本發(fā)明涉及高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖合成酶的基因工程菌及其應(yīng)用，屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

海藻糖(Trehalose)是由兩個吡喃環(huán)葡萄糖以1,1-糖苷鍵連結(jié)而成，是一種穩(wěn)定的非還原性二糖，它有3種光學(xué)異構(gòu)體，即αα型、αβ型和ββ型。

海藻糖是一種安全的非還原性二糖，廣泛存在于自然界中，具有保濕性，抗凍抗干燥性，熱酸穩(wěn)定性等特殊的生物學(xué)功能，對生物大分子有著非特異性的保護(hù)作用，因此在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品、食品等行業(yè)應(yīng)用潛力巨大。自20世紀(jì)80年代后，各國相繼開展了海藻糖生理生化和分子生物學(xué)的研究，該糖現(xiàn)已成為國際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一。

酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖是上世界90年代逐漸興起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和雙酶法這三種方法。當(dāng)前以淀粉為底物經(jīng)過麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即雙酶法生產(chǎn)海藻糖，受到廣泛關(guān)注。以該方法生產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)80％以上，在一定程度上降低了海藻糖的生產(chǎn)成本并極大的推動了海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程。

麥芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)于1990年由意大利的Lama等人在硫礦硫化葉菌(Sulfolbus solfatarius)MT4的無細(xì)胞勻漿中發(fā)現(xiàn)，它是一種合成酶，作用于麥芽寡糖的還原性末端，將α-1,4-糖苷鍵轉(zhuǎn)化為α，α-1,1-糖苷鍵，它能夠麥芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohyrolase,MTHase,3.2.1.141)復(fù)配合成海藻糖。淀粉經(jīng)過高溫液化后加入支鏈淀粉酶作用生成麥芽糊精，麥芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物還原性末端的α,α-1,4-糖苷，產(chǎn)生α,α-1,4-糖苷鍵到α,α-1,1-糖苷鍵的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷作用，形成中間產(chǎn)物麥芽寡糖基海藻糖。麥芽寡糖基海藻糖水解酶則專一的內(nèi)切該中間產(chǎn)物中麥芽寡糖基與海藻糖相連的α,α-1,4-糖苷鍵，使之分解產(chǎn)生海藻糖和減少兩個葡萄糖單位的新麥芽寡糖，減少兩個葡萄糖單位的新麥芽寡糖作為新底物進(jìn)行下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)交替進(jìn)行，兩種酶反應(yīng)就可以將麥芽寡糖轉(zhuǎn)化成海藻糖為主，以及少量葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的產(chǎn)物。

雙酶法生產(chǎn)海藻糖以淀粉為底物，轉(zhuǎn)化率高達(dá)80％以上，具有低成本的優(yōu)點(diǎn)，但是麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因在宿主菌中的可溶性表達(dá)很低，產(chǎn)生較多的包涵體，酶活力低，不利于其工業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個目的是構(gòu)建一種高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，以pPIC3.5k為載體，以Pichiapastoris KM71為表達(dá)宿主；表達(dá)Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909來源的麥芽寡糖基海藻糖水解酶，所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，得到重組菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種所述的基因工程菌的構(gòu)建方法是以pPIC3.5k載體，以Pichiapastoris KM71為表達(dá)宿主；表達(dá)Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909來源的麥芽寡糖基海藻糖水解酶，得到重組菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的方法。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將基因工程菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris活化后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加甲醇誘導(dǎo)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的表達(dá)，收集細(xì)胞，從細(xì)胞破壁上清液中收集得到麥芽寡糖基海藻糖水解酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，配0.9L發(fā)酵培養(yǎng)基置入3L發(fā)酵罐中，于28-32℃，調(diào)節(jié)pH至5.0并校準(zhǔn)溶氧，將基因工程菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris活化后的種子液，控制溶氧在28-32％左右，將轉(zhuǎn)速和通氣偶聯(lián)，確保溶氧穩(wěn)定。待甘油消耗完畢，溶氧將發(fā)生反彈，此時開始流加甘油，流加速率為2.2g/min，至細(xì)胞濃度為OD₆₀₀為150時停止，饑餓1-2h后，流加甲醇，使其體積終濃度維持在1.5％，于30℃開始誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L計含有：MgSO₄·7H₂O 14.9，KOH 4.13，甘油30.0，CaSO₄0.93，K₂SO₄18.2，85％磷酸26.7，微量鹽溶液4.35；微量鹽溶液：CuSO₄·5H₂O 6，ZnCl₂20，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2，CoCl₂0.5，KI 0.08，MnSO₄·H₂O 3，H₃BO₃0.02，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 65，H₂SO₄5.0，生物素0.2。

本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌Ppic3.5k-treY/Pichiapastoris發(fā)酵產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖合成酶活可達(dá)3128.7U·mL^-1，遠(yuǎn)高于本發(fā)明構(gòu)建的其他重組畢赤酵母或者大腸桿菌，具有工業(yè)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1、重組菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁上清(搖瓶)與破壁沉淀(搖瓶)SDS-PAGE電泳圖。泳道1：5OD重組菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁上清；泳道2：5OD重組菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁沉淀。

圖2、重組菌pET-32a(+)-treY/E.coli Origami(DE3)破壁上清與破壁沉淀SDS-PAGE電泳圖，包括重組菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁上清與破壁沉淀的對照。M:proteinmarker；1：E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-treY破壁上清；2：E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY破壁上清；3：E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-treY cell-extrac破壁沉淀；4：E.coliOrigami(DE3)/pET-32a(+)-treY cell-extract破壁沉淀。

圖3、重組菌pSVN-treY/B.brevis破壁上清SDS-PAGE電泳圖。

圖4、重組菌pPic3.5k-treY/Pichiapastoris、pGAPZA-treY/P.pastoris、pGAP3.5k-treY/P.pastoris破壁上清SDS-PAGE電泳圖。1：重組菌Ppic3.5k-treY/Pichiapastoris；2：pGAPZA-treY/Pichiapastoris；3：pGAP3.5k-treY/Pichiapastoris；4：破壁上清SDS-PAGE電泳圖。

圖5、重組菌pPic3.5k-treY/Pichiapastoris3L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線；(1)初始誘導(dǎo)OD₆₀₀對產(chǎn)酶影響；(2)誘導(dǎo)溫度對產(chǎn)酶影響；(3)誘導(dǎo)甲醇濃度對產(chǎn)酶影響。

具體實(shí)施方式

培養(yǎng)基：

1、重組菌pSVN-treY/B.brevis與重組菌pET-32a(+)-treY/E.coli Origami(DE3)相關(guān)培養(yǎng)基：

(1)LB固體培養(yǎng)基的組成為：分子級蛋白胨9-11g/L，分子級酵母粉4-6g/L，NaCl 9-11g/L，瓊脂粉1.5-2％。

(2)LB液體培養(yǎng)基的組成為：分子級蛋白胨9-11g/L，分子級酵母粉4-6g/L，NaCl 9-11g/L，pH 6.8-7.2。

(3)TB發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：甘油4-6g/L，工業(yè)級酵母粉23-25g/L，工業(yè)級蛋白胨11-13g/L，KH₂PO₄2.2-2.4g/L，K₂HPO₄16-17g/L。

2、重組菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris、pGAPZA-treY/P.pastoris、pGAP3.5k-treY/P.pastoris相關(guān)培養(yǎng)基見表1：

表1

3、麥芽寡糖基海藻糖合成酶酶活力分析

以麥芽糊精為底物，20mmol/L的pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液為溶劑配置麥芽糊精溶液。將麥芽糊精溶液用等分移液器按每管1.9mL分裝于10mL的具塞試管中，設(shè)置空白對照并在空白中加入100μlpH＝8.04的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。將試管置于60℃恒溫水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。從冰箱中取出破壁后得到的酶液，用pH＝8.04的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，得到稀釋后的酶液。在預(yù)熱后的試管中加入100μl酶液，震蕩搖勻，于60℃水浴鍋中反應(yīng)10min，精確計時后加入2mL 6mol/L氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，同時在對照中加入2mL 6mol/L氫氧化鈉溶液。取100μl反應(yīng)終止后的溶液，加入另一支15mL具塞試管中。再向試管中加入1.9mL的去離子水和3mL的DNS溶液，用DNS顯色法測定其吸光度。以每分鐘內(nèi)使相當(dāng)于葡萄糖減少1μg的酶量定義為一個酶活力單位。

實(shí)施例1

(1)pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)的構(gòu)建

pET-24a(+)-treY由捷瑞公司直接合成，轉(zhuǎn)表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)，涂布LB固體培養(yǎng)基(含100μg·mL^-1氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，挑取單菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基(含100μg·mL^-1氨芐青霉素)37℃培養(yǎng)8h后保甘油菌。

(2)重組菌pET-32a(+)-treY/E.coli Origami(DE3)的構(gòu)建

以pET-24a(+)-treY為模板，以表2中F7、R7為正、反向引物，擴(kuò)增目的基因片段。將PCR所得到的基因片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離使用膠回收試劑盒回收?；厥盏幕蚱闻c經(jīng)EcoRI和Hind III酶切純化后的載體pET-32a(+)(為商品化載體)，用T4DNAligase于4℃連接16h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coli JM109涂布LB固體培養(yǎng)基(含30μg·mL^-1Kana)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h，挑取單菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基(含30μg·mL-1Kana)37℃培養(yǎng)8h后，收集菌體抽提質(zhì)粒，送測序公司測序。

(3)重組菌pSVN-treY/B.brevis構(gòu)建

重組菌pSVN-treY/B.brevis構(gòu)建過程同上述(2)類似，pSVN購自寶生物工程(大連)有限公司，所用引物為表2中F1，R1。

表2

(4)重組菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris的構(gòu)建

E.coli JM109/pET-24a(+)-treY(S.acidocaldarius ATCC 33909)，它的酶切位點(diǎn)為Nde I和HindIII，但表達(dá)載體pPIC3.5K沒有它們的酶切位點(diǎn)，因此需要通過設(shè)計PCR引物導(dǎo)入EcoR I和Not I兩個酶切位點(diǎn)，然后與T載連接，最后與pPIC3.5K分別進(jìn)行雙酶切并連接。

將PCR得到的基因片段通過瓊脂糖凝膠電泳的方法分離，然后用膠回收試劑盒回收目的基因片段，將回收的片段連接至pMD18-T simple vector，然后熱激轉(zhuǎn)化到克隆宿主E.coli JM109中，并涂布于帶氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h后，挑選單菌落，再通過LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8h后，離心得到菌體并提質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后送到測序公司測序。測序確認(rèn)正確后，從E.coli JM109中提取質(zhì)粒，用EcoR I和Not I雙酶切與雙酶切后的pPIC3.5K相連，形成重組質(zhì)粒。熱激轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，培養(yǎng)后離心提質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后送到測序公司測序。

為了導(dǎo)入酵母細(xì)胞，需要將重組質(zhì)粒通過Sac I酶進(jìn)行線性化，線性化體系如下表3，最后將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。

表3

(5)pGAPZA-treY/P.pastoris、pGAP3.5k-treY/P.pastoris的構(gòu)建同上述(4)過程類似。引物設(shè)計如下：

pGAPZA-treY/P.pastoris

F：GAATTCATGATTAGCGCGACCTAT

R：GCGGCCGCTTACATACGCACCAG

pGAP3.5k-treY/P.pastoris：

F:GAGCTC TTT TTG TAG AAA TGT CTT

R:GGATCC ATA GTT GTT CAA TTG ATT

實(shí)施例2搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶

(1)pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)

從-80℃冰箱取出保存的甘油菌，用移液槍吸取10μL菌液接種于10mL LB液體培養(yǎng)基(加入終濃度30μg·mL^-1Kana或100μg·mL^-1Amp)中，置于37℃恒溫?fù)u床，200r·min^-1，培養(yǎng)8-10h，作為種子液。

將培養(yǎng)好的種子液以4％的接種量接入40mL TB培養(yǎng)基(加入終濃度30μg·mL^-1Kana或100μg·mL^-1Amp)中，置于37℃恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200r·min^-1，培養(yǎng)2h；加入終濃度0.05-0.4mmol·L^-1IPTG，25℃，轉(zhuǎn)速200r·min^-1，培養(yǎng)24-48h。發(fā)酵液離心去上清，收集菌體，用等體積20mmol·L^-1pH 8.0Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，離心取上清液，得到粗酶液(圖2)，搖瓶菌體破壁測得粗酶液酶活為133.2U/mL。

(2)pET-32a(+)-treY/E.coli Origami(DE3)

pET-32a(+)-treY/E.coli Origami(DE3)的發(fā)酵過程及條件同pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)。發(fā)酵液離心去上清，收集菌體，用等體積20mmol·L^-1pH 8.0Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，離心取上清液，得到粗酶液，搖瓶菌體破壁測得酶活為227.4U/mL。

(3)pSVN-treY/B.brevis

從-80℃冰箱取出保存甘油菌，用移液槍吸取10μL菌液接種于含10μg·mL^-1新霉素的TM液體培養(yǎng)基(裝液量10/50mL)中，置于37℃恒溫?fù)u床，200r·min^-1，培養(yǎng)10-12h，作為種子液。

將培養(yǎng)好的種子液以5％的接種量接入含10μg·mL^-1新霉素的TM培養(yǎng)基(裝液量40/250mL)中，置于30℃恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200r·min-¹，培養(yǎng)60h。發(fā)酵液離心去上清，收集菌體，用等體積20mmol·L^-1pH 8.0Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，經(jīng)溶菌酶于37℃處理20min，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，離心取上清液，得到粗酶液(圖3)，搖瓶菌體破壁測得酶活為89.6U/mL。

(4)pPIC3.5k-treY/Pichiapastoris

從-80℃冰箱取出保存甘油菌，用移液槍吸取10μL菌液接種于YPD培養(yǎng)基中(裝液量10/50mL)，培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液取2.5mL接種于50mL BMGY培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

將上述培養(yǎng)液5000r/min離心5min，用25mL BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，加入甲醇使其終濃度為40g/L，之后每24h流加375μL甲醇，培養(yǎng)120h后停止，用高壓勻漿儀器破壁、離心取上清液獲得粗酶液(圖4)，搖瓶菌體破壁測得酶活為559.8U/mL。

(5)pGAPZA-treY/P.pastoris、pGAP3.5k-treY/P.pastoris均用下述方法：

從-80℃冰箱取出保存甘油菌，用移液槍吸取10μL菌液接種于YPD培養(yǎng)基中(裝液量10/50mL)，培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液取2.5mL接種于50mLYPD培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h停止，用高壓勻漿儀器破壁、離心取上清液獲得粗酶液(圖4)；pGAP3.5k-treY/Pichiapastoris，菌體破壁、離心取上清液測得酶活為111U/mL，pGAPZA-treY/P.pastoris，菌體破壁、離心取上清液測得酶活為36.5U/mL。

實(shí)施例3不同初始誘導(dǎo)菌體濃度對重組菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

1、種子培養(yǎng)：

取保藏于-80℃冰箱Ppic3.5k-treY/P.pastoris甘油管中的高拷貝菌株，接200μl菌液于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h。

2、發(fā)酵產(chǎn)酶：

取保藏于-80℃冰箱甘油管中的高拷貝菌株，接200μl菌液于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h。配1L發(fā)酵培養(yǎng)基置入3L發(fā)酵罐中，于121℃，1.03kPa進(jìn)行實(shí)滅。滅菌結(jié)束后，連通通氣導(dǎo)管，對發(fā)酵罐通冷凝水進(jìn)行降溫。等溫度降到30℃后，調(diào)節(jié)pH至5.0并校準(zhǔn)溶氧。將培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液全部倒入發(fā)酵罐中，控制溶氧在30％左右，將轉(zhuǎn)速和通氣偶聯(lián)，確保溶氧穩(wěn)定。待種子培養(yǎng)基中的甘油消耗完畢，溶氧將發(fā)生反彈，此時開始流加甘油，細(xì)胞濃度OD₆₀₀分別為100、150、200時停止流加甘油。饑餓1-2h后，加入一定濃度的甲醇，開始誘導(dǎo)產(chǎn)酶。結(jié)果表明當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到150時停止流加甘油，酶活最高達(dá)到3128.7U·mL^-1(圖5)。

實(shí)施例4不同誘導(dǎo)溫度對重組菌pPic3.5k-treY/P.pastoris發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

1、種子培養(yǎng)：

取保藏于-80℃冰箱Ppic3.5k-treY/P.pastoris甘油管中的高拷貝菌株，接200μl菌液于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h。

2、發(fā)酵產(chǎn)酶：

取保藏于-80℃冰箱甘油管中的高拷貝菌株，接200μl菌液于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h。配1L發(fā)酵培養(yǎng)基置入3L發(fā)酵罐中，于121℃，1.03kPa進(jìn)行實(shí)滅。滅菌結(jié)束后，連通通氣導(dǎo)管，對發(fā)酵罐通冷凝水進(jìn)行降溫。等溫度降到30℃后，調(diào)節(jié)pH至5.0并校準(zhǔn)溶氧。將培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液全部倒入發(fā)酵罐中，控制溶氧在30％左右，將轉(zhuǎn)速和通氣偶聯(lián)，確保溶氧穩(wěn)定。待種子培養(yǎng)基中的甘油消耗完畢，溶氧將發(fā)生反彈，此時開始流加甘油至細(xì)胞濃度為150時停止流加甘油。饑餓1-2h后，加入一定濃度的甲醇，開始誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)溫度分別為28℃、30℃、32℃，結(jié)果表明，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30℃時酶活最高達(dá)到3128.7U·mL^-1(圖5)。

實(shí)施例5不同誘導(dǎo)甲醇濃度對重組菌pPic3.5k-treY/P.pastoris發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

1、種子培養(yǎng)：

取保藏于-80℃冰箱Ppic3.5k-treY/P.pastoris甘油管中的高拷貝菌株，接200μl菌液于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h。

2、發(fā)酵產(chǎn)酶：

取保藏于-80℃冰箱甘油管中的高拷貝菌株，接200μl菌液于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h。配1L發(fā)酵培養(yǎng)基置入3L發(fā)酵罐中，于121℃，1.03kPa進(jìn)行實(shí)滅。滅菌結(jié)束后，連通通氣導(dǎo)管，對發(fā)酵罐通冷凝水進(jìn)行降溫。等溫度降到30℃后，調(diào)節(jié)pH至5.0并校準(zhǔn)溶氧。將培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液全部倒入發(fā)酵罐中，控制溶氧在30％左右，將轉(zhuǎn)速和通氣偶聯(lián)，確保溶氧穩(wěn)定。待種子培養(yǎng)基中的甘油消耗完畢，溶氧將發(fā)生反彈，此時開始流加甘油至細(xì)胞濃度為150時停止流加甘油。饑餓1-2h后，加入一定濃度的甲醇，開始誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)甲醇濃度分別為1％、1.5％、2％，當(dāng)誘導(dǎo)甲醇濃度為1.5％時酶活最高達(dá)到3128.7U·mL^-1(圖5)。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。