專利名稱：：葡糖淀粉酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有改進(jìn)性質(zhì)的葡糖淀粉酶變體和使用所述葡糖淀粉酶變體的方法。背景葡糖淀粉酶(1，4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶(1,4-alpha-D-glucanglucohydrolase):EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖從淀粉或相關(guān)的寡糖和多糖分子的非還原端釋放的酶。葡糖淀粉酶由幾種絲狀真菌和酵母產(chǎn)生。商業(yè)上，使用葡糖淀粉酶將已經(jīng)用a-淀粉酶部分水解的玉米淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在高果糖玉米糖漿(HFCS)生產(chǎn)中，通過(guò)葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)一步將葡萄糖轉(zhuǎn)化為由幾乎相等的葡萄糖和果糖組成的混合物。這種混合物是普遍使用的高杲糖玉米糖漿，其商業(yè)化遍布全球。對(duì)于高果糖玉米糖漿使用最多的是和黑曲霉(^^erg說(shuō)^m'gw)的葡糖淀粉酶。在商業(yè)上用于高果糖玉米糖漿生產(chǎn)的高固體濃度下，葡糖淀粉酶由通過(guò)縮合產(chǎn)生的葡萄糖合成二糖、三糖和四糖。這種情況的發(fā)生是由于淀粉中a-G—6)-D-糖苷鍵的緩慢水解和由D-葡萄糖形成多種積累的縮合產(chǎn)物，主要是異麥芽糖。因此，轉(zhuǎn)化方法中的葡萄糖產(chǎn)率不超過(guò)理論產(chǎn)率的95%。全世界通過(guò)這種方法產(chǎn)生的HFCS量非常大，而在每噸淀粉的葡萄糖產(chǎn)率上即使非常小的增加在商業(yè)上也是重要的。本發(fā)明的目的是減少特定葡糖淀粉酶的縮合產(chǎn)物的形成，所述葡糖淀粉酶可以從真菌生物，特另ll是踝節(jié)菌屬(T^/a7"7"c&ygenus)和曲霉屬(v4，rg/腸genus)的菌抹獲得，并且已經(jīng)基于它們的合適性質(zhì)，例如淀粉轉(zhuǎn)化中的性質(zhì)，對(duì)所述葡糖淀粉酶本身進(jìn)行了選擇。發(fā)明簡(jiǎn)述申請(qǐng)人們目前發(fā)現(xiàn)通過(guò)在親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的特殊區(qū)域中的特殊位置引入一些變化，來(lái)降低形成a-(l-6)鍵的速率，和/或減少異麥芽糖的形成。葡糖淀粉酶切割并因而形成a-(l-6)鍵的速率相對(duì)于其切割a-(l-4)鍵的速率的降低具有實(shí)際意義。葡糖淀粉酶能夠在副產(chǎn)品量顯著減少的情況下產(chǎn)生葡萄糖，這將有重要的商業(yè)意義，例如，從淀粉生產(chǎn)甜味劑時(shí)。本發(fā)明的發(fā)明人提供了親本葡糖淀粉酶的許多變體，所述變體顯示減少的縮合。通過(guò)在糖化方法中使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體，能夠產(chǎn)生具有非常高葡萄糖百分比的糖漿。通過(guò)突變，例如通過(guò)在親本葡糖淀粉酶中取代和/或缺失和/或插入選4奪的位置來(lái)獲得減少的縮合。這將在下文中詳細(xì)描述。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及親本葡糖淀粉酶的變體，當(dāng)與親本葡糖淀粉酶比較時(shí)，所述變體葡糖淀粉酶的縮合產(chǎn)物產(chǎn)量減少。因此，在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及親本葡糖淀粉酶的變體，其在以下區(qū)域之一中包含變化區(qū)域248-255，例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一個(gè)或多個(gè)中，區(qū)域309-318,例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一個(gè)或多個(gè)中，和/或區(qū)域409-415,例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一個(gè)或多個(gè)中，其中(a)所述變化獨(dú)立地是(i)在占據(jù)該位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)缺失占據(jù)該位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占據(jù)該位置的氨基酸，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性，并且(c)各位置相應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基g復(fù)序列的區(qū)域或位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或相應(yīng)于同源葡糖淀粉酶中的區(qū)域或位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基Sll序列顯示至少50%同源性。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及DNA構(gòu)建體，其包含編碼根據(jù)第一個(gè)方面的葡糖淀粉酶變體的DNA序列。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，其攜帶根據(jù)第二個(gè)方面的DNA構(gòu)建體。在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞，將所述細(xì)胞用根據(jù)第二個(gè)方面的DNA構(gòu)建體或根據(jù)第三個(gè)方面的載體轉(zhuǎn)化。在第六個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)第四個(gè)方面的細(xì)胞，所述細(xì)胞是微生物，尤其是細(xì)菌或真菌。在第七個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于將淀粉或部分水解的淀粉轉(zhuǎn)化為含有葡萄糖(dextrose)的糖漿的方法，所述方法包括在根據(jù)第一個(gè)方面的葡糖淀粉酶變體存在下糖化淀粉水解物。在另外的方面，本發(fā)明涉及第一或第二方面中任一的葡糖淀粉酶在淀粉轉(zhuǎn)化方法中，優(yōu)選在連續(xù)淀粉轉(zhuǎn)化方法中的用途；在用于產(chǎn)生寡糖、麥芽糊^f青或葡萄糖糖漿的方法中的用途；在用于產(chǎn)生高果糖玉米糖漿的方法中的用途；在用于產(chǎn)生酒精飲料(alcoholicbeverage)、燃料或飲用乙醇的方法中的用途；和/或在用于產(chǎn)生有機(jī)化合物的發(fā)酵方法中的用途。發(fā)明詳述使用的定義命名法在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，對(duì)于氨基酸殘基使用常規(guī)的一字母和三字母密碼子。為了易于參考，通過(guò)以下命名法的使用來(lái)描述本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體原始氨基酸:位置:取代氨基酸。根據(jù)這種命名法，例如在位置30用天冬酰胺取代丙氨酸表示為A30N,在相同位置中缺失丙氨酸表示為A30*,而插入額外的氨基酸殘基例如賴氨酸顯示為A30AK。缺失相鄰的氨基酸殘基段，例如氨基酸殘基30-33,表示為A(A30-N33)。當(dāng)特定葡糖淀粉酶與其它葡糖淀粉酶相比含有"缺失"并且在此位置進(jìn)行插入時(shí)，將在位置36中插入天冬氨酸的情況表示為*36D。通過(guò)加號(hào)分隔多個(gè)突變A30N+E34S分別代表在位置30和34用天冬酰胺和絲氨酸取代丙氨酸和谷氨酸的突變。也可如下分隔多個(gè)突變，意思與加號(hào)相同，即A30N/E34S當(dāng)在給定位置可以插入一種或多種可選氨基酸殘基時(shí)，表示為A30N或A30E。此外，當(dāng)本文鑒定了適合于修飾的位置未建議任何具體的修飾時(shí)，應(yīng)理解為任何氨基酸殘基可取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當(dāng)提到在位置30的丙氨酸的修飾但是未指定時(shí)，應(yīng)理解為可將所述丙氨酸缺失或由任何其它氨基酸取代，即R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V中的任一。才艮才居V/.R.TaylorinTheClassificationofAminoAcidConservation,J.Theor.Biol,119(1986)205-218中的定義，將術(shù)語(yǔ)"極性"(C、T、S、D、N、Y、W、H、K、E、R、Q)、"非才及性，，(A、C、V、I、L、M、K、F、Y、W、H)、"月旨肪族"(V、I、L)、"芳族，，(F、Y、W、H)、"小，，(A、C、D、G、N、P、T、S)、"微小(tiny)"(A、C、G、T、S)、"帶電荷"(K、R、D、E)用于氨基酸殘基。此外，將術(shù)語(yǔ)"六元環(huán)芳族"用于含有非融合六元芳香環(huán)體系的氨基酸殘基(即F、Y)。還將術(shù)語(yǔ)"陰性，，用于在中性pH具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸殘基(即D、E)。在本發(fā)明的上下文中，可將同源性作為兩個(gè)序列之間同一性的程度測(cè)定，表示第一序列從第二序列衍生。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序的方法來(lái)合適地測(cè)定同源性，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP(上文所述)。因此，可以按照用于同一性的默認(rèn)計(jì)分矩陣和以下默認(rèn)參數(shù)來(lái)使用GapGCGv8:對(duì)于核酸序列比較分別是GAP產(chǎn)生罰分(GAPcreationpenalty)為5.0和GAP延伸罰分(GAPextensionpenalty)為0.3;而對(duì)于蛋白質(zhì)序列比較分別是GAP創(chuàng)造罰分為3.0和GAP延伸罰分為0.1。GAP使用NeedlemanandWunsch,(1970),J.Mol.Biol.48,p.443-453的方法來(lái)進(jìn)行比對(duì)并且計(jì)算同一性?？梢詫EQIDNO:1/SEQIDNO:2和另一種葡糖淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)比對(duì)用于鑒定等同/相應(yīng)的位置。獲得所述結(jié)構(gòu)比對(duì)的一種方法是^f吏用來(lái)自GCG程序包的PileUp程序，使用缺口罰分(gappenalty)的默認(rèn)值，即，缺口產(chǎn)生罰分為3.0和缺口延伸罰分為0.1。其它結(jié)構(gòu)比對(duì)方法包括疏水蔟分析(Gaboriaudetal.，(1987),FEBSLETTERS224,pp.149-155)和反向穿線(reversethreading)(Huber，T;Torda,AE，PROTEINSCIENCEVol.7，No.1pp.142-149(1998)。在本發(fā)明的上下文中，"源自"不僅表示由所述生物的菌抹產(chǎn)生或可由所述生物的菌抹產(chǎn)生的葡糖淀粉酶，并且還表示由分離自這種菌抹的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶和用所述DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物中產(chǎn)生的葡糖淀粉酶。最終，該術(shù)語(yǔ)旨在表示由合成和/或cDNA來(lái)源的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶，并且其具有所述葡糖淀粉酶的鑒別特征。該術(shù)語(yǔ)還旨在表示親本葡糖淀粉酶可以是天然存在的葡糖淀粉酶的變體，即作為修飾(插入、取代、缺失)天然存在的葡糖淀粉酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的結(jié)果而得到的變體。本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體本發(fā)明提供親本葡糖淀粉酶的變體，其包含在以下區(qū)域之一中的變化區(qū)域248-255,例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255中,區(qū)域309-318,例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318中，和/或區(qū)域409-415,例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415，其中(a)所述變化獨(dú)立地是(i)在占據(jù)該位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)缺失占據(jù)該位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占據(jù)該位置的氨基酸，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性，并且(c)各區(qū)域和/或位置相應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酉拼列，和/或相應(yīng)于同源葡糖淀粉酶中的區(qū)域和/或位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酉1^列顯示至少50%同源性。優(yōu)選在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)包含變化的變體252、312、314、315、412,其中每個(gè)位置相應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S吏序列。優(yōu)選在相應(yīng)于SEQIDNO:2中L252的位置是被任何非極性殘基取代(A、C、F、G、H、I、K、M、V、W、Y);更優(yōu)選是被非極性殘基，同時(shí)也是小殘基取代(V、C、A、G);甚至更優(yōu)選是被非極性殘基，同時(shí)也是微小殘基取代(A、G),并且最優(yōu)選是被殘基A取代。優(yōu)選在相應(yīng)于SEQIDN〇2中V312的位置是一皮任何極性殘基取代(C、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、W、Y);更優(yōu)選是,皮極性殘基，同時(shí)也是小殘基取代(C、T、S、D、N);甚至更優(yōu)選是被極性殘基，同時(shí)也是微小殘基取代(C、T、S)，并且最優(yōu)選是被殘基S取代。優(yōu)選在相應(yīng)于SEQIDNO:2中Q314的位置是凈皮任何極性、脂肪族或芳族殘基取代(C、D、E、F、H、I、K、L、N、R、S、T、V、W、Y);更優(yōu)選是被帶電荷、脂肪族或芳族殘基取代(D、E、F、H、I、K、L、R、V、W、Y);更優(yōu)選是被脂肪族或芳族殘基取代(F、H、I、L、V、W、Y);更優(yōu)選是被芳族殘基取代(F、H、W、Y);甚至更優(yōu)選是被芳族殘基，同時(shí)也是六元環(huán)芳族殘基取代(F、Y),并且最優(yōu)選是被殘基Y取代。優(yōu)選在相應(yīng)的位置中，在SEQIDNO:2的Q314之后的插入是以任何脂肪族或芳族殘基插入(V、I、L、F、Y、W、H);更優(yōu)選是以脂肪族殘基插入(V、I、L);并且最優(yōu)選插入殘基I。優(yōu)選在相應(yīng)于SEQIDNO:2中G315的位置是被任何非極性殘基(A、C、F、H、I、K、L、M、V、W、Y)取代、被極性殘基取代或被不是小殘基的殘基取代(C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、Y);還優(yōu)選是一皮小殘基或帶電荷殘基取^/.(D、E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W、Y);更優(yōu)選是被不是小殘基的殘基取代(E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W、Y)或被既不是小殘基也不是正電殘基的殘基取代(E、F、H、I、L、M、Q、W、Y)或被既不是小殘基也不是負(fù)電殘基的殘基取代(1、L、M、F、Y、W、H、K、R),或被芳族或脂肪族殘基取代，所述殘基也不是小殘基(F、Y、W、H、I、L),或被芳族或脂肪族殘基取代，所述殘基既不是小殘基也不是帶電荷殘基(F、Y、W、I、L);或更優(yōu)選是被芳族殘基并且不是帶電荷殘基(F、Y、W)取代；甚至更優(yōu)選是芳族殘基并且還是六元環(huán)芳族殘基(F、Y);并且最優(yōu)選是被殘基Y取代。優(yōu)選在相應(yīng)于SEQIDNO:2中L412的位置是被任何極性殘基(C，D,E,H,K,N，Q,R,S,T,W,Y)取代；更優(yōu)選是^皮帶電荷殘基(H，K,R,E,D)取代；還更優(yōu)選是被負(fù)電殘基(D,E)取代；并且最優(yōu)選是被殘基D取代。更優(yōu)選的是包含以下變化中的一種或多種的變體在位置252取代為A、F、G或V;在位置312取代為S，在位置314取代為E、F、N、R、T、W或Y;在位置315取代為A、D、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y，在位置412取代為D，或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I,其中每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于具有SEQIDNO:2的氨基S吏序列的親本葡糖淀粉酶氨基S1^列中的位置。甚至更優(yōu)選的是包含以下取代組合中的一個(gè)或多個(gè)的變體314F+315N、314W+315N、314Y+315N、314L+315A、314N+315R、314R+315D、315R+463T、315R+556E、315L+529N,其中每個(gè)位置相應(yīng)于具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中的位置，并且尤其是包含一個(gè)或多個(gè)以下取代的變體:V312S、Q314E、Q314F、Q314N、Q314R、Q314T、Q314W、Q314Y、G315A、G315D、G315F、G315H、G315K、G315L、G315N、G315Q、G315R、G315S、G315T、G315Y、L252A、L252F、L252G、L252V、L412D或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I(Q314QI)，其中每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶氨基S菱序列中的位置。更優(yōu)選的是包含以下取代組合中的一個(gè)或多個(gè)的變體Q314F和G315N、Q314W和G315N、Q314Y和G3I5N、Q314L和G315A、Q314N和G315R、Q314R和G315D、G315R和A463T、G315R和K556E、G315L和D529N,其中每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于具有SEQIDNO:2的氨基S史序列的親本葡糖淀粉酶氨基酸序列中的位置。本發(fā)明的變體可以具有SEQIDNO:2的成熟葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性的至少20°/。，優(yōu)選至少40°/。，更優(yōu)選至少60°/。，甚至更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%,并且最優(yōu)選至少100%。相對(duì)于SEQIDNO:2的親本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶，本發(fā)明的變體可以具有降^(氐至少5%,優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少15%,甚至更優(yōu)選至少20%,更優(yōu)選至少25%,并且最優(yōu)選至少30%的縮合。親本葡糖淀粉酶根據(jù)本發(fā)明預(yù)期的親本葡糖淀粉酶包括野生型葡糖淀粉酶、真菌葡糖淀粉酶，尤其是可以從踝節(jié)菌屬獲得的真菌葡糖淀粉酶，尤其是可以從W〇99/28448中(參見(jiàn)WO99/28448的SEQIDNO:7)和本丈SEQIDNO:2中公開(kāi)的7:eweraow7獲得的真菌葡糖淀粉酶。在另外的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶主鏈源自曲霉屬菌抹，例如黑曲霉04sj^rgz7/im'ger)或泡盛曲霉C4sperg"/wsawamon')葡糖淀粉酶和它們的變體或突變體，同源葡糖淀粉酶，和與它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和/或功能上相似的其它葡糖淀粉酶。優(yōu)選地，親本葡糖淀粉酶包含選自下列的一個(gè)或多個(gè)特異性氨基酸殘基；位置252的氨基酸殘基L，位置314的氨基酸殘基Q,位置315的氨基酸殘基G和位置412的氨基酸殘基L。優(yōu)選地，親本葡糖淀粉酶包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；或其等位變體；或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。SEQIDNO:2的片段是從此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。等位變體表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。合適的親本葡糖淀粉酶可以是具有以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%，優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少大約70%,還更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少98%的同一性程度(即同源親本葡糖淀粉酶)。同源親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以因插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和/或用不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不同于SEQIDNO:2的氨基酸序列。優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是不重要的(ofaminornature),即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小缺失，通常為1至大約30個(gè)氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，例如多組氨酸區(qū)(tract)、抗原表位或結(jié)合域。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的親本葡糖淀粉酶由核酸序列編碼，所述核酸序列在非常低嚴(yán)緊條件，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件，還更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件，并最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針在相同條件下與下述雜交(i)SEQIDNO:1的核酸序列，(ii)SEQIDNO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)《連。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的親本葡糖淀粉酶由核酸序列編碼，所述核酸序列在非常低嚴(yán)緊條件，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件，還更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件，并最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下與下述雜交(i)SEQIDNO:1的核酸序列，(ii)SEQIDNO:1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈。用于測(cè)試雜交的合適條件包括在5xSSC中預(yù)浸和在20%曱酰胺、5x登哈特溶液(Denhardt，ssolution)、50mM磷酸鈉，pH6.8和50mg變性的經(jīng)聲處理的小牛胸腺DNA的溶液中在4(TC預(yù)雜交1小時(shí)，然后是在補(bǔ)充有的相同溶液中在4(TC雜交18小時(shí)，然后是將濾器在2xSSC,0.2%SDS中在40。C(低嚴(yán)緊性)，優(yōu)選在50。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在65。C(高嚴(yán)緊性)，還更優(yōu)選在75。C(非常高嚴(yán)緊性)三次洗滌30分鐘。(J.Sambrook,E.RFritsch,andT,Maniatus,淺9,M)/ecw/arC7om.喂爿丄a6orafory她麗aZ,2ndedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的亞序列可為至少100個(gè)核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)核苦酸。而且，所述亞序列可編碼多肽片段，其具有葡糖淀粉酶活性。親本多肽還可以是具有葡糖淀粉酶活性的所述多肽等位變體或片段。SEQIDNO:1的核酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段可以用于設(shè)計(jì)核酸探針以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌抹中鑒定和克隆編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以在其中鑒定和分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序13列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少15,優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸。也可以使用更長(zhǎng)的探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。因此，可篩選由這些其它生物制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中的DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有葡糖淀粉酶的多肽?？梢酝ㄟ^(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)來(lái)分離來(lái)自這些其它生物的基因組或其它DNA?？梢詫?lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將載體材料用于Southern印跡。就本發(fā)明而言，雜交表示核酸序列在非常低到非常高嚴(yán)緊條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針相應(yīng)于SEQIDNO:1所示的核酸序列，它的互補(bǔ)鏈或其亞序列。使用X-光片檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，使用2xSSC、0.2%SDS,優(yōu)選在45°C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在6S。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)，將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。期望的親本葡糖淀粉酶具有至少20%,優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少60%,甚至更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%，并且最優(yōu)選至少100%的SEQIDNO:2的成熟葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性?？寺【幋a親本葡糖淀粉酶的DNA序列可以使用多種本領(lǐng)域熟知的方法，從產(chǎn)生所述葡糖淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物分離編碼親本葡糖淀粉酶的DNA序列。首先，應(yīng)該使用染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)，所述染色體DNA或信使RNA來(lái)自產(chǎn)生待研究的葡糖淀粉酶的生物。然后，如果葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并且用于從由所述生物制備的基因組文庫(kù)中鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆?；蛘?，可以使用非常低至非常高嚴(yán)緊性的雜交和洗滌條件，使用含有與其它已知葡糖淀粉酶基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針作為探針來(lái)鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆。這在上文描述。用于鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆的另一種方法可涉及將基因組DNA的片段插入表達(dá)載體，例如質(zhì)粒；用所得基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化葡糖淀粉酶陰性細(xì)菌；其后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布在含有用于葡糖淀粉酶的底物(即，麥芽糖)的瓊脂上，從而使表達(dá)該葡糖淀粉酶的克隆得以鑒定?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如S丄.Beaucage和M.H.Caruthers,(1981),TetrahedronLetters22,p.1859-1869描述的亞磷酰胺(phosphoroamidite)方法，或由Matthesetal,,(1984),EMBOJ.3,p.801-805描述的方法來(lái)合成制備編碼所述酶的DNA序列。在亞磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自動(dòng)DNA合成儀中合成；純化；退火；連4秦并且克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中。最后，該DNA序列可以是基因組和合成混合來(lái)源，合成和cDNA混合來(lái)源，或基因組和cDNA混合來(lái)源，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)連接合成來(lái)源、基因組來(lái)源或cDNA來(lái)源的片段來(lái)制備(這些片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)DNA序列的不同部分，視情況而定)。也可以使用特異性引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)制備該DNA序列，例如US4,683,202或R.K.Saikietal.,(1988),Science239,1988，pp.487-491中所述。定點(diǎn)誘變一旦將編碼葡糖淀粉酶的DNA序列分離，并且鑒定了用于突變的期望位點(diǎn)，則可以使用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核香酸含有側(cè)翼為期望突變位點(diǎn)的核苷酸序列。在特定方法中，在含有所述葡糖淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生DNA的單鏈缺口，所述DNA是編碼葡糖淀粉酶的序列。然后將含有期望突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(幻enow片段)填補(bǔ)剩余的缺口，并且使用T4連接酶連接構(gòu)建體。這種方法的特定實(shí)例在Morinagaetal"(1984)，Biotechnology2,p.646-639中描述。US4,760,025乂i^開(kāi)了通過(guò)進(jìn)行盒的較小改變(minoralterationofthecassette)來(lái)引入編碼多個(gè)突變的寡核苷酸。然而，因?yàn)槟軌蛞攵喾N長(zhǎng)度的大量寡核苷酸，可以通過(guò)Morinaga方法在任一時(shí)間引入甚至更多種突變。用于將突變引入編碼葡糖淀粉酶的DNA序列的另一種方法在NelsonandLong,(1989)，AnalyticalBiochemistry180，p.147-151中描述。其涉及三步產(chǎn)生包含期望突變的PCR片段，所述突變通過(guò)使用化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)中的引物之一來(lái)引入。從PCR產(chǎn)生的片段中，可以通過(guò)用限制性內(nèi)切酶切割來(lái)分離攜帶所述突變的DNA片段，并且再插入至表達(dá)質(zhì)粒。jt匕夕卜,Sierks.etal.，(1989)"Site-directedmutagenesisattheactivesiteTip120ofJ^pergz7/wmvi37wn'glucoamylase.ProteinEng.，2,621-625;Sierksetal.,(1990),"Determinationofy^戸'g77/wsa而,Wglucoamylasecatalyticmechanismbysite-directedmutagenesisatactivesiteAspl76,Glul79,andGlul80".ProteinEng.vol.3,193-198;也描述曲霉屬葡糖淀粉酶中的定點(diǎn)誘變。表達(dá)葡糖淀粉酶變體根據(jù)本發(fā)明，可以使用表達(dá)載體以酶的形式來(lái)表達(dá)通過(guò)上述方法或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何可選方法產(chǎn)生的編碼葡糖淀粉酶變體的DNA序列，所述表達(dá)載體通常包含調(diào)控序列，其編碼啟動(dòng)子、操縱基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯初始信號(hào)和任選地阻抑基因或多種激活基因。表達(dá)載體攜帶編碼本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何載體，其可以方便地進(jìn)行重組DNA方法，并且載體的選擇將通常依賴于待引入該載體的宿主細(xì)胞。載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到宿主細(xì)胞基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。合適的表達(dá)載體的實(shí)例包括PMT838。啟動(dòng)子在載體中，應(yīng)該將DNA序列與合適的啟動(dòng)子序列可操作地連接。啟動(dòng)子可以是任何DNA序列，其在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性，并且可以源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。用于指導(dǎo)編碼本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的DNA序列的轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是大腸桿菌的/ac操縱子的啟動(dòng)子、天藍(lán)色《連霉菌(&repto,nycacoWco/or)瓊脂酶基因abg^啟動(dòng)子、地衣芽孢桿菌Wflc/〃M//c/7em/onm》a-淀粉酶基因(amy丄)的啟動(dòng)子、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Ba"7/mWearaAerwo;/7itf)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(am，y竭的啟動(dòng)子、解淀粉芽孑包4干菌(B"c/〃ma"^/o//gwe^zcz'ew)a-淀4分酵(amj^)的啟動(dòng)子、診古草芽孑包4于菌Wac/〃w5m^7/力xylA和xylB基因的啟動(dòng)子等。對(duì)于在真菌宿主中的轉(zhuǎn)錄，有用啟動(dòng)子的實(shí)例是源自下列的那些啟動(dòng)子編碼米曲霉(Aorj^fle)TAKA淀粉酶的基因、來(lái)自釀酒酵母(S.cewvWae)的TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)啟動(dòng)子(Alberetal.(1982),J.Mol.Appl.Genet1,p.419-434)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Am'ge,力中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉i威性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉(Am'血/ara)乙酰胺酶。表達(dá)載體可以包含聚腺苷酸化序列，它們與編碼本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的DNA序列可操作地連接。終止序列和聚腺苦酸化序列可以適當(dāng)?shù)卦醋耘c啟動(dòng)子相同的來(lái)源。載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這些序列的實(shí)例是以下質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702。載體還可以包含選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)足宿主細(xì)胞中缺陷的基因，例如來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的血/基因，或賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。此外，該載體可以包含曲霉屬選擇性標(biāo)記例如amdS、argB、niaD和sC,產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或所述選4奪可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化完成，例如WO91/17243中所述。分別用于連接編碼葡糖淀粉酶變體的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體、啟動(dòng)子、終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制必需的信息的合適載體中的方法，對(duì)本領(lǐng)域的^支術(shù)人員而言是熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarbor,1989)。宿主細(xì)胞在本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的重組生產(chǎn)中，將包含如上限定的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明的細(xì)胞有利地用作宿主細(xì)胞。方便地通過(guò)將DNA構(gòu)建體(以一個(gè)或多個(gè)拷貝)整合至宿主染色體，可以將細(xì)胞用編碼變體的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。通常認(rèn)為這種整合是有利的，因?yàn)樵揇NA序列更有可能穩(wěn)定地保持在所述細(xì)胞中。將所述DNA構(gòu)建體整合入宿主染色體可以根據(jù)常失見(jiàn)方法，例如通過(guò)同源或異源重組進(jìn)行?；蛘?，可以用如上所述與不同類型的宿主細(xì)胞相關(guān)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)或植物的細(xì)胞，但優(yōu)選是微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)月包。合適細(xì)菌的實(shí)例是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(5ac///2^/e"^s)、短芽孢桿菌(5acz7/w6,'ev&)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(Bacz7/Ma/fe/op/n7ws)、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌(iacz7/w51coag7^3m1)、環(huán)一夫芽孑包^干菌(^Sac〃/wsc^"cw/ara)、丈山^蘭芽孑包牙干菌(^Bc(c/〃w5/flM/w力、巨大芽孑包菌(Bac/〃wwegater/ww)、蘇云金芽孑包才干菌(^a"7/z^〃寄—z'e咖》，或淺青紫鏈霉菌(iS/r一謹(jǐn)少c^s1/z'v油ra)或鼠灰鏈霉菌(5V印to7Mycesmwn'"ws),或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。纟田菌轉(zhuǎn)化可以例如通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或使用感受態(tài)細(xì)胞以本身已知的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。酵母生物可以有利地選自酵母屬GSacc/2flrowyce力或裂殖酵母(&Z7/zo犯cc/2arom;;ce)屬的菌種，例如西良酒酵母。宿主細(xì)胞還可以是絲狀真菌，例如屬于曲霉屬菌種的菌抹，最優(yōu)選是米曲霉或黑曲霉，或鐮孢屬(Fw犯n'wm)的菌抹，例如下列菌種的菌抹尖鐮孢(Fwsor/wmc09Aypor/wm)、禾本牙+鐮孑包(i^us"0!rz'i/7"gn37w'we"ram)(在冗全卩介l史命名為玉蜀黍赤霉((^'6^//0^^)，曾命名為玉米球果菌OS^/weWazeae)，與粉紅赤霉((3%^,^//。rawww)和粉紅赤霉禾谷?；?G/Mwe//aro"wwf.sp.Cereafo)為同物異名)或硫色鐮孢(Fwar&mw/p/weww)(在完全階段命名為虱狀赤霉(0%/^%//"/"",")，與擬絲孑包鐮孑包CFwsan'wmfri'c/io〃化c/o/cfes)、4干孑包4夫鐮孑包(Ft^an:'wmZ""7,/(^o/d^y)、^妻骨木鐮孑包(尸W5an'w仍scwA"d"M7")、4分纟工鐮孑包(Fwan'w/wrasewm)禾口4分纟工鐮孑包禾本矛+哭種(/^j。r/"/wras"ew/"v"/:Wamz'"wwm)為同物異名),禾谷鐮孑包CFwsar/wmcewa/^)(與庫(kù)威鐮孑包(Fw犯n'wmcraMwe〃erae)為同物異名)或鑲片鐮孑包(Ft^ar/wwve"e"",MOT)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷型或蛋白酶陰性菌抹。例如這可以是蛋白酶缺陷菌抹米曲霉JaL125,其缺失名為"alp"的堿性蛋白酶基因。這種菌抹在WO97/35956(NovoNordisk)或EP專利號(hào)429,490中描述?？梢酝ㄟ^(guò)涉及原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化其后再生細(xì)胞壁的方法，以本身已知的方式來(lái)轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞。使用曲霉屬作為宿主微生物在EP238,023(NovoNordiskA/S)中描述，將其內(nèi)容通過(guò)參考并入本文。在植物中表達(dá)葡糖淀粉酶變體可以將編碼感興趣的多肽的DNA序列，例如編碼本發(fā)明的葡糖淀粉酶的DNA序列如下所述轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)基因植物中并且在其中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉或單子葉的，簡(jiǎn)稱雙子葉植物(dicot)或單子葉植物(monocot)。單子葉植物的實(shí)例是草，例如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass),禾本科(Poa))，牧草(foragegrass)例如羊茅屬(Fey似ca)、黑麥草屬溫帶草例如剪股穎屬(Jgro幼》，以及谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物實(shí)例為煙草，豆類例如羽扇豆，馬鈴薯，糖甜菜，豌豆，菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科(family5rowz'cfl"ae))例如花椰菜、油菜(oilseedrape)以及緊密相關(guān)的模型生物擬南芥(Jra6/^9/w:yZ/z"http://awa)。植物部分的實(shí)例是莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子和塊莖，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。在本上下文中，特定植物細(xì)胞區(qū)室，例如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線4立體(mitochondria)、'液泡(vacuole)、過(guò)氧物酉條體(peroxisome)和纟田月包質(zhì)，也都認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論其組織來(lái)源，都認(rèn)為是植物部分。類似地，植物部分，如分離以利于本發(fā)明利用的特定組織和細(xì)胞，也都認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的子代也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。表達(dá)感興趣的多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可按本領(lǐng)域的已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)言之，所述植物或植物細(xì)胞通過(guò)如下方法來(lái)構(gòu)建將編碼感興趣的多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組，并且將所得的經(jīng)修飾的植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。方便的是，表達(dá)構(gòu)建體是DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含編碼感興趣的多肽的基因，所述基因與該基因在所選植物或植物部分中表達(dá)所需的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列可搡作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可包含用于鑒定已整合了表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記和用于將構(gòu)建體^1入所述植物所必需的DNA序歹'J(后者取決于所用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子和終止子序列以及任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，例如基于期望表達(dá)酶的時(shí)間(when)、地點(diǎn)(where)和方式(how)來(lái)確定。例如，編碼本發(fā)明的酶的基因的表達(dá)可以是組成型或誘導(dǎo)型，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定細(xì)胞區(qū)室、組織或植物部分，例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列例如由Tagueetal，Plant,Phys.,86，506,1988描述。就組成型表達(dá)而言，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(Francketal.1980.Cell21:285-294,ChristensenAH,SharrockRAandQuail1992.Maizepolyubiquitingenes:structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation.PlantMo.Biol,18,675-689.;ZhangW，McElroyD.andWuR1991,Analysisofrice爿c/75'regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如，來(lái)自貯存庫(kù)組織(storagesinktissue)如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards&Comzzi,1990.Annu.Rev.Genet.24:275-303),或來(lái)自代謝庫(kù)組織(metabolicsinktissue)如分生組織的啟動(dòng)子(Itoetal.，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),種子特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白啟動(dòng)子(Wuetal.,PlantandCellPhysiologyVol.39，No.8pp.885-889(1998))，來(lái)自豆球蛋白B4的香豆(Wc/a/a6a)啟動(dòng)子禾口ConradU.etal，JournalofPlantPhysiologyVol.152,No.6pp.708-711(1998)所述的來(lái)自蠶豆的未知種子蛋白基因，來(lái)自種子油體(seedoilbody)蛋白的啟動(dòng)子(Chenetal.，Plantandcellphysiologyvol.39,No.9pp.935-941(1998)，來(lái)自歐洲油菜C6raw/ca"a;M》的貯存蛋白napA啟動(dòng)子，或本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異性啟動(dòng)子，例如在WO91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子也可以是葉特異性啟動(dòng)子，例如來(lái)自稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(Kyozukaetal"PlantPhysiologyVol.102，No.3pp.991-1000(1993),小球藻病毒腺噤呤曱基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Mitra，A.andHiggins,DW，PlantMolecularBiologyVol.26，No.lpp.85-93(1994),或來(lái)自稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagayaetal.,MolecularandGeneralGeneticsVol.248,No.6pp.668-674(1995),或傷口i秀導(dǎo)的啟動(dòng)子如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xuetal,PlantMolecularBiologyVol.22,No.4pp.573-588(1993)。類似地，啟動(dòng)子可通過(guò)非生物處理例如溫度、干旱或鹽度改變來(lái)誘導(dǎo)，或由激活啟動(dòng)子的外源施加的物質(zhì)，例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脫落酸和赤霉酸以及重金屬來(lái)誘導(dǎo)。啟動(dòng)子增強(qiáng)元件中可用于取得酶在植物的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)元件可以是位于啟動(dòng)子和編碼酶的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xuetal.(前文已引用)公開(kāi)了使用稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子來(lái)增強(qiáng)表達(dá)。選擇標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可由本領(lǐng)域可用的那些來(lái)選擇。用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將DNA構(gòu)建體整合至植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括農(nóng)桿菌(X^"Z^cfe/^w)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasseretal,Science,244,1293;Potrykus,Bio/Techn.8,535,1990;Shimamotoetal,Nature,338,274,1989)。目前，才艮癌土》裏4干菌(Jgro6a"e7JMmm7Me^zc/era)介導(dǎo)的基因?qū)?zhēng)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(參見(jiàn)綜述Hooykas&Schilperoort,1992，PlantMol.Biol.19:15-38)，并且也能用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管對(duì)這些植物通常使用其它轉(zhuǎn)化方法。目前，補(bǔ)充土壤桿菌(Jgra6a"en'ww)法用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選方法是胚愈傷組織或發(fā)育中的胚的粒子轟擊(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的(microscopic)金或鴒顆粒)(Christou,1992.PlantJ.2:275-281;Shimamoto,1994.CumOpin.Biotechnol.5:158-162;Vasiletal"1992.Bio/Technology10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可選方法基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如Omii-ullehS,etal"PlantMolecularbiologyVol.21,No.3pp.415-428(1993)所述。轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇并入表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并將其再生成全植物。通常將轉(zhuǎn)化方法設(shè)計(jì)成通過(guò)使用例如兩種獨(dú)立T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或使用特異性重組酶位點(diǎn)特異性切除選擇基因，從而在再生期間或在后代中選擇性地消除選擇基因。產(chǎn)生葡糖淀粉酶變體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明葡糖淀粉酶變體的方法，所述方法包括在有益于產(chǎn)生所述變體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，和從所述細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收該變體。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何方便的培養(yǎng)基，其適合于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和獲得本發(fā)明葡糖淀粉酶變體的表達(dá)。適合的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或可以根據(jù)公開(kāi)的配方制備(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目錄中所述)。可以通過(guò)熟知的方法方便地從培養(yǎng)基中回收由宿主細(xì)胞分泌的葡糖淀粉酶變體，所述熟知的方法包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基分離細(xì)胞；借助鹽例如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分；其后使用層析方法例如離子交換層析、親和層析等。葡糖淀粉酶變體的用途可以將本發(fā)明的變體用于淀粉轉(zhuǎn)化方法中，例如任何淀粉降解方法中，其中將淀粉降解成例如葡萄糖，例如用于甜味劑的生產(chǎn)中或在用于產(chǎn)生有機(jī)化合物的發(fā)酵方法中，所述有機(jī)化合物例如乙醇、檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸、檸檬酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酉吏5內(nèi)酉旨(gluconodeltalactone)、異抗壞血酸鈉(sodiumerythorbate)、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮；氨基酸，谷氨酸(一谷氨酸鈉(sodiummonoglutaminate))、青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，例如核黃素、B12、(3-胡蘿卜素或激素。常規(guī)淀粉轉(zhuǎn)化方法，例如液化和糖化方法在例如美國(guó)專利No.3，912，590和EP專利公開(kāi)Nos.252,730和63，909中描述，將它們作為參考并入本文。本發(fā)明的變體對(duì)于淀粉轉(zhuǎn)化，例如在甜味劑高果糖玉米糖漿(HFCS)的產(chǎn)生中尤其有用?？梢詫⒈景l(fā)明的變體用在用于產(chǎn)生酒精飲料、燃料或飲用乙醇的淀粉糖化(mashing)和/或發(fā)酵方法中。淀粉轉(zhuǎn)化本發(fā)明提供使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體用于從淀粉產(chǎn)生葡萄糖等的方法。通常所述方法包括以下步驟在a-淀粉酶的存在下將前體淀粉部分水解，其后在葡糖淀粉酶存在下，通過(guò)切割a-(l-4)和a-(l-6)糖苷鍵，進(jìn)一步從淀粉或相關(guān)寡糖和多糖分子的非還原端水解釋放D-葡萄糖。使用a-淀粉酶部分水解前體淀粉通過(guò)水解內(nèi)部的a-(l-4)-連接來(lái)提供淀粉分子的初始分解。在商業(yè)應(yīng)用中，使用a-淀粉酶的初始水解在大約10S。C的溫度進(jìn)行。加工的淀粉濃度非常高，通常是30%至40%固體。初始水解通常在這種高溫進(jìn)行5分鐘。其后可將部分水解的淀粉轉(zhuǎn)移至第二罐并且在85°至90。C的溫度溫育大約1小時(shí)以得到10至15的葡萄糖當(dāng)量(D.E.)。進(jìn)一步水解的步驟在葡糖淀粉酶存在下從淀粉或相關(guān)寡糖和多糖分子的非還原端釋放D-葡萄糖，該步驟通常在分開(kāi)的罐中在降低的溫度30°-60。C進(jìn)行。優(yōu)選將底物液體的溫度降低至55。C-60。C。溶液的pH從6-6.5降低至3-5.5。優(yōu)選地，溶液的pH是4-4.5。將葡糖淀粉酶添加至溶液，并且將反應(yīng)進(jìn)行24-72小時(shí)，優(yōu)選36-48小時(shí)。可以使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的糖化方法實(shí)例包括JP3-224493;JP1-191693;JP62-272987;和EP452,238中描述的方法?？梢詫⒈景l(fā)明的葡糖淀粉酶變體與僅水解具有至少四個(gè)葡糖殘基的分子中a-(l-6)-糖苦鍵的酶組合用于本發(fā)明的方法中。優(yōu)選地，可將本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體與支鏈淀粉酶或異淀粉酶組合使用。異淀粉酶和支鏈淀粉酶用于脫支(debranching)的用途、所述酶的分子性質(zhì)和所述酶與葡糖淀粉酶一起的潛在用途在G.M.A.vanBeynumetal"StarchConversionTechnology,MarcelDekker，NewYork,1985,101-142中描述。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉(zhuǎn)化方法中的用途，優(yōu)選在連續(xù)糖化步驟中的用途。本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體還可以固定化的形式使用。這是合適的并且通常用于生產(chǎn)麥芽糊精或葡萄糖糖漿或特殊糖漿(specialitysymp)，例如麥芽糖糖漿；并且還用于與果糖糖漿生產(chǎn)有關(guān)的寡糖殘液液流(m伍natestream)。當(dāng)期望的最終糖產(chǎn)品是例如高果糖糖漿時(shí)，可將葡萄糖糖漿轉(zhuǎn)化為果糖。在糖化方法之后，將pH升高至6-8的值，優(yōu)選pH7.5，并且通過(guò)離子交換去除鈣。其后使用例如固定化葡萄糖異構(gòu)酶(例如SweetzymeTMlT)將葡萄糖糖漿轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿。發(fā)酵方法可以將麥芽糖和/或葡萄糖發(fā)酵成乙醇產(chǎn)品或其它發(fā)酵產(chǎn)物，例如檸檬酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸5內(nèi)酯或異抗壞血酸鈉、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮；氨基酸，谷氨酸(一谷氨酸鈉(sodiummonoglutaminate))、青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，例如核黃素、B12、卩-胡蘿卜素或激素。通常基于整谷粒的發(fā)酵方法，例如乙醇方法，可分為4個(gè)主要步驟磨碎(milling)、液化、糖化、發(fā)酵。磨J爭(zhēng)谷粒以打開(kāi)結(jié)構(gòu)和允許進(jìn)一步加工。使用濕磨和干磨兩種方法。在干磨中，研磨整谷粒并且用在方法的剩余部分中。濕磨提供胚芽(germ)和粗粉(meal)(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))的良好分離，并且除了少數(shù)例外，將濕磨應(yīng)用于存在平行生產(chǎn)糖漿的場(chǎng)合。在液化方法中，通過(guò)水解成主要為DP大于4的麥芽糊精來(lái)溶解淀粉顆粒?？梢酝ㄟ^(guò)酸處理或通過(guò)a-淀粉酶的酶處理來(lái)進(jìn)行所述水解。酸水解在有限的基礎(chǔ)上使用。原料可以是磨碎的整谷?；騺?lái)自淀粉加工的側(cè)流(sidestream)。酶液化通常作為三步熱漿方法進(jìn)行。將漿料加熱至60-95°C，優(yōu)選80-85。C,并添加酶。其后將漿料在95-140°C,優(yōu)選105-125°C蒸汽熱壓蒸煮(jet-cool()以將淀粉凝膠化，冷卻至60-95。C,再添加更多的酶以獲得最終水解。所述液化方法在pH4.5-6.5，通常在pH5-6進(jìn)行。經(jīng)磨碎和液化的谷物也稱為醇Hmash)。為了產(chǎn)生酵母能夠代謝的低分子糖DPw，必須將來(lái)自液化的麥芽糊精進(jìn)一步水解。所述水解通常通過(guò)葡糖淀粉酶以酶方法進(jìn)行，或者可以^使用a-葡糖苷酶或酸性a-淀粉酶。完整糖化步驟可以持續(xù)多至72小時(shí)，然而，一般僅進(jìn)行通常為40-90分鐘的預(yù)糖化，然后是發(fā)酵期間的完全糖化(SSF)。糖化通常在30-65。C,通常大約60。C的溫度，并且在pH4.5進(jìn)行。將通常源自酵母屬菌種(6bcc/7"ram;/c"spp.)的酵母添加至所述醪并且將發(fā)酵進(jìn)行24-96小時(shí)，例如通常為35-60小時(shí)。溫度是26-34。C，通常是大約32°C，并且pH是pH3-6，優(yōu)選大約pH4-5。注意到最廣泛使用的方法是同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)方法，其中不存在用于糖化的保持階段(holdingstage)，意思是將酵母和酶一起添加。當(dāng)進(jìn)行SSF時(shí)，通常在即將發(fā)酵之前引入溫度在50°C以上的預(yù)糖化步驟。也可以不使淀粉凝膠化而以所謂的生淀粉水解方法來(lái)進(jìn)行液化和糖化，例如在WO2004/080923、WO2004/081193或WO2003/66826中所述。生淀4分水解方法優(yōu)選作為SSF方法進(jìn)行。在發(fā)酵之后，蒸餾醪以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，即，可飲用的精制酒精(potableneutralspirits);或工業(yè)乙醇。發(fā)酵的剩余物(leftover)是酒糟(spendgrain),酒糟通常用于液體形式或干燥的動(dòng)物飼料。關(guān)于如何進(jìn)行液化、糖化、發(fā)酵、蒸餾和回收乙醇的更多細(xì)節(jié)是技術(shù)人員熟知的。方法葡糖淀粉酶活性(AGU)可以將葡糖淀粉酶活性以AGU單位測(cè)量。將lAGU定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解l微摩爾麥芽糖的酶量，所述標(biāo)準(zhǔn)條件是37。C,pH4.3,底物麥芽糖23.2mM,緩沖液乙酸鹽0.1M，反應(yīng)時(shí)間5分鐘。可使用自動(dòng)分析系統(tǒng)。將變旋酶添加至葡萄糖脫氫酶試劑，從而將存在的任何a-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成(3-D-葡萄糖。在上述反應(yīng)中葡萄糖脫氫酶與(3-D-葡萄糖特異性地反應(yīng)，形成NADH,使用光度計(jì)在340nm測(cè)定NADH作為原始葡萄糖濃度的量度。AMG溫育底物麥芽糖23.2mM緩沖液乙酸鹽0.1MpH:4.30±0.05溫育溫度37。C±1反應(yīng)時(shí)間5分鐘酶工作范圍0.5-4.0AGU/mL顯色反應(yīng)GlucDH:430U/L變旋酶9U/LNAD:0.21mM緩沖液磷酸鹽0.12M;0.15MNaClpH:7.60土0.05溫育溫度37。C士l反應(yīng)時(shí)間5分鐘波長(zhǎng)340nm25更詳細(xì)描述這種分析方法的文件夾(EB-SM-0131.02/01、可以根據(jù)要求乂人NovozymesA/S,Denmark獲得，將該文件夾作為參考并入本文。實(shí)施例實(shí)施例1用30%DS的DE11液化淀粉，在pH4.3和60°C在4唐化試驗(yàn)中測(cè)試來(lái)自rfl/aramycMemenwwY的親本葡糖淀粉酶(SEQIDNO:2)和選擇的包含特定耳又代的變體。所述DE11液化淀粉從在pH5.2具有5ppmCa4"+的33%DSCerestar玉米淀粉制備，并且用TermamylSupra(120KNU(T)/g)液化。將所述試驗(yàn)一式兩份地進(jìn)行。在不含或含有下述額外的酶的條件下進(jìn)行所述測(cè)試；0.012AFAU/gDS來(lái)自黑曲霉的酸性oc-淀粉酶和0.2NPUN/gDS來(lái)自Bacz7/wa/77y/oiie7""a冊(cè)ycara的支《連淀4分酉爭(zhēng)。表1.使用0.04mg葡糖淀粉酶/gDS的糖化。LSD對(duì)于DPI為+-0.2,而對(duì)于DP2為+-0.1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>權(quán)利要求1.親本葡糖淀粉酶的變體，所述變體葡糖淀粉酶與親本葡糖淀粉酶相比縮合產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。2.權(quán)利要求l的變體，其中所述縮合產(chǎn)物是異麥芽糖。3.親本葡糖淀粉酶的變體，其在以下區(qū)域之一中包含變化區(qū)域248-255,例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一個(gè)或多個(gè)中，區(qū)域309-318，例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一個(gè)或多個(gè)中，和/或區(qū)域409-415,例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一個(gè)或多個(gè)中，其中(a)所述變化獨(dú)立地是(i)在占據(jù)所述位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)將占據(jù)所述位置的氨基酸缺失，或Ciii)用不同的氨基酸取代占據(jù)所述位置的氨基酸，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性并且(c)各區(qū)域或位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基S1序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S^f列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的區(qū)域或位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S銀列顯示至少50%同源性。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的變體，所述變體在以下位置的一個(gè)或多個(gè)包含變化252、312、314、315、412,其中各位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酸序列顯示至少50%同源性。5.權(quán)利要求1或4中任一項(xiàng)的變體，所述變體包含以下變化中的一種或多種在位置252取代為A、F、G或V;在位置312取代為S,在位置314取代為E、F、N、R、T、W或Y;在位置315取代為A、D、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y，在位置412取代為D,或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I,其中所述各位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S^f列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酸序列顯示至少50%同源性。6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的變體，所述變體包含以下取代中的一個(gè)或多個(gè)V312S、Q314E、Q314F、Q314N、Q314R、Q314T、Q314W、Q314Y、G315A、G315D、G315F、G315H、G315K、G315L、G315N、G315Q、G315R、G315S、G315T、G315Y、L252A、L252F、L252G、L252V、L412D或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I(Q314QI)，其中所述各位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基S臾序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S踏列顯示至少50%同源性。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的變體，所述變體包含I^又代G315F，其中所述位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基a銀列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酸序列顯示至少50%同源性。8.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的變體，所述變體包含取代G315Y，其中所述位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S臾序列顯示至少50%同源性。9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的變體，所述變體包含取代L252A，其中所述位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基S殳序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S^f列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S^/f列顯示至少50%同源性。10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個(gè)或多個(gè)314F+315N、314W+315N、314Y+315N、314L+315A、314N+315R、314R+315D、315R+463T、315R+556E、315L+529N,其中所述各位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S拼列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S吏序列顯示至少50%同源性。11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個(gè)或多個(gè)Q314F+G315N、Q314W+G315N、Q314Y+G315N、Q314L+G315A、Q314N+G315R、Q314R+G315D、G315R+A463T、G315R+K556E、G315L+D529N，其中所述各位置對(duì)應(yīng)于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或?qū)?yīng)于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基H拼列顯示至少50%同源性。12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的變體，其中所述親本葡糖淀粉酶具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有至少60%,優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少大約70%,還更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90°/。，最優(yōu)選至少95%,并且最優(yōu)選至少98%同一性程度。13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的變體，其中所述親本葡糖淀粉酶由核S銀列編碼，所述核S臾序列在低嚴(yán)緊條件下，在中嚴(yán)緊條件下，或在高嚴(yán)緊務(wù)f牛下與SEQIDNO:1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的變體，其中所述親本葡糖淀粉酶獲得自踝節(jié)菌屬,尤其是K7/ara"，es綴ersom'Z。15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶相比具有減少的縮合。16.DNA構(gòu)建體，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體的DNA序列。17.重組表達(dá)載體，其攜帶根據(jù)權(quán)利要求16的DNA構(gòu)建體。18.用根據(jù)權(quán)利要求16的DNA構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求17的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。19.根據(jù)權(quán)利要求18的細(xì)胞，所述細(xì)胞是微生物，具體而言是細(xì)菌或真菌。20.根據(jù)權(quán)利要求19的細(xì)胞，所述細(xì)胞是來(lái)自踝節(jié)菌屬菌種的菌抹。21.根據(jù)權(quán)利要求20的細(xì)月包，所述細(xì)胞是來(lái)自ra/aram_ycase/we730""的菌抹。22.用于將淀粉轉(zhuǎn)化或部分水解成為含有葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體存在下將淀粉水解物糖化。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述葡糖淀粉酶變體的劑量以0.05至0.5AGU每克干固體的范圍存在。24.權(quán)利要求22或23中任一項(xiàng)的方法，其包括糖化淀粉水解物，優(yōu)選按重量計(jì)具有至少30%干固體的淀粉水解物。25.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉(zhuǎn)化方法中的用途，優(yōu)選在連續(xù)淀;盼轉(zhuǎn)化方法中的用途。26.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在用于產(chǎn)生寡糖、麥芽糊精或葡萄糖糖漿的方法中的用途。27.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在用于產(chǎn)生高果糖玉米糖漿的方法中的用途。28.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在用于產(chǎn)生酒精飲料、燃料或飲用乙醇的方法中的用途。29.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在用于產(chǎn)生有機(jī)化合物的發(fā)酵方法中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及具有改進(jìn)性質(zhì)的葡糖淀粉酶變體和使用所述葡糖淀粉酶變體的方法。文檔編號(hào)C12N9/24GK101310016SQ200680042983公開(kāi)日2008年11月19日申請(qǐng)日期2006年11月17日優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日發(fā)明者埃斯本·P·弗里斯,斯蒂芬·丹尼爾森,杰普·W·塔姆斯申請(qǐng)人:諾維信公司