本發(fā)明涉及微生物菌劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種枯草芽孢桿菌T400及其菌劑制備方法。
背景技術(shù)：
：隨著世界人口的不斷增長，全球農(nóng)業(yè)對化學(xué)氮肥的需求也在逐年增加。化學(xué)氮肥使用極大提高了農(nóng)業(yè)糧食的產(chǎn)量，但同時也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染和土壤肥力下降等負(fù)面影響。在自然界中，某些原核微生物在常溫常壓下通過固氮酶將大氣中的分子氮（N2）轉(zhuǎn)化為氨（NH3），這一過程稱為生物固氮，這類微生物稱為固氮微生物。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，地球上結(jié)合態(tài)氮總量有70%來源于生物固氮，每年全球微生物固定的氮素量可達(dá)2億噸，約占全球作物需氮量的3/4，相當(dāng)于工業(yè)生產(chǎn)氮肥的3倍多。通過生物固氮為農(nóng)作物提供氮源、提高產(chǎn)量、降低化肥用量、減少生產(chǎn)成本，同時促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，是最節(jié)能、環(huán)保、生態(tài)友好的氮素供應(yīng)方式。因此，利用各種方式進(jìn)行生物固氮是目前全球所關(guān)注的一個重要問題。根據(jù)固氮微生物與宿主之間的結(jié)合關(guān)系，可以將固氮作用分為自生固氮和共生固氮，前者如棕色固氮菌、克氏肺炎桿菌、巨大芽孢桿菌等，后者如根瘤菌和放線菌。其中，根瘤菌研究已經(jīng)超過100年的歷史，是迄今研究的最為清楚的生物固氮體系，并且在美國、巴西、阿根廷、澳大利亞等應(yīng)用廣泛。但是，根瘤菌具有非?？量痰膶Ｒ磺秩拘?，僅限于豆科作物生產(chǎn)使用，與禾本科等作物不能實(shí)現(xiàn)共生固氮。因此，通過定植于根際、根表，或者進(jìn)入根的皮層組織的自生固氮微生物與水稻、玉米、甘蔗等禾本科作物聯(lián)合固氮具有十分重要的應(yīng)用前景。自生固氮微生物是通常在自然環(huán)境或培養(yǎng)基中獨(dú)立生活，而且可以將大氣中的分子態(tài)氮固定為氨的一類微生物。自生固氮微生物不需要和其他生物聯(lián)合就能固氮，有條件寬、適應(yīng)廣的特點(diǎn)而且還能分泌一些植物激素，刺激根系和植株的生長發(fā)育，自生固氮菌能夠改善植物根際的微生態(tài)群落，起到促進(jìn)植物生長，提高植物抗逆性的作用。但是由于國內(nèi)外特別是國內(nèi)對自生固氮菌的研究起步較晚，大大限制了微生物菌劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種枯草芽孢桿菌T400，該功能微生物菌種枯草芽孢桿菌T400可以通過自生固氮補(bǔ)充作物生長過程中所需要的氮素，還能夠分泌生長素促進(jìn)植物生長。本發(fā)明的另一目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種枯草芽孢桿菌T400的菌劑制備方法，工藝簡單成熟，可規(guī)?；a(chǎn)，制得的枯草芽孢桿菌T400具有較高的固氮酶活性且能分泌生長素，應(yīng)用范圍廣，經(jīng)濟(jì)效益高。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。一種枯草芽孢桿菌T400，所述枯草芽孢桿菌分類命名：枯草芽孢桿菌T400BacillussubtilisT400，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCollection)，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期;2015年12月15日，保藏編號：CCTCCNO：M2015755。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為600.000-800.000nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸IAA，吲哚乙酸濃度為95-103mg/L。優(yōu)選地，該枯草芽孢桿菌T400為含有芽孢的革蘭氏陽性菌。具體地，該枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性測定方法如下：試驗方法：采用乙炔還原法對各菌株的固氮酶活性進(jìn)行測定。將保存的各菌株用VM-Ethanol固體培養(yǎng)基活化，用接種環(huán)挑取1環(huán)菌體于1.5mL的無菌離心管中，用無菌水稀釋，按相同接種量接入裝有5mL半固體培養(yǎng)基的10mL試管中，用反口橡膠塞密封。37℃培養(yǎng)24h后，注入1/10體積的10%乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)24h，從試管中抽取0.5mL氣體注入氣相色譜儀(北京天普分析儀器廠SP-2100)中，測定乙炔、乙烯的含量。按下列公式計算固氮酶活性大?。ū本┺r(nóng)業(yè)大學(xué)微生物專業(yè)編，1986）：C=(hx×c×V)/(24.9×hs×t)(2.1)其中，hx為樣品峰面積值；hs為標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積值；c為標(biāo)準(zhǔn)C2H4濃度(nmol/mL)；V為培養(yǎng)容器體積(mL)；t為樣品培養(yǎng)時間(h)；C為產(chǎn)生的C2H4濃度[nmol/(mL·h)]。試驗結(jié)果：結(jié)果分析，如圖4所示，根據(jù)公式(2.1)計算可得固氮酶活性為600.000-800.000nmol/(mL·h)。由此可以說明，枯草芽孢桿菌T400在代謝過程中可以產(chǎn)生特定的固氮酶，可以自生固定大氣中的氮?dú)狻＞唧w地，該枯草芽孢桿菌T400的吲哚乙酸定性含量測定方法為：生長素定性含量測定（1）挑取菌株分別接種（OD600=1.0，0.5mL菌懸液）到盛有50mLKing液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每組3個重復(fù)。（2）接種完畢后，將三角瓶置于搖床上，28℃，125rpm，培養(yǎng)3d，待測。（3）取上述在King液體培養(yǎng)基上生長3d后的菌懸液50μL置于透明離心管中，同時加50μL比色液。（4）設(shè)陽性對照和陰性對照，陽性對照中加入50μL濃度為10mg/L的植物生長激素（IAA），同時加50μL比色液。陰性對照中加50μLKing液體培養(yǎng)基，同時加50μL比色液。（5）將陽性對照液、陰形對照液和測定液置于白陶瓷板并置于室溫下15min，觀察其顏色變化，顏色變紅者為陽性，表示能夠分泌IAA，且顏色越深表示分泌IAA的能力越強(qiáng)；若不變色則為陰性，表示該菌株不能分泌IAA，由此作為判斷依據(jù)進(jìn)行判斷分析。培養(yǎng)基為King培養(yǎng)基(1L)；試劑配方為蛋白胨20g，K2HPO41.725g，MgSO4·7H2O1.5g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g，蒸餾水1000mL。生長素定量測定參照Riberio等的方法略加改動。菌株T400接種到含有1g/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min，振蕩培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)液10000r/min離心5min，取100mL上清液加到96孔板中，與100mLSalkowski’s試劑（1mL0.5mol/LFeCl3和49mL35%高氯酸）混勻，室溫靜置30min，在波長530nm下用酶標(biāo)儀測定吸光度。如圖5所示，用不同濃度的IAA標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定結(jié)果見表1。表1菌株T400IAA測定結(jié)果菌株T400T665T808T188IAA濃度（mg/L）98.3690.1286.8621.57從圖5和表1可以看出，枯草芽孢桿菌T400的生長素濃度為98.36mg/L，因此，可以判斷枯草芽孢桿菌T400在生長代謝過程中可以產(chǎn)生IAA，具有促進(jìn)作物生長的功能。所述枯草芽孢桿菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。一種枯草芽孢桿菌T400的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有枯草芽孢桿菌T400的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離、篩選，培養(yǎng)得到固氮菌菌落。（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行劃線純化，培養(yǎng)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，保存該單菌落備用。圖1為分離得到的枯草芽孢桿菌T400單菌落在顯微鏡下放大1000倍的菌落圖。（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)：利用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌T400單菌落，得到微生物菌液；培養(yǎng)條件為：影響微生物生長繁殖的環(huán)境因素有很多，對發(fā)酵影響較大的有裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH、和發(fā)酵時間。（4）菌體回收將發(fā)酵罐生產(chǎn)的微生物菌液接入無菌的碟式分離機(jī)，離心收集枯草芽孢桿菌T400菌體，快速脫去水分，制備干燥的純菌粉，測定芽孢數(shù)為500-800億/g。（5）菌劑制備將干燥純菌粉與基質(zhì)物料滑石粉和草炭完全混合，進(jìn)行活菌數(shù)檢測，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是4-20億/g，產(chǎn)品活菌數(shù)完全符合國家標(biāo)準(zhǔn)《微生物菌劑》GB20287-2006要求2億/g以上，即得到枯草芽孢桿菌T400菌劑。優(yōu)選地，所述步驟（1）中，分離、篩選的具體方法為：在土樣中加入無菌水，震蕩，靜置，取上清液離心處理，棄上清液，保留沉淀物，加入無菌水懸浮，離心，去沉淀，取上清液再離心，棄上清液，保留沉淀物，加入磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；將樣品液加入磷酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋的菌懸液；將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取菌懸液涂布于無氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到固氮菌菌落。更具體地，分離、篩選的方法為：從廣東省東莞市常平鎮(zhèn)黃泥塘農(nóng)場采取500g土樣，加入3L含0.01%吐溫80的無菌水，震蕩10min，靜置半個小時，取上清液于20℃下8000rpm離心20min。棄上清液，保留沉淀物，加入30-50mL含0.01%吐溫80的無菌水懸浮，液體于20℃5000rpm離心5秒鐘，去沉淀，將上清液倒入一個干無菌離心管中于20℃下6000rpm離心10min，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用10mL的pH7.0磷酸緩沖液懸浮，取1mL上述樣品液與9mL磷酸緩沖液懸浮混合，即為10倍稀釋菌懸液。將稀釋的菌懸液置于75℃水浴加熱15min，自然冷卻后吸取100μL涂布于無氮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)36-48小時獲得含枯草芽孢桿菌T400的固氮菌菌落。優(yōu)選地，所述步驟（2）中純化、保存的具體方法為：將步驟（1）培養(yǎng)得到固氮菌菌落于28-33℃恒溫培養(yǎng)36-48小時分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，于28-33℃恒溫培養(yǎng)36-48小時后置于2-5℃冰箱中保存。優(yōu)選地，所述步驟（3）的培養(yǎng)基培養(yǎng)對發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時間作進(jìn)一步限定，具體為：（3.1）裝液量：發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的70-75%；發(fā)酵罐裝液量要根據(jù)發(fā)酵罐的實(shí)際大小來調(diào)控，裝液太多會導(dǎo)致污染，裝液量太少也會造成資源浪費(fèi)的情況。（3.2）接種量：枯草芽孢桿菌T400的接種量為5-10%；接種量是指移種的種子液體積與發(fā)酵液體積之比。適當(dāng)?shù)慕臃N量可調(diào)節(jié)培養(yǎng)液黏度和溶解氧含量，縮短生長達(dá)到高峰的時間、使產(chǎn)物提前合成。發(fā)酵時間與菌體生長繁殖的關(guān)系可以通過生長曲線得出，最適的發(fā)酵時間能夠使得菌體的代謝量達(dá)到最大，而又不會出現(xiàn)菌體自溶的現(xiàn)象，確保發(fā)酵結(jié)果的準(zhǔn)確性。（3.3）培養(yǎng)溫度：枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為30-36℃；微生物的生長和產(chǎn)物的合成均需要在其各自最合適的溫度下進(jìn)行。溫度是保證酶活的重要條件，故在發(fā)酵過程中必須保證最適的溫度環(huán)境。（3.4）轉(zhuǎn)速：發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為150-300rpm；發(fā)酵過程中的搖床轉(zhuǎn)速使培養(yǎng)物混合均勻，確保每一個液體空間保持相同的生長時期，同時加大轉(zhuǎn)速可以增加空氣接觸面積，提高培養(yǎng)基中溶解氧的濃度。（3.5）通氣量：在發(fā)酵工藝的研究方面，多以好氧發(fā)酵為主，氧主要是作為呼吸鏈的終端電子受體。好氧微生物通過有氧呼吸將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為CO2、H2O，并獲取能量?？莶菅挎邨U菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時間進(jìn)行設(shè)定，接種后0-12小時，通氣量控制在0.9-1.2vvm，優(yōu)選地，通氣量控制在1.04vvm，接種后13-42小時，通氣量控制在1.15-1.6vvm，優(yōu)選地，通氣量控制在1.35vvm，接種后43-48小時，通氣量控制在1.4-1.8vvm，優(yōu)選地，設(shè)定通氣量為1.63vvm。（3.6）pH：pH是微生物生長和產(chǎn)物合成的非常重要的影響參數(shù)，是衡量代謝活動的綜合指標(biāo)。pH的變化會影響到各種酶活、菌對基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的構(gòu)造，從而影響菌的生長和產(chǎn)物的合成。在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過程中，通過補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.1-7.4。（3.7）發(fā)酵時間：根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長情況，設(shè)定42-48小時為發(fā)酵終點(diǎn)。優(yōu)選地，所述步驟（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)中，所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成：CaCO31.0-1.4g，MgSO4·7H2O0.6-1.2g，K2HPO41.0-2.0g，NaCl0.1-0.4g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001-0.005g，NaMO4·2H2O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，瓊脂18-20g，蒸餾水1000mL，所述培養(yǎng)基的pH為7.1-7.4。當(dāng)然，按照上述質(zhì)量的質(zhì)量比也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選地，所述步驟（2）和步驟（3）之間還包括有以下步驟：（S1）革蘭氏染色：將純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；（S2）芽孢染色：將陽性菌進(jìn)行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽性菌單菌落。革蘭氏染色和芽孢染色是兩種細(xì)菌鑒定的常規(guī)方法，染色可以縮小鑒定范圍。未經(jīng)染色的細(xì)菌與周圍環(huán)境折光率差別甚小，在顯微鏡下極難觀察。革蘭氏染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些菌種屬于革蘭氏陽性（G+）或者革蘭氏陰性菌（G-），用以分類鑒定。革蘭氏陰性菌普遍存在安全隱患，在農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用過程中直接高溫滅菌后舍棄結(jié)構(gòu)特征，存在可能致病性的隱患。芽孢染色將菌體內(nèi)的芽孢進(jìn)行染色，可以直觀觀察芽孢的大小、位置、形狀等特點(diǎn)，進(jìn)一步縮小其鑒定范圍。芽孢桿菌具有保質(zhì)期長，易于存放的特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。通過圖2的革蘭氏染色結(jié)果圖和圖3的芽孢染色結(jié)果圖可以看出，枯草芽孢桿菌T400為革蘭氏陽性菌，且含有芽孢。優(yōu)選地，所述步驟（S1）革蘭氏染色的具體方法為：（S1.1）涂片:在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)；在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻；將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細(xì)胞；（S1.2）初染：滴加2-5滴草酸銨結(jié)晶紫染液，染1min，傾去染液，流水沖洗至無紫色；（S1.3）媒染：先用新配的碘液（碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0mL）沖去殘水，再用碘液覆蓋涂面1min，后水洗；（S1.4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約15-20秒后，立即用流水沖洗；（S1.5）復(fù)染：滴加1滴番紅染色液，染3-5min，水洗后用吸水紙吸干；（S1.6）鏡檢：將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。優(yōu)選地，所述步驟（S2）芽孢染色的具體方法為：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細(xì)胞。在涂布菌體的區(qū)域滴加1-2滴石碳酸堿性復(fù)紅染液，染色3min。用蒸餾水沖洗掉染液，風(fēng)干后，將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。本發(fā)明的有益效果：（1）固氮：枯草芽孢桿菌屬廣泛存在于土壤、植物根際等環(huán)境中，具有菌種安全、功能多樣、生產(chǎn)方便、保質(zhì)期長等優(yōu)點(diǎn)，是目前我國微生物肥料生產(chǎn)廣泛應(yīng)用的菌種之一，在微生物肥料應(yīng)用領(lǐng)域具有十分可觀的經(jīng)濟(jì)價值。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為600.000-800.000nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中產(chǎn)生的吲哚乙酸濃度為95-103mg/L。（2）減少氮素投入：玉米大田示范試驗中，在施肥成本基本一致的基礎(chǔ)上，試驗組節(jié)氮率達(dá)17.2%，而增產(chǎn)率達(dá)29.24%，顯著地提高了玉米的產(chǎn)量，說明施用T400菌劑在減少氮素投入的同時能夠帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。（3）促進(jìn)作物生長：玉米大田示范試驗中，試驗組的株高、莖粗、棒葉面積均高于對照組，相對穗位高和倒伏率均低于對照組，充分說明T400菌劑對玉米的生長具有顯著的促進(jìn)作用。附圖說明圖1為分離得到的枯草芽孢桿菌T400單菌落在顯微鏡下放大1000倍的菌落圖。圖2為枯草芽孢桿菌T400革蘭氏染色結(jié)果圖。圖3為枯草芽孢桿菌T400芽孢染色結(jié)果圖。圖4為枯草芽孢桿菌T400固氮酶活性測定結(jié)果圖。圖5為枯草芽孢桿菌T400IAA比色效果圖。圖6為枯草芽孢桿菌T400菌劑的玉米盆栽試驗效果圖。具體實(shí)施方式結(jié)合以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，見圖1-6所示。實(shí)施例1本實(shí)施例的一種枯草芽孢桿菌T400的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取具有枯草芽孢桿菌T400固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離、篩選，培養(yǎng)得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行劃線純化，培養(yǎng)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，保存該單菌落備用；（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)：利用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落，得到微生物菌液；（4）菌體回收將微生物菌液接入無菌的碟式分離機(jī)，離心收集枯草芽孢桿菌T400菌體，快速脫去水分，制備干燥的純菌粉，測定芽孢數(shù)為500億/g；（5）菌劑制備將干燥純菌粉與基質(zhì)物料混合，進(jìn)行活菌數(shù)檢測，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是5億/g，即得到枯草芽孢桿菌T400菌劑。所述枯草芽孢桿菌T400，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM2015755。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為680.604nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸，吲哚乙酸濃度為98.36mg/L。所述枯草芽孢桿菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。所述步驟（1）中，分離、篩選的具體方法為：在土樣中加入無菌水，震蕩，靜置，取上清液離心處理，棄上清液，保留沉淀物，加入無菌水懸浮，離心，去沉淀，取上清液再離心，棄上清液，保留沉淀物，加入磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；將樣品液加入磷酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋的菌懸液；將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取菌懸液涂布于無氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到固氮菌菌落。所述步驟（2）中純化、保存的具體方法為：將步驟（1）培養(yǎng)得到固氮菌菌落于32℃恒溫培養(yǎng)38小時分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，于31℃恒溫培養(yǎng)42小時后置于4℃冰箱中保存。所述步驟（3）的培養(yǎng)基培養(yǎng)對發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時間作進(jìn)一步限定，具體為：（3.1）裝液量：發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的75%；（3.2）接種量：枯草芽孢桿菌T400的接種量為5%；（3.3）培養(yǎng)溫度：枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為32℃；（3.4）轉(zhuǎn)速：發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為200rpm；（3.5）通氣量：枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時間進(jìn)行設(shè)定，接種后0-12小時，通氣量控制在1.04vvm，接種后13-42小時，通氣量控制在1.35vvm，接種后43-48小時，設(shè)定通氣量為1.63vvm；（3.6）pH：在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過程中，通過補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.2；（3.7）發(fā)酵時間：根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長情況，設(shè)定46小時為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)中，所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成：CaCO31.0g，MgSO4·7H2O0.6g，K2HPO41.0g，NaCl0.1g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.0015g，NaMO4·2H2O0.05g，蔗糖5g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，所述培養(yǎng)基的pH為7.1。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于，所述步驟（2）和步驟（3）之間還包括有以下步驟：（S1）革蘭氏染色：將純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；（S2）芽孢染色：將陽性菌進(jìn)行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽性菌單菌落。所述步驟（S1）革蘭氏染色的具體方法為：（S1.1）涂片:在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)；在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻；將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細(xì)胞；（S1.2）初染：滴加4滴草酸銨結(jié)晶紫染液，染1min，傾去染液，流水沖洗至無紫色；（S1.3）媒染：先用新配的碘液沖去殘水，再用碘液覆蓋涂面1min，后水洗；（S1.4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約18秒后，立即用流水沖洗；（S1.5）復(fù)染：滴加1滴番紅染色液，染4min，水洗后用吸水紙吸干；（S1.6）鏡檢：將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。所述步驟（S2）芽孢染色的具體方法為：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細(xì)胞。在涂布菌體的區(qū)域滴加2滴石碳酸堿性復(fù)紅染液，染色3min。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同，這里不再贅述。實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于，本實(shí)施例的制備方法中，步驟（4）菌體回收，測定芽孢數(shù)為600億/g；步驟（5）菌劑制備，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是8億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為692nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸，吲哚乙酸濃度為98.2mg/L。所述步驟（2）中純化、保存的具體方法為：將步驟（1）培養(yǎng)得到固氮菌菌落于28℃恒溫培養(yǎng)48小時分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，于28℃恒溫培養(yǎng)48小時后置于2℃冰箱中保存。所述步驟（3）的培養(yǎng)基培養(yǎng)對發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時間作進(jìn)一步限定，具體為：（3.1）裝液量：發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的71%；（3.2）接種量：枯草芽孢桿菌T400的接種量為6%；（3.3）培養(yǎng)溫度：枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為31℃；（3.4）轉(zhuǎn)速：發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為180rpm；（3.5）通氣量：枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時間進(jìn)行設(shè)定，接種后0-12小時，通氣量控制在0.9vvm，接種后13-42小時，通氣量控制在1.15，接種后43-48小時，通氣量控制在1.4vvm；（3.6）pH：在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過程中，通過補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.2；（3.7）發(fā)酵時間：根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長情況，設(shè)定48小時為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)中，所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成：CaCO31.2g，MgSO4·7H2O0.8g，K2HPO41.3g，NaCl0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.002g，NaMO4·2H2O0.06g，蔗糖6g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，所述培養(yǎng)基的pH為7.2。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同，這里不再贅述。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于，本實(shí)施例的制備方法中，步驟（4）菌體回收，測定芽孢數(shù)為700億/g；步驟（5）菌劑制備，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是10億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為700nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸，吲哚乙酸濃度為101.45mg/L。所述步驟（2）中純化、保存的具體方法為：將步驟（1）培養(yǎng)得到固氮菌菌落于30℃恒溫培養(yǎng)36小時分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，于30℃恒溫培養(yǎng)36小時后置于3℃冰箱中保存。所述步驟（3）的培養(yǎng)基培養(yǎng)對發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時間作進(jìn)一步限定，具體為：（3.1）裝液量：發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的73%；（3.2）接種量：枯草芽孢桿菌T400的接種量為8%；（3.3）培養(yǎng)溫度：枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為34℃；（3.4）轉(zhuǎn)速：發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為250rpm；（3.5）通氣量：枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時間進(jìn)行設(shè)定，接種后0-12小時，通氣量控制在1.0vvm，接種后13-42小時，通氣量控制在1.21vvm，接種后43-48小時，通氣量控制在1.6vvm；（3.6）pH：在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過程中，通過補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.3；（3.7）發(fā)酵時間：根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長情況，設(shè)定42小時為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)中，所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成：CaCO31.3g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO41.6g，NaCl0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.003g，NaMO4·2H2O0.08g，蔗糖8g，瓊脂19g，蒸餾水1000mL，所述培養(yǎng)基的pH為7.3。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同，這里不再贅述。實(shí)施例5本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于，本實(shí)施例的制備方法中，步驟（4）菌體回收，測定芽孢數(shù)為750億/g；步驟（5）菌劑制備，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是15億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為750.346nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸，吲哚乙酸濃度為95.9mg/L。所述步驟（2）中純化、保存的具體方法為：將步驟（1）培養(yǎng)得到固氮菌菌落于32℃恒溫培養(yǎng)40小時分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，于32℃恒溫培養(yǎng)40小時后置于3℃冰箱中保存。所述步驟（3）的培養(yǎng)基培養(yǎng)對發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時間作進(jìn)一步限定，具體為：（3.1）裝液量：發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的74%；（3.2）接種量：枯草芽孢桿菌T400的接種量為9%；（3.3）培養(yǎng)溫度：枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為34℃；（3.4）轉(zhuǎn)速：發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為285rpm；（3.5）通氣量：枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時間進(jìn)行設(shè)定，接種后0-12小時，通氣量控制在1.1vvm，接種后13-42小時，通氣量控制在1.45vvm，接種后43-48小時，通氣量控制在1.72vvm；（3.6）pH：在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過程中，通過補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.4；（3.7）發(fā)酵時間：根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長情況，設(shè)定48小時為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)中，所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成：CaCO31.3g，MgSO4·7H2O1.1g，K2HPO41.8g，NaCl0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.004g，NaMO4·2H2O0.09g，蔗糖9g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，所述培養(yǎng)基的pH為7.4。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同，這里不再贅述。實(shí)施例6本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于，本實(shí)施例的制備方法中，步驟（4）菌體回收，測定芽孢數(shù)為800億/g；步驟（5）菌劑制備，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是20億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為786.375nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸，吲哚乙酸濃度為99.2mg/L。所述步驟（2）中純化、保存的具體方法為：將步驟（1）培養(yǎng)得到固氮菌菌落于33℃恒溫培養(yǎng)36小時分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落，將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，于33℃恒溫培養(yǎng)36小時后置于5℃冰箱中保存。所述步驟（3）的培養(yǎng)基培養(yǎng)對發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時間作進(jìn)一步限定，具體為：（3.1）裝液量：發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的75%；（3.2）接種量：枯草芽孢桿菌T400的接種量為10%；（3.3）培養(yǎng)溫度：枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為36℃；（3.4）轉(zhuǎn)速：發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為300rpm；（3.5）通氣量：枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時間進(jìn)行設(shè)定，接種后0-12小時，通氣量控制在1.2vvm，接種后13-42小時，通氣量控制在1.6vvm，接種后43-48小時，通氣量控制在1.8vvm；（3.6）pH：在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過程中，通過補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.4；（3.7）發(fā)酵時間：根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長情況，設(shè)定42小時為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)中，所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成：CaCO31.4g，MgSO4·7H2O1.2g，K2HPO42.0g，NaCl0.4g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005g，NaMO4·2H2O0.1g，蔗糖10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，所述培養(yǎng)基的pH為7.4。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同，這里不再贅述。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌T400的16SrDNA基因序列菌種鑒定細(xì)菌的個體微小，形態(tài)簡單，傳統(tǒng)方法鑒定細(xì)菌常根據(jù)它們在生理生化上的不同反應(yīng)作為分類鑒定的主要依據(jù)。20世紀(jì)70年代后期以來，國際上通用的“正式的”或“官方的”細(xì)菌分類方法是以《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》為依據(jù)。在生理生化鑒定中，通常會出現(xiàn)一個或者幾個生理指標(biāo)不符合該菌種所具有的獨(dú)特性質(zhì)，難以明確對該菌株進(jìn)行鑒定。目前，細(xì)菌鑒定的方法通常將菌株的生理生化指標(biāo)與分子生物學(xué)特性相結(jié)合，得出較為可靠地結(jié)論。其中DNA序列分析的16SrRNA基因進(jìn)化發(fā)育系統(tǒng)已經(jīng)成為目前國際上細(xì)菌多相分類鑒定常用的技術(shù)手段(Kimetal，2004；Prapetal，1997)。核糖體16SrDNA基因序列全長約1550bp，是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成。利用保守區(qū)域設(shè)計的通用引物，可以擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16SrDNA片段。16SrDNA序列分析技術(shù)的基本原理是從微生物樣本中提取16SrDNA片段，通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得16SrDNA的序列信息，再與16SrDNA數(shù)據(jù)庫的序列數(shù)據(jù)或者其他數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，確定其在進(jìn)化樹中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。利用16SrDNA片段保守區(qū)域設(shè)計的通用引物，不會對非細(xì)菌的DNA互補(bǔ)，而細(xì)菌的16SrDNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的菌。因此通過對某菌株16SrDNA序列測定來獲得最終鑒定證明的做法是被普遍認(rèn)可的。、鑒定方法（1）PCR反應(yīng)體系(25μL)：10×PCRBuffer2.5μLdNTP(2.5mM)m2.0μL引物27F（10μM）0.5μL引物1492R（10μM）0.5μLDNA模板100ngTaq酶(5U/μL)0.5μLddH2O19μL（2）PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35個循環(huán)，72℃延伸10min。使用ABI3730xlDNA分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行DNA測序。、測序結(jié)果tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaca3、同源性分析鑒定本細(xì)菌為Bacillussubtilis，枯草芽孢桿菌。應(yīng)用例：將本發(fā)明的枯草芽孢桿菌T400菌劑進(jìn)行玉米和水稻盆栽試驗1、育苗將玉米和水稻種子溫水中浸泡過夜，播種于裝有土壤的塑料杯，自然條件育苗12-14天，植株大約10cm時，選擇長勢均勻的玉米和水稻移栽到花盆中。2、土壤預(yù)處理土壤風(fēng)干后，過1mm篩。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。每個花盆分別裝有土壤4.0kg，尿素407mg、過磷酸鈣162mg和硫酸鉀418mg。。3、試驗設(shè)置選用具有自生固氮及促進(jìn)作物生長功能的枯草芽孢桿菌T400菌劑進(jìn)行盆栽效果對比試驗，每盆添加菌劑1g。設(shè)置膨潤土添加為對照實(shí)驗，每盆添加膨潤土1g。每天澆水適量，每盆的水量相同、播灑均勻，不要使水流出盆底以免肥料損失而產(chǎn)生誤差。4、試驗結(jié)果移苗45天后，測定水稻分蘗數(shù)、株高和葉綠素含量。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。第64天后，測定玉米株高、葉片數(shù)及其單株鮮重?？梢缘贸鼋臃NT400枯草芽孢桿菌菌劑可以明顯促進(jìn)玉米和水稻生長，見表2，表3和圖6。表2菌劑T400水稻盆栽試驗結(jié)果注：同列肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).表3菌劑T400玉米盆栽試驗結(jié)果菌株株高(cm)葉片數(shù)(片)單株鮮重(g)T400106.010.542.2CK77.68.829.2從表2，表3和圖6可以看出，利用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌T400菌劑進(jìn)行水稻和玉米盆栽試驗，菌劑T400顯著地提高了水稻的分蘗數(shù)、株高和葉綠素含量，分蘗數(shù)的增加率達(dá)70.67%，株高的增加率為19.34%，葉綠素含量的增加率為49.34%。玉米植株的株高為對照處理的植株株高的1.36倍，葉片數(shù)為對照處理的葉片數(shù)的1.19倍，單株植株鮮重是對照處理的1.44倍。本發(fā)明由廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊項目資助研發(fā)，制得的枯草芽孢桿菌T400及其菌劑具有廣闊的市場前景，經(jīng)濟(jì)效益高。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。SEQUENCELISTING<110>東莞市保得生物工程有限公司<120>一種枯草芽孢桿菌T400及其菌劑制備方法<130>0<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>959<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)T400的16srDNA基因序列<400>1tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagta60acacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccgg120atggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagat180ggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtag240ccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacggga300ggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagt360gatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaata420gggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgc480ggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcgg540tttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggg600aacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatg660tggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaa720gcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgcta780agtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggg840gagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggag900catgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaca959當(dāng)前第1頁1 2 3