養(yǎng)基為堿性者，即指示劑藍(lán)色或桃紅色的為陽性；若培養(yǎng)基不變色，則為陰性。在此次實驗中，培養(yǎng)基未變色，說明本菌株為陰性。(10)卵磷脂酶活性實驗用75％的乙醇將新鮮雞蛋的表面進(jìn)行消毒，并用滅菌的鑷子將雞蛋打個孔，傾去蛋清，然后用無菌吸管吸出卵黃，加入到融化后冷卻至50℃左右的NA培養(yǎng)基中，混和均勻后放倒平板，點接本菌株，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)24h，并進(jìn)行觀察。若菌落邊緣出現(xiàn)渾濁圈者為酶陽性。在此次實驗中，菌落邊緣出現(xiàn)明顯的渾濁圈，說明本菌株為陽性。(11)丙二酸鹽利用實驗挑取培養(yǎng)12h菌苔接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基，在溫度為35℃的條件下培養(yǎng)24-48h，培養(yǎng)基由綠變藍(lán)者為陽性，反之為陰性。在此次實驗中，培養(yǎng)基變色，說明本菌株為陽性。(12)葡萄糖發(fā)酵實驗挑取少量本菌株穿刺接種于葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)3d，觀察培養(yǎng)基顏色的變化。若無顏色變化，則需要繼續(xù)觀察7d，培養(yǎng)基變黃者為發(fā)酵型。在此次實驗中，培養(yǎng)基變黃，說明本菌株為陽性。(13)纖維素分解實驗涂布平板于羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基上，待有明顯菌落時，向平板中滴入一滴管剛果紅染液，并使剛果紅染液均勻的分布在平板上。15分鐘后加入1ml氯化鈉溶液，浸泡15分鐘后，洗去染色，觀察是否產(chǎn)生透明圈。若有透明圈產(chǎn)生，則為陽性。在此次實驗中，有透明圈產(chǎn)生，說明本菌株為陽性。(14)半乳糖利用實驗陽性將本菌株接種在半乳糖培養(yǎng)基中，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)2d，觀察菌落生長情況，若菌落形成，則可以利用半乳糖，反之，不行。在此次實驗中，菌體生長，說明本菌株可以利用半乳糖。(15)阿拉伯糖利用實驗將本菌株接種于阿拉伯糖培養(yǎng)基中，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)2d，觀察菌落生長情況，若菌落形成，則可以利用阿拉伯糖，反之，不行。在此次實驗中，菌體不生長，說明本菌株不可以利用阿拉伯糖。(16)甘露糖利用實驗將本菌株接種于甘露糖培養(yǎng)基中，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)2d，觀察菌落生長情況，若菌落形成，則可以利用甘露糖，反之，不行。在此次實驗中，菌體生長，本菌株可以利用甘露糖。(17)D-果糖利用實驗將本菌株接種于D-果糖培養(yǎng)基中，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)2d，觀察菌落生長情況，若菌落形成，則可以利用D-果糖，反之，不行。在此次實驗中，菌體生長，本菌株可以利用D-果糖。(18)D-木糖利用實驗將本菌株接種于D-木糖培養(yǎng)基中，在溫度為30℃的條件下培養(yǎng)2d，觀察菌落生長情況，若菌落形成，則可以利用D-木糖，反之，不行。在此次實驗中，有菌落形成，本菌株可以利用D-木糖。綜上，生理生化鑒定結(jié)果如表2。表2：本菌株的生理生化鑒定結(jié)果表性特征反應(yīng)特征表性特征反應(yīng)特征接觸酶測定+檸檬酸鹽利用+氧化酶測定+卵磷脂酶活性測定+淀粉水解測定+丙二酸鹽利用+甲基紅MR測定—纖維素分解+VP實驗+半乳糖利用+明膠液化測定+阿拉伯糖利用—硝酸鹽還原測定+甘露糖利用+葡萄糖發(fā)酵+D-果糖利用+產(chǎn)硫化氫測定—D-木糖利用+其中，+表示為本菌株有反應(yīng)或可以利用，-表示為本菌株沒有反應(yīng)或不可以利用。3、16SrDNA序列分析本發(fā)明實施例采用康為世紀(jì)生物科技有限公司基因組提取試劑盒提取本菌株中的DNA。其中，上述提取試劑盒包括50μL的PCR反應(yīng)體系，而PCR反應(yīng)體系包括25μL的2×MasterMix；2.5μL的上游引物；2.5μL的下游引物；18μL的ddH2O；2μL的模板DNA。PCR反應(yīng)條件為：在溫度為94℃預(yù)變性5min；94℃變性0.5min；53℃退火0.5min；72℃延伸1min；30個循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。請參考附圖5，附圖5示出了本發(fā)明實施例提供的芽孢桿菌IBFCBF-4的PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測的電泳圖。PCR產(chǎn)物由長沙維世爾生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果參見附表中的核苷酸序列。將所得序列通過NCBI—BLAST進(jìn)行同源性序列比對分析，得到相似性較高的序列。運用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，本菌株的16SrDNA序列與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的同源性達(dá)到100％，本菌株的發(fā)育樹圖請參考附圖6。綜合上述形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及16SrDNA序列分析結(jié)果，能夠確定本菌株IBFCBF-4為枯草芽孢桿菌科芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其被命名為枯草芽孢桿菌IBFCBF-4。本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4及其發(fā)酵液能夠應(yīng)用于防治真菌病害，該真菌病害為土傳菌病害為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、亞麻炭疽菌(Colletotrichumlinicola)、尖鐮孢亞麻?；?FusariumoxysporumSchltdl.exSnyderetHansenf.sp.lini)、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、串珠鐮刀菌(F.verticillioides)、禾谷絲核菌(R.cerealis)、早疫病菌(Alternariasolani)、禾頂囊殼菌(Gaeumannomycesgraminis)或核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)等的土傳菌病害。本發(fā)明實施例以辣椒疫霉菌為例進(jìn)行了枯草芽孢桿菌IBFCBF-4及其發(fā)酵液對真菌病害的研究，研究內(nèi)容如下。(1)培養(yǎng)基的選用枯草芽孢桿菌IBFCBF-4的培養(yǎng)采用NB液體培養(yǎng)基(即牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基)，該NB液體培養(yǎng)基的制備包含10g的蛋白胨，3g的牛肉粉和5g的NaCl，上述物質(zhì)使用去離子水定容至1000ml，并調(diào)節(jié)pH值為7.2-7.4，然后在1×105Pa的壓力下滅菌20min，制得NB液體培養(yǎng)基。辣椒疫酶病原真菌采用PDA液體培養(yǎng)基，該PDA液體培養(yǎng)基的制備包括200g的去皮馬鈴薯，20g的葡萄糖，上述物質(zhì)使用去離子水定容至1000mL，然后在1×105Pa的壓力下滅菌20min，制得PDA液體培養(yǎng)基。(2)辣椒品種的選擇辣椒選用湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供的甜椒品種茄門。將茄門的種子用濃度為10％的雙氧水進(jìn)行表面消毒20min，然后用無菌水沖淋3遍，并放置于的培養(yǎng)皿中，在溫度為30℃的條件下恒溫暗光催芽。選取芽長為0.5cm的種子播于9孔缽中，基質(zhì)為市售營養(yǎng)土，辣椒置于30±1℃的人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，此時光照的強(qiáng)度為12000Lux，光照周期為L︰D＝14︰10，RH＝80％±10％。(3)具體實驗設(shè)計實驗共分為3組：CK1：NB培養(yǎng)基；CK2：清水；T：枯草芽孢桿菌IBFCBF-4菌液。其中，枯草芽孢桿菌IBFCBF-4在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)48h，然后用無菌水將菌液稀釋至105CFU/mL。辣椒疫酶病原菌在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)7d，然后用無菌水將菌液稀釋至105CFU/mL。在實驗時，9孔缽中每孔播種出芽的辣椒種子一粒，保證9缽辣椒苗存活，并將9缽辣椒苗分為三組，每組三缽,待辣椒培養(yǎng)至3-4葉期時，在辣椒的根際施加辣椒疫酶病原菌菌液2.5mL，然后向分為三組的株苗中分別添加2.5mL的NB培養(yǎng)基、清水和枯草芽孢桿菌IBFCBF-4菌液。每隔2d每孔施加5mL營養(yǎng)液，以保證基質(zhì)較為濕潤，辣椒能夠正常生長。觀察辣椒生長態(tài)勢，60d后對辣椒進(jìn)行株高、莖粗、節(jié)間距、葉片葉綠素含量、上半部分鮮重及干重和根系鮮重及干重等生長指標(biāo)的測定，統(tǒng)計每組辣椒疫病發(fā)病株數(shù)。(4)測量方法測量時從辣椒植株基部至主莖頂部即主莖生長點之間的距離為株高，植株近根結(jié)的第一節(jié)莖的直徑為莖粗。隨機(jī)每株選三片葉子,用葉綠素計測量其葉綠素含量。植株每小節(jié)莖的長度為節(jié)間距，本實驗選取近根結(jié)的前三節(jié)。將辣椒植株從近根結(jié)的第一個節(jié)點剪斷，分別稱取上半部分和根系部分的重量，記為鮮重，然后放置到85℃的烘箱中烘干至恒重，再次分別稱取其重量，記為它們的干重。實驗結(jié)果請參考表3、表4和附圖8。表3：三種不同處理方法對辣椒生長的影響表4：用三種不同方法處理的辣椒疫病發(fā)生情況處理發(fā)病株數(shù)(株)發(fā)病率(％)防治效果(％)T1.67±0.33b18.52±3.7b64.45±2.22aCK13.67±0.33a40.74±3.7ab17.78±9.69aCK24.67±0.88a51.85±9.8a—其中，發(fā)病株率％＝發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100；防治效果％＝(1-處理組發(fā)病株率/對照組發(fā)病株率)×100。從表2中能夠看出，T組的處理使辣椒具有更高的株高、更粗的莖，且第二節(jié)節(jié)距、第三節(jié)節(jié)距、葉綠素含量、上半部分鮮重、上半部分干重、根鮮重和根干重數(shù)據(jù)都比其余兩組的數(shù)據(jù)要大。同時，從附圖8中能夠看出辣椒植株長勢良好，因而，本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4及其發(fā)酵液能夠有效的促進(jìn)植株的生長。從表3中能夠看出，T組的處理使辣椒的發(fā)病率明顯低于另外兩組的發(fā)病率，且防治效果更是明顯大于另外兩組的防治效果，由此能夠說明本發(fā)明實施例提供的枯草芽孢桿菌IBFCBF-4及其發(fā)酵液具有顯著的拮抗效果。以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3