專利名稱：葡糖淀粉酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親本AMG的特性改變的新葡糖淀粉酶變體(突變體)，所述特性改變具體是改善了熱穩(wěn)定性和/或提高了比活，所述變體適用于如淀粉轉(zhuǎn)化，具體適于從淀粉生產(chǎn)葡萄糖，和醇類生產(chǎn)，甜味劑生產(chǎn)。更特定地，本發(fā)明涉及葡糖淀粉酶變體和此變體酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡糖淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，EC3.2.1.3)可以催化從淀粉或相關(guān)的寡糖和多糖分子的非還原末端釋放D-葡萄糖。葡糖淀粉酶可從幾種絲狀真菌或酵母產(chǎn)生，其中曲霉屬在商業(yè)上是最重要的。
在商業(yè)上，葡糖淀粉酶用于將被α-淀粉酶部分水解的玉米淀粉轉(zhuǎn)化為為葡萄糖。葡萄糖進(jìn)一步被葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為含幾乎等量的葡萄糖和果糖的混合物。此混合物或果糖含量更高的混合物是通常使用于全世界商業(yè)用途的高果糖玉米漿。此糖漿是世界上由酶方法生產(chǎn)的最大產(chǎn)量的產(chǎn)品。在由淀粉轉(zhuǎn)化為果糖中有關(guān)的三種酶是生產(chǎn)的最重要的工業(yè)用酶。
考慮到在高果糖玉米漿生產(chǎn)中葡糖淀粉酶的商業(yè)用途，其中一個主要問題是葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性相對較低。葡糖淀粉酶不象α-淀粉酶或葡萄糖異構(gòu)酶一樣熱穩(wěn)定，它最活躍和穩(wěn)定的pH值比α-淀粉酶或葡萄糖異構(gòu)酶要低。相應(yīng)地，它必須用于較低溫度和pH值的單獨(dú)的容器中。
黑曲霉的葡糖淀粉酶具有催化活性結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-440)和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(氨基酸509-616)，此二者被一段較長且高度O-糖基化的接頭所分隔(Svensson等(1983)，Carlsberg Res.Commun.48，529-544，1983和(1986)，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem)，154，497-502)。泡盛曲霉X100的葡糖淀粉酶的催化活性結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-471)具有(α/α)6-折疊，其中六個保守的α→α環(huán)片段與內(nèi)桶和外桶相連(Aleshin等(1992)，生物學(xué)化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)167，19291-19298)。葡糖淀粉酶與1-脫氧野尻霉素(Harris等(1993)，生物化學(xué)，32，1618-1626)和假四糖抑制因子阿卡波糖及D-葡萄糖-二氫阿卡波糖(Aleshin等(1996)，生物化學(xué)35，8319-8328)的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步與分別作為全酸和全堿的谷氨酸179和400相符合。已利用蛋白工程對這些殘基在催化中的關(guān)鍵作用進(jìn)行了研究(Sierks等(1990)，蛋白質(zhì)工程(Protein Engng.)3，193-198；Frandsen等(1994)，生物化學(xué)，33，13808-13816)。在葡糖淀粉酶復(fù)合物結(jié)構(gòu)中強(qiáng)調(diào)了在四個糖基殘基結(jié)合亞點(diǎn)，-1，+1，+2，和+3處葡糖淀粉酶-糖的相互作用，利用定點(diǎn)誘變突變體結(jié)合動力學(xué)分析廣泛地調(diào)查對結(jié)合和催化作用重要的殘基(Sierks等(1989)，蛋白質(zhì)工程，2，621-625；Sierks等(1990)，蛋白質(zhì)工程，3，193-198；Berland等(1995)，生物化學(xué)，34，10153-10161；Frandsen等(1995)，生物化學(xué)，34，10162-10169。
黑曲霉葡糖淀粉酶中可以增強(qiáng)熱穩(wěn)定性的幾種取代描述如下i)取代α-螺旋甘氨酸G137A和G139A(Chen等(1996)，蛋白質(zhì)工程，9，499-505)；ii)去除脆弱的Asp-X肽鍵，D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，蛋白質(zhì)工程，8，575-582)；阻止在N182的脫氨基作用(Chen等(1994)，生物化學(xué)雜志，301，275-281)；iv)通過工程化方法添加二硫鍵，A246C(Fierobe等(1996)，生物化學(xué)，35，8698-8704；和v)在A435和S436中引入Pro殘基(Li等(1997)，蛋白質(zhì)工程，10，1199-1204。此外，Clark Ford于1997年10月17日發(fā)表的論文，酶工程14，北京/中國10月12-17日，1997，文摘號碼文摘第0-61頁。此文摘提出在泡盛曲霉葡糖淀粉酶位置G137A，N20C/A27C，和S30P(未公開))進(jìn)行突變以改進(jìn)其熱穩(wěn)定性。
有關(guān)葡糖淀粉酶的其它信息可在國際互聯(lián)網(wǎng)主頁(http//www.public.iastate.edu/～pedro/glase/glase.html)上由Pedro M.Coutinho負(fù)責(zé)的“葡糖淀粉酶WWW網(wǎng)頁”(最后一次更新97/10/08)披露了有關(guān)葡糖淀粉酶的信息，其中包括得自曲霉屬菌株的葡糖淀粉酶。列出了在黑曲霉葡糖淀粉酶中的化學(xué)修飾和定點(diǎn)修飾。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供適用于，例如淀粉轉(zhuǎn)化過程中的糖化步驟的葡糖淀粉酶變體。
術(shù)語“熱穩(wěn)定的葡糖淀粉酶變體”在本發(fā)明中指與相應(yīng)的親本葡糖淀粉酶相比有較高T1/2(半衰期)的葡糖淀粉酶變體。在下面的“材料和方法”部分描述了T1/2的測定(方法I和方法II)。
術(shù)語“比活提高的葡糖淀粉酶變體”在本發(fā)明中指提高了對所述糖分子中α-1，4鍵的比活。比活測定為kcat或AGU/mg(按下文“材料和方法”部分所述測定)。提高比活意味著kcat或AGU/mg值分別相對于相應(yīng)地親本葡糖淀粉酶有了提高。
本發(fā)明人提供了親本葡糖淀粉酶的幾種改進(jìn)了熱穩(wěn)定性和/或提高了比活的變體。熱穩(wěn)定性的改進(jìn)可通過突變，例如在親本葡糖淀粉酶所選位置上的取代和/或缺失，插入來實(shí)現(xiàn)。下面有對此的詳述。
命名法在本說明書和權(quán)利要求書中，使用傳統(tǒng)的一字母和三字母代碼表示氨基酸殘基。
為便于引用，本發(fā)明的AMG變體采用下述的命名法原氨基酸位置用于取代的氨基酸根據(jù)該命名法，用天冬酰胺取代第30位的丙氨酸示為Ala30Asn或A30N，在相同位置處缺失丙氨酸示為Ala30*或A30*，而插入另一個氨基酸殘基，如賴氨酸示為Ala30AlaLys或A30AK。缺失一段連續(xù)的氨基酸殘基，如氨基酸殘基30-33示為(30-33)*或Δ(A30-N33)。
當(dāng)特定的AMG相對于其它AMG而言含有“缺失”，并在該位置插入某個氨基酸，例如在第36位插入天冬氨酸時，示為*36Asp或*36D。
多個突變由加號隔開，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S表示分別將第30和34位的丙氨酸和谷氨酸用天冬酰胺和絲氨酸取代。多個突變也可以如下隔開，其意義與加號相同Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S。
當(dāng)在給定的位置插入一個或多個其它氨基酸殘基時，示為A30N，E或A30N/E或A30N或A30E。
另外，當(dāng)本文鑒定出適于修飾的位置，而沒有暗示任何具體的修飾時，應(yīng)理解為可用任一氨基酸殘基取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當(dāng)提到修飾第30位的丙氨酸，但未具體說明時，應(yīng)理解為丙氨酸可缺失，或用任一其它氨基酸，即下列任一氨基酸所取代R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T， W，Y，V。
附圖簡述


圖1表示了含有黑曲霉G1葡糖淀粉酶基因的質(zhì)粒pCAMG91。
發(fā)明詳述本發(fā)明旨在改進(jìn)特定葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性和/或提高其比活，所述酶得自真菌生物，特別是黑曲霉屬的菌株這些酶本身已根據(jù)它們在諸如淀粉轉(zhuǎn)化或乙醇發(fā)酵中的適當(dāng)性質(zhì)進(jìn)行了篩選。
本發(fā)明人從中驚奇地發(fā)現(xiàn)通過修飾親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列上的一或多個氨基酸殘基確實(shí)有可能改進(jìn)親本葡糖淀粉酶熱穩(wěn)定性和/或提高比活。本發(fā)明就是基于此發(fā)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的第一個方面涉及親本葡糖淀粉酶在下述位置包含一或多個突變的變體。
親本葡糖淀粉酶本發(fā)明考慮的親本葡糖淀粉酶包括野生型葡糖淀粉酶，真菌葡糖淀粉酶，特別是得自曲霉屬菌株，如黑曲霉或泡盛曲霉的真菌葡糖淀粉酶及其變體或突變體，同源葡糖淀粉酶，和其它與SEQ ID NO2結(jié)構(gòu)和/或功能相似的葡糖淀粉酶。特別予以考慮的是公開于Boel等(1984)，“從兩個不同但密切相關(guān)的mRNAs合成的黑曲霉葡糖淀粉酶G1和G2”EMBO J.3(5)，p.1097-1102中的黑曲霉葡糖淀粉酶G1和G2。G2葡糖淀粉酶公開為SEQ IDNO2。在另一實(shí)施方案中，AMG骨架得自踝節(jié)菌屬，特別是公開于WO99/28448的T.emersonii(參見WO 99/28448的SEQ ID NO7)。
市售親本葡糖淀粉酶考慮的市售親本葡糖淀粉酶包括Novo Nordisk的AMG，以及Genencor，Inc.USA和Gist-Brocades，Delft，The Netherlands的葡糖淀粉酶。
本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體在第一個方面，本發(fā)明涉及親本葡糖淀粉酶的變體，其包括在下列一或多個位置的改變59，66，72，119，189，223，227，313，340，342，352，379，386，393，395，402，408，416，425，427，444，486，490，494，其中(a)所述每一改變是(i)在占據(jù)此位置的氨基酸下游插入氨基酸，(ii)占據(jù)此位置的氨基酸的缺失，或(iii)占據(jù)此位置的氨基酸用另一氨基酸取代，(b)所述變體具有親本葡糖淀粉酶活性且(c)每一位置對應(yīng)于具有SEQID NO2之氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶氨基酸序列的位置。
此外，本發(fā)明涉及這樣一種葡糖淀粉酶變體，其親本葡糖淀粉酶具有與SEQ ID NO2之氨基酸序列至少約65％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％，還最優(yōu)選至少約97％同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及親本葡糖淀粉酶的下述變體，其包含一或多個下列改變V59A，L66V/R，T72I，Sll9P，I189T，Y223F，F(xiàn)227Y，N313G，S340G，E342A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V，優(yōu)選E342T，K352R，S356G，T379A，S386K，N，R，P，A393R，S395R，Y402F，E408R，T416A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，E，W，Y，V，優(yōu)選T416H，A425T，N427S/M，S444G，S486G，T490A，T494P/A，其中(a)所述變體具有葡糖淀粉酶活性且(b)每一位置對應(yīng)于具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中位置。
特定的突變組合包括L66R+Y402F+N427S+S486G+A1V；N427M+S44G+V470M+T2K+S30P；T416H+Y402F+312Q+S119P；A425T+E408R+E386K+A495T；T379A+T2E+S386K+A393R；S386N+E408R；L66V+T2R+S394P+Y402F+RL；S386R+T2R+A393R；I189T+Y223F+F227Y+S119P+Y402F；S386P+S340G+D357S+T360V； V59A+S119P； V59A+N313G； V59A+A393R；V59A+Y402F； V59A+E408R； V59A+S119P+N313G； V59A+N313G+A393R；V59A+A393R+Y402F； V59A+Y402F+E408R；V59A+S119P+N313G+A393R；V59A+N313G+A393R+Y402F； V59A+A393R+Y402F+E408R；V59A+S119P+N313G+A393R+Y402F； V59A+N313G+A393R+Y402F+E408R；V59A+S119P+L66R； V59A+S119P+S340G； V59A+S119P+S395R；V59A+S119P+L66R+S340G；V59A+S119P+S340G+S395R；V59A+S119P+S395R+L66R； V59A+S119P+S395R+L66R+S340G；V59A+N313G+L66R； V59A+N313G+S340G；V59A+N313G+S395R；V59A+N313G+L66R+S340G；V59A+N313G+S340G+S395R；V59A+N313G+S395R+L66R；V59A+N313G+S395R+L66R+S340G；V59A+A393R+L66R； V59A+A393R+S340G； V59A+A393R+S395R；V59A+A393R+L66R+S340G； V59A+A393R+S340G+S395R；V59A+A393R+S395R+L66R+S340G； V59A+Y402F+L66R；V59A+Y402F+S340G； V59A+Y402F+S395R； V59A+Y402F+L66R+S395R；V59A+Y402F+L66R+S340G；V59A+Y402F+L66R+S395R+S340G；V59A+E408R+L66R；V59A+E408R+S395R；V59A+E408R+S340G；V59A+E408R+S395R+S340G；V59A+E408R+L66R+S340G；V59A+E408R+L66R+S395R；V59A+E408R+L66R+S395R+S340G；V59A+S119P+N313G+L66R；V59A+S119P+N313G+L66R+S340G；V59A+S119P+N313G+L66R+S395R；V59A+S119P+N313G+L66R+S395R+S340G；V59A+N313G+A393R+L66R；V59A+N313G+A393R+L66R+S395R； V59A+N313G+A393R+L66R+S340G；V59A+N313G+A393R+ L66R+S340G+S395R； V59A+A393R+Y402F；V59A+Y402F+E408R；V59A+S119P+N313G+A393R；V59A+N313G+A393R+Y402F；V59A+A393R+Y402F+E408R；V59A+S119P+N313G+A393R+Y402F；V59A+N313G+A393R+Y402F+E408R；S119P+N313G；N313G+A393R；A393R+Y402F；Y402F+E408R；S119P+N313G+A393R；N313G+A393R+Y402F；A393R+Y402F+E408R；V59A+S119P+N313G+A393R+Y402F；N313G+A393R+Y402F+E408R；S119P+L66R；V59A+S119P+S340G；S119P+S395R；S119P+L66R+S340G；S119P+S340G+S395R；S119P+S395R+L66R；S119P+S395R+L66R+S340G；N313G+L66R；N313G+S340G；N313G+S395R；N313G+L66R+S340G；N313G+S340G+S395R；N313G+S395R+L66R；N313G+S395R+L66R+S340G；A393R+L66R；A393R+S340G；A393R+S395R；A393R+L66R+S340G；A393R+S340G+S395R；A393R+S395R+L66R+S340G；Y402F+L66R；Y402F+S340G；Y402F+S395R；Y402F+L66R+S395R；Y402F+L66R+S340G；Y402F+L66R+S395R+S340G；E408R+L66R；E408R+S395R；E408R+S340G；E408R+S395R+S340G；E408R+L66R+S340G；E408R+L66R+S395R；E408R+L66R+S395R+S340G；S119P+N313G+L66R；S119P+N313G+L66R+S340G；S119P+N313G+L66R+S395R；S119P+N313G+L66R+S395R+S340G；N313G+A393R+L66R；N313G+A393R+L66R+S395R；N313G+A393R+ L66R+S340G；N313G+A393R+L66R+S340G+S395R；A393R+Y402F；Y402F+E408R；V59A+S119P+N313G+A393R；N313G+A393R+Y402F；A393R+Y402F+E408R；S119P+N313G+A393R+Y402F；N313G+A393R+Y402F+E408R.V59A+S119P+S340G；S119P+S395R；S119P+S340G；S119P+S340G+S395R；S119P+S395R；S119P+S395R+S340G；N313G+S340G；N313P+S395R；313G+S340G； N313G+S395R； N313G+S395R+S340G； A393R+S340G；A393R+S395R+S340G；Y402F+S395R；Y402F+S340G；Y402F+S395R+S340G；E408R+S340G；E408R+S395R；E408R+S395R+S340G；S119P+N313G；S119P+N313G+S340G；S119P+N313G+S395R；S119P+N313G+S395R+S340G；N313G+A393R；N313G+A393R+S395R；N313G+A393R+S340G；N313G+A393R+S340G+S395R； .N313G+A393R；V59A+N313G+A393R+Y402F；V59A+S340G； L66R+S340G；S340G+S395R；S395R+L66R；S395R+L66R+S340G；N313G+L66R；N313G+L66R+S340G；N313G+L66R+S395R；N313G+L66R+S395R+S340G；V59A+N313G+A393R；N313G+A393R+Y402F；S119P+A393R；A393R+Y402F；V59A+S119P+A393R+Y402F；A393R+Y402F+E408R；S119P+S395R+L66R+S340G；L66R+S340G；S340G+S395R；S395R+L66R；S395R+L66R+S340G；S119P+L66R；S119P+L66R+S340G；S119P+L66R+S395R；S119P+L66R+S395R+S340G；A393R+ L66R；A393R+L66R+S395R；A393R+ L66R+S340G；A393R+L66R+S340G+S395R；V59A+S119P+A393R；A393R+Y402F；S119P+A393R+Y402F；A393R+Y402F+E408R；S119P+N313G；N313G+Y402F；Y402F+E408R；V59A+S119P+N313G+Y402F；N313G+Y402F+E408R；L66R+S340G；S340G+S395R；S395R+L66R+S340G；N313G+L66R；N313G+L66R+S395R；N313G+L66R+S340G；N313G+L66R+S340G+S395R；V59A+S119P+N313G；N313G+Y402F；Y402F+E408R；S119P+N313G+Y402F；N313G+Y402F+E408R.S119P+S340G；S119P+L66R；S119P+L66R+S340G；N313G+S340G；N313G+L66R；N313G+L66R+S340G；A393R+S340G；A393R+L66R+S340G；Y402F+L66R；Y402F+L66R+S340G；Y402F+L66R+S340G；E408R+S340G；E408R+L66R；E408R+L66R+S340G；S119P+N313G+L66R；S119P+N313G+L66R+S340G；N313G+A393R+L66R；N313G+A393R+ L66R+S340G；N313G+A393R；A393R+E408R；V59A+S119P+N313G+A393R；N313G+A393R+E408R；L66R+S395R；L66R+S340G；L66R+S395R+S340G；N313G+A393R；A393R+E408R；S119P+N313G+A393R；N313G+A393R+E408R.A393R+Y402F；N313G+A393R+Y402F；S395R+S340G； L66R+S340G；L66R+S395R；L66R+S395R+S340G； A393R+Y402F；N313G+A393R+Y402F.S119P+L66R；V59A+S119P；S119P+S395R；S119P+L66R；S119P+S395R；
S119P+S395R+L66R；N313G+L66R；N313G+S395R；N313G+S395R+L66R；A393R+L66R；A393R+S395R；A393R+S395R+L66R；Y402F+L66R；Y402F+L66R+S395R；E408R+S395R；E408R+L66R；E408R+L66R+S395R；S119P+N313G+L66R；S119P+N313G+L66R+S395R；N313G+A393R+L66R；N313G+A393R+L66R+S39SR；N9A+S56A+V59A+S119P+A246T+N313G+E342T+A393R+S394R+Y402F+E408R；S56A+V59A+S119P+A246T+N313G+E342T+A393R+S394R+Y402F+E408R；V59A+S119P+A246T+N313G+E342T+A393R+S394R+Y402F+E408R；S119P+A246T+N313G+E342T+A393R+S394R+Y402F+E408R；A246T+N313G+E342T+A393R+S394R+Y402F+E408R；N313G+E342T+A393R+S394R+Y402F+E408R；E342T+A393R+S394R+Y402F+E408R；A393R+S394R+Y402F+E408R；S394R+Y402F+E408R；Y402F+E408R；V59A+L66R+T72I+S119P+N313G+S340G+S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M；L66R+T72I+S119P+N313G+S340G+S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M；T72I+S119P+N313G+S340G+S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M；S119P+N313G+S340G+S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M；N313G+S340G+S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M；S340G+S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M；S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M；A393R+Y402F+E408R+N427M；Y402F+E408R+N427M；E408R+N427M；I189T+Y223F+F227Y+S119P+Y402F；Y223F+F227Y+S119P+Y402F；F227Y+S119P+Y402F；S119P+Y402F；I189T+Y223F+F227Y+Y402F；I189T+Y223F+F227Y；I189T+Y223F；I189T+F227Y；I189T+F227Y+S119P；I189T+F227Y+Y402F；Y223F+F227Y+Y402F；Y223F+F227Y+S119P.
本發(fā)明還涉及這樣一種葡糖淀粉酶變體，其親本酶由在中度，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列編碼。
改進(jìn)的熱穩(wěn)定性在另一方面，本發(fā)明涉及親本葡糖淀粉酶改進(jìn)了熱穩(wěn)定性的變體，具體是在40-80℃，優(yōu)選63-75℃，具體在pH4-5，使用麥芽糖糊精為底物時改進(jìn)了熱穩(wěn)定性，所述變體在表示為SEQ ID NO2的氨基酸序列的下列位置含有一或多個突變59，66，72，119，189，223，227，313，340，342，352，379，386，393，395，402，408，416，425，427，444，486，490，494，或是與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少60％同源性的葡糖淀粉酶中相應(yīng)位置。
可改進(jìn)熱穩(wěn)定性的特定取代包括V59A，L66V/R，T72I，S119P，I189T，Y223F，F(xiàn)227Y，N313G，S340G，E342A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V，優(yōu)選E342T，K352R，S356G，T379A，S386K，N，R，P，A393R，S395R，Y402F，E408R，T416A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，E，W，Y，V，優(yōu)選T416H，A425T，N427S/M，S444G，S486G，T490A，T494P/A。
具體的突變組合包括E408R+A425T+S465P+T494A，A425T+E408R+S386K+A495T，T379A+T2E+S386K+A393R，S386N+E408R，L66V+T2R+S394P+Y402F+RL N-末端延伸)S386R+T2R+A393R.
N427S+S486G+A1V+L66R+Y402F，N427M+S44G+V470M+T2K+S30P，T490A+V59A++A393R+PLASD(N-末端延伸)在“本發(fā)明葡糖淀粉酶變體”部分列出的所有變體都被認(rèn)為具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。實(shí)施例2和4中顯示了本發(fā)明所選變體的這方面。
提高的比活在另一方面，本發(fā)明涉及親本葡糖淀粉酶比活已提高的變體，所述變體在表示為SEQ ID NO2的氨基酸序列的下列位置含有一或多個突變59，66，72，119，189，223，227，313，340，342，352，379，386，393，395，402，408，416，425，427，444，486，490，494，優(yōu)選189，223，227或與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少60％同源性的葡糖淀粉酶中相應(yīng)位置。
可提高比活的具體突變包括V59A，L66V/R，T72I，S119P，I189T，Y223F，F(xiàn)227Y，N313G，S340G，K352R，S356G，T379A，S386K，N，R，P，A393R，S395R，Y402F，E408R，T416A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，E，W，Y，V優(yōu)選T416H，A425T，N427S/M，S444G，S486G，T490A，T494P/A，優(yōu)選I189T，Y223F，F(xiàn)227Y。
具體的突變組合包括
I189T+Y223F+F227Y+S119F+Y402P；Y223F+F227Y+S119P+Y402F；F227Y+S119P+Y402F；S119P+Y402F；I189T+Y223F+F227Y+Y402F；I189T+Y223F+F227Y；I189T+Y223F；I189T+F227Y；I189T+F227Y+S119P；I189T+F227Y+Y402F；Y223F+F227Y+Y402F；Y223F+F227Y+S119P.
在“本發(fā)明葡糖淀粉酶變體”部分列出的所有變體都被認(rèn)為具有已提高的比活。實(shí)施例3中顯示了本發(fā)明所選變體的這方面。
同源性(同一性)針對上述親本葡糖淀粉酶的同源性測定為兩個蛋白序列之間可指示其中第一個序列衍生自第二個序列的同一性程度。此同源性適于由本領(lǐng)域所熟知的計算機(jī)程序測定，如GCG軟件包提供的GAP(Wisconsin軟件包程序手冊，第8版，1994.8，遺傳學(xué)計算機(jī)組，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美國53711)(Needleman，S.B.Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學(xué)雜志(Joumal of Molecular Biology，48，p.443-453))。采用下列設(shè)置以GAP進(jìn)行多肽序列的比對GAP產(chǎn)生得分為3.0，GAP延伸得分為0.1，本發(fā)明中DNA類似序列編碼的多肽的成熟部分顯示出與SEQ ID NO2的氨基酸序列的成熟部分優(yōu)選至少80％，至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％，最優(yōu)選至少99％的同一性。
在一個實(shí)施方案中，親本葡糖淀粉酶是黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102(SEQ ID NO13)。親本葡糖淀粉酶可以是截短的葡糖淀粉酶，例如，黑曲霉G2葡糖淀粉酶(SEQ ID NO2)。
優(yōu)選地，親本葡糖淀粉包含SEQ ID NO2的氨基酸序列；或其等位基因變體；或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。
SEQ ID NO2的片段是在此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端具有一或多個氨基酸缺失的多肽。例如，AMG G2(SEQ ID NO2)是黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等(1984)EMBO J.3(5)，p.1097-1102)的具有葡糖淀粉酶活性的片段。等位基因變體表示占據(jù)同一染色體位點(diǎn)的一個基因的兩或多個替代形式中的任一種。等位基因變異通過突變自然產(chǎn)生，可能會產(chǎn)生種群內(nèi)的多態(tài)現(xiàn)象?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽沒有改變)或可以編碼氨基酸序列已改變的多肽。多肽的等位基因變體是被基因的等位基因變體編碼的多肽。
通過一或多個氨基酸殘基的插入或缺失和/或一或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基取代，同源的親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列可能與SEQ IDNO2氨基酸序列不同。優(yōu)選地，氨基酸改變?yōu)檩^小的性質(zhì)改變，即并不顯著影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基酸的取代；小的缺失，通常為1到約30個氨基酸的缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基酸末端蛋氨酸殘基；最多20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一基團(tuán)以利于純化的小的延伸，如多組氨酸段，抗原表位或結(jié)合域。
在另一實(shí)施方案中，分離的親本葡糖淀粉酶活性被在極低度嚴(yán)謹(jǐn)，優(yōu)選低度嚴(yán)謹(jǐn)，更優(yōu)選中度嚴(yán)謹(jǐn)，更優(yōu)選中高度嚴(yán)謹(jǐn)，進(jìn)而更優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)，最優(yōu)選極高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核苷酸探針雜交的核酸編碼，所述探針在同樣的條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)，(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆，實(shí)驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約)。SEQ ID NO1的亞序列是至少100個核苷酸或優(yōu)選至少200個核苷酸。而且，亞序列可以編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。親本多肽也可以是具有葡糖淀粉酶活性的多肽的等位基因變體或片段。
可采用SEQ ID NO1的核酸序列或其亞序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段設(shè)計核酸探針，以便按照本領(lǐng)域熟知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。具體地，這樣的探針可用于經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法與目的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒定并分離本文中相應(yīng)基因。所述探針可以比完整序列短很多，但長度至少為15，優(yōu)選至少25，和更優(yōu)選至少35個核苷酸。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針都可使用。通常標(biāo)記探針以便檢測相應(yīng)基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。這些探針均包括在本發(fā)明中。
因此，可在從所述其他生物制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并編碼具有葡糖淀粉酶活性之多肽的DNA。通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)可分離來自所述其他生物的基因組或其他DNA。可將來自所述文庫的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至并固定在硝酸纖維素或其他適宜的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1或其亞序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用該載體材料。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，雜交指在極低至極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，核酸序列與對應(yīng)于SEQ ID NO1或其互補(bǔ)鏈或其亞序列的核酸序列雜交。用X射線膠片檢測在這些條件下與所述核酸探針雜交的分子。
對于至少100個核苷酸的長探針，用2xSSC，0.2％SDS優(yōu)選至少在45℃(極低嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選50℃(低嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選55℃(中等嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少60℃(中等偏高嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少65℃(高嚴(yán)謹(jǐn)度)，最優(yōu)選至少70℃(極高嚴(yán)謹(jǐn)度)將載體材料最后洗滌3次，每次15分鐘。
對于約15個核苷酸至約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)謹(jǐn)度定義為在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸氫二鈉，0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中，在相對于按照Bolton和McCarthy(1962，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proceedings ofThe National Academy of Sciences USA)481390)計算方法計算的Tm低5℃至10℃的溫度下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡方法，進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌。
對于約15個核苷酸至約70個核苷酸的短探針，在比所計算的Tm低5℃-10℃的溫度下，將載體材料用6XSCC加0.1％SDS洗滌一次，15分鐘，用6XSSC洗滌兩次，每次15分鐘。
本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，其通過(a)在極低，低，中，中高，高，或極高嚴(yán)謹(jǐn)度下與SEQ ID NO1或其互補(bǔ)鏈，或其亞序列雜交；和(b)分離所述核酸序列而產(chǎn)生。亞序列優(yōu)選至少100個核苷酸的序列，如編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段的序列。
所涉及的親本葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO2的成熟葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性的至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選60％，更優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選100％。
克隆能編碼親本葡糖淀粉酶的DNA序列用本領(lǐng)域熟知的各種方法，從生產(chǎn)所述葡糖淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物中可分離編碼親本葡糖淀粉酶的DNA序列。首先應(yīng)用來自產(chǎn)所述葡糖淀粉酶的生物體的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果所述葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，則可合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并用于從制備自目標(biāo)生物的基因組文庫中鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆?；蛘撸捎煤信c另一種已知葡糖淀粉酶基因同源之序列的標(biāo)記型寡核苷酸探針作為探針，利用極低到極高嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交和洗滌條件鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆。如上述。
用于鑒定葡糖淀粉酶編碼克隆的另一種方法涉及將基因組DNA的片段插入表達(dá)載體，例如質(zhì)粒中，用所得基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化葡糖淀粉酶陰性細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪板在含葡糖淀粉酶底物(即麥芽糖)的瓊脂上，由此鑒定表達(dá)葡糖淀粉酶的克隆。
或者，通過現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers所述的亞磷酰胺法(1981)，Tetrahedron Letters 22，p.1859-1869或者M(jìn)atthes等(1984)，EMBO J.3，p.801-805所述的方法合成編碼所述酶的DNA序列。在亞磷酰胺方法中，用例如自動DNA合成儀合成寡核苷酸，使其純化、退火、連接，然后克隆到適宜的載體中。
最后，所述DNA序列可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成的、基因組的或cDNA來源的序列(根據(jù)需要，對應(yīng)于完整DNA序列各部分的片段)而制備的基因組序列與合成序列的混合序列、合成序列與cDNA序列的混合序列或者基因組序列與cDNA的混合序列。還可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用特異性引物，按US4683202或R.K.Saiki等(1988)，科學(xué)239，1988，pp.487-491所述制備DNA序列。
定點(diǎn)誘變分離了編碼葡糖淀粉酶的DNA序列并鑒定了合乎要求的突變位點(diǎn)后，用合成的寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有位于所需突變位點(diǎn)側(cè)的核苷酸序列；在寡核苷酸合成的過程中插入突變核苷酸。在具體的方法中，在攜帶葡糖淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生單鏈DNA缺口，編碼葡糖淀粉酶的序列。然后，將攜帶所需突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)填平剩余缺口，用T4連接酶連接構(gòu)建體。Morinaga等(1984)，生物技術(shù)2，p.646-639描述了該方法的具體實(shí)施例。US4760025公開了通過對表達(dá)盒進(jìn)行微小改變來導(dǎo)入編碼多個突變的寡核苷酸。但是，通過Morinaga方法可以在任何時間導(dǎo)入更多種的突變，因為可以導(dǎo)入不同長度的眾多寡核苷酸。
Nelson和Long(1989)，分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry)180，p.147-151描述了另一種將突變導(dǎo)入編碼葡糖淀粉酶的DNA序列的方法。該方法包括經(jīng)3步產(chǎn)生PCR片段，該片段含有通過用化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)中的一個引物而導(dǎo)入的所需突變。通過用限制核酸內(nèi)切酶裂解從PCR-產(chǎn)生的片段中分離攜帶突變的DNA片段，然后再插入到表達(dá)質(zhì)粒中。
此外，Sierks等(1989)“在泡盛曲霉葡糖淀粉酶的活性位點(diǎn)Trp120的定點(diǎn)誘變”，蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.)，2，621-625；Sierks等(1990)“通過在活性位點(diǎn)Asp176，Glu179，Glu180進(jìn)行定點(diǎn)誘變來確定泡盛曲霉葡糖淀粉酶的催化機(jī)理”蛋白質(zhì)工程，32，193-198；還記述了曲霉屬葡糖淀粉酶中的定點(diǎn)誘變。
定域隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變可有利地定域于所述親代葡糖淀粉酶的一部分。例如，當(dāng)酶的某些區(qū)域被鑒定為對酶的給定特性特別重要時，以及當(dāng)預(yù)期修飾能導(dǎo)致具有改良特性的變體時，定域隨機(jī)誘變較為有利。當(dāng)親代酶的三級結(jié)構(gòu)已被闡明，且所述結(jié)構(gòu)與酶的功能相關(guān)時，一般可鑒定出所述區(qū)域。
通過使用上述的PCR產(chǎn)生的誘變技術(shù)或本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，可以方便地進(jìn)行定域的或區(qū)域-特異性的隨機(jī)誘變?；蛘?，通過例如插入適當(dāng)?shù)妮d體來分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后可使用上述任何誘變方法對所述部分進(jìn)行誘變。
提供本發(fā)明變體的備選方法包括基因改組，例如WO 95/22625(來自Affymax Technologies N.V.)或WO 96/00343(來自Novo Nordisk A/S)中所述。
葡糖淀粉酶變體的表達(dá)根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過上述方法，或通過本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號的控制序列，并任選包括阻抑基因或多種激活基因。
表達(dá)載體帶有編碼本發(fā)明葡糖淀粉酶變體DNA序列的重組表達(dá)載體是任何可以方便地進(jìn)行重組DNA方法的載體，載體的選擇取決于將被引入的宿主細(xì)胞。載體可以是，當(dāng)被引入宿主細(xì)胞時可整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并與其所整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制的那些。合適的表達(dá)載體例子包括pMT838。
啟動子載體中，DNA序列應(yīng)該可操作連接適合的啟動子序列。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以從編碼對宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白的基因獲得。
引導(dǎo)編碼本發(fā)明葡糖淀粉酶變體的DNA序列轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主中，轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子是例如，大腸桿菌lac操縱子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因dagA，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、枯草芽孢桿菌xy1A和xy1B基因等的啟動子。對于在真菌宿主中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，可用的啟動子的例子有來自米曲霉TAKA淀粉酶基因，釀酒酵母TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)(Alber等(1982)，J.Mol.Appl.Genet1，p.419-434，米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶的啟動子。
表達(dá)載體本發(fā)明表達(dá)載體也含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當(dāng)?shù)氐米耘c啟動子相同的來源。
載體可進(jìn)一步含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外，載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可通過WO91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來完成選擇。
分別連接編碼葡糖淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗室手冊，第2版，冷泉港，1989)。
宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的上述DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明的細(xì)胞，在本發(fā)明葡糖淀粉酶變體的重組生產(chǎn)中作為宿主細(xì)胞較有利。可以方便地通過將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體整合進(jìn)宿主染色體，從而用該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。由于所述DNA序列更可能在細(xì)胞中保持穩(wěn)定，此整合通常被認(rèn)為是有利的。DNA構(gòu)建體整合進(jìn)入宿主染色體可按照常規(guī)方法，例如，同源或異源重組來進(jìn)行。備選地，可用上述與不同類型宿主細(xì)胞有關(guān)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是較高等生物的細(xì)胞，如哺乳動物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選是微生物細(xì)胞，如細(xì)菌或真菌(包括酵母)的細(xì)胞。
適當(dāng)細(xì)菌的例子如下革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以，例如，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或使用感受態(tài)細(xì)胞以其本身已知的方式進(jìn)行。
酵母優(yōu)選選自糖酵母屬或裂殖糖酵母屬，例如釀酒酵母。
宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌，例如曲霉屬某個種的菌株，最優(yōu)選米曲霉或黑曲霉，或鐮孢屬菌株，如尖孢鐮孢(Fusarium oxysporium)，禾谷鐮孢(完整狀態(tài)即Gribberella zeae，以前為Sphaeria zeae，又名Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis)，或硫色鐮孢(完整狀態(tài)即Gribberella puricaris，又名三隔鐮孢，桿孢狀鐮孢，接骨木鐮孢，玫瑰色鐮孢，玫瑰色鐮孢的禾谷鐮孢變種)，F(xiàn)usarium cerealis(又名Fusarium crookwellense)，或Fusariumvenenatum。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷型菌株或蛋白酶陰性菌株。
例如堿性蛋白酶基因“alp”缺失的米曲霉JaL125就是蛋白酶缺陷型菌株。在WO 97/35956(Novo Nordisk)，或歐洲專利429,490中有此菌株的描述。
絲狀真菌細(xì)胞可通過涉及原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及隨后使細(xì)胞壁以其本身的方式再生的一種方法來轉(zhuǎn)化。在EP238023(Novo Nordisk A/S)中描述了用曲霉作宿主微生物，其內(nèi)容在此引作參考。
生產(chǎn)葡糖淀粉酶變體的方法在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明葡糖淀粉酶變體的方法，該方法包括在利于生產(chǎn)變體并從細(xì)胞及/或培養(yǎng)液中回收該變體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于目的宿主細(xì)胞生長并表達(dá)本發(fā)明葡糖淀粉酶變體的任何常規(guī)培養(yǎng)基?？捎玫呐囵B(yǎng)基可從銷售商購得或按照已公開的配方(例如按美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)制備。
通過已熟知的方法從培養(yǎng)液中可以方便地回收宿主細(xì)胞分泌的葡糖淀粉酶變體，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)液分離細(xì)胞，通過鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基質(zhì)中的蛋白類成分，然后使用層析的方法，如離子交換層析，親和層析，等。
淀粉轉(zhuǎn)化本發(fā)明提供一種利用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體從淀粉生產(chǎn)葡萄糖及類似物的方法。通常，該方法包括在α-淀粉酶存在下部分水解前體淀粉，然后在葡糖淀粉酶存在下通過切割α-(1→4)和α-(1→6)糖苷鍵從淀粉或相關(guān)寡糖和多糖分子的非還原末端進(jìn)一步水解釋放D-葡萄糖。
利用α-淀粉酶進(jìn)行的前體淀粉的部分水解使淀粉分子通過水解內(nèi)部的α-(1→4)鍵而初步分解。在商業(yè)應(yīng)用中，利用α-淀粉酶的初步水解在約105℃下進(jìn)行。所處理的淀粉濃度很高，通常30％-40％固含量。在這種提高的溫度下的初步水解一般進(jìn)行5分鐘。然后將部分水解的淀粉轉(zhuǎn)移到第二個罐，85-90℃溫育約1小時，得到10-15的葡萄糖當(dāng)量值(D.E.)。
通常在一個單獨(dú)的罐中，在降低至30-60℃的溫度下，在有葡糖淀粉酶時進(jìn)一步水解從淀粉或相關(guān)寡糖和多糖分子的非還原末端釋放出的D-葡萄糖。該底物液體的溫度優(yōu)選降至55-60℃之間。該溶液的pH值從6-6.5降至3-5.5。優(yōu)選pH為4-4.5。將葡糖淀粉酶加入該溶液中，使反應(yīng)進(jìn)行24-72小時，優(yōu)選36-48小時。
通過使用本發(fā)明的熱穩(wěn)定的葡糖淀粉酶變體可以在比傳統(tǒng)分批糖化過程更高的溫度下進(jìn)行糖化過程。依照本發(fā)明，糖化可在60-80℃以上進(jìn)行，優(yōu)選63-75℃。其既可用于傳統(tǒng)分批方法(如上所述)也可用于連續(xù)糖化。
實(shí)際上，包括一或多步膜分離步驟，即過濾步驟的連續(xù)糖化過程必須在60℃以上進(jìn)行以保持一個合理的高膜通量。因此，本發(fā)明熱穩(wěn)定的葡糖淀粉酶變體為在工業(yè)化糖化過程可接受的合理價格和時間內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模連續(xù)糖化處理提供了可能。依照本發(fā)明甚至可以縮短糖化時間。
本發(fā)明葡糖淀粉酶變體(如AMG變體)的活性在60-80℃比在傳統(tǒng)采用的溫度范圍30-60℃時通常要高很多。因此，當(dāng)所述葡糖淀粉酶實(shí)施糖化過程時通過提高溫度可以縮短時間。
此外，提高熱穩(wěn)定性改善了T1/2(半衰期，如“材料和方法”部分所定義)。由于本發(fā)明葡糖淀粉酶變體改進(jìn)了熱穩(wěn)定性，所以糖化過程中僅需要添加小量葡糖淀粉酶以替代已失活的酶。依照本發(fā)明，更多的葡糖淀粉酶在糖化過程中保持活性。此外，在63℃以上進(jìn)行糖化可以減少微生物污染的風(fēng)險。
在JP 3-224493；JP1-191693；JP62-272987；EP452,238中記述了使用本發(fā)明葡糖淀粉酶變體進(jìn)行糖化過程的實(shí)例。
在本發(fā)明方法中，本發(fā)明葡糖淀粉酶變體可與一種能水解至少有4個糖基的分子中的α-(1→6)糖苷鍵的酶聯(lián)合使用。優(yōu)選地，本發(fā)明葡糖淀粉酶變體可與支鏈淀粉酶或異淀粉酶聯(lián)合使用。在G.M.A.van Beynum等，淀粉轉(zhuǎn)化技術(shù)，Marcel Dekker，New York，1985，101-142中提出了支鏈淀粉酶和異淀粉酶的去支鏈應(yīng)用，所述酶的分子性質(zhì)，所述酶和葡糖淀粉酶的潛在用途。
本發(fā)明的又一方面涉及本發(fā)明葡糖淀粉酶變體在淀粉轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明葡糖淀粉酶變體可用于包括連續(xù)糖化步驟的連續(xù)淀粉轉(zhuǎn)化過程。
本發(fā)明葡糖淀粉酶變體也可以以固定化形式使用。這適于并經(jīng)常用于生產(chǎn)麥芽糖糊精或葡萄糖漿，或特定的糖漿，如麥芽糖糖漿，還可用于與果糖漿生產(chǎn)有關(guān)的寡糖提余液(raffinate)流。
依照本發(fā)明，本發(fā)明的AMG變體也可用于生產(chǎn)醇類，例如燃用或食用醇類。US 5231017記述了其中一個方法。材料和方法酶
AMG G1公開在Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)，1097-1102，(SEQ IDNO13)中的黑曲霉葡糖淀粉酶G1，可從Novo Nordisk得到。
AMG G2截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G1，表示為SEQ ID NO2，可從Novo Nordisk得到。
溶液緩沖液0.05M乙酸鈉(1L milli-Q-water中6.8g)，pH4.5終止液0.4M NaOHGOD-perid，124036，Boehringer Mannheim底物麥芽糖29mM(100ml 50mM乙酸鈉中1g麥芽糖，pH4.5)(Sigma)麥芽庚糖10mM，115mg/10ml(Sigma)宿主細(xì)胞米曲霉JaL125米曲霉IFO4177，可從發(fā)酵研究所，Osaka；17-25 JusoHammachi 2-Chome Yodogawa-ku，Osaka，日本得到，其采用米曲霉pyrG基因作標(biāo)記，并通過一步基因取代方法(G.May，“絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)(Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi”(1982)，p.1-25.Eds.J.R.Knghorn和G.Turner；Blackie Academic and Professional)使堿性蛋白酶基因“alp”缺失(Murakami K等(1991)，Agric.Biol.Chem.55，p.2807-2811)。WO 97/35956(Novo Nordisk)中進(jìn)一步公開了菌株JaL125。
微生物菌株釀酒酵母(S.cerevisiae)YNG318MATαleu2-Δ2 ura3-52 his4-539 pep4-Δ1[cir+]質(zhì)粒pCAMG91參見
圖1，包含黑曲霉G1葡糖淀粉酶(AMG G1)的質(zhì)粒。Boel等(1984)，EMBO J.3(7)，p1581-1585中記述了pCAMG91的構(gòu)建。
pMT838編碼截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G2(SEQ ID NO2)的質(zhì)粒pJSO026(釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒)(J.S.Okkels，(1996)“pYES載體中URA3-啟動子的缺失提高了釀酒酵母中真菌脂肪酶的表達(dá)水平。DNA重組生物技術(shù)III生物學(xué)和工程學(xué)的整合，vol.782，Annals of the New York Academy ofSciences”)。更特定地，通過用來自釀酒酵母的組成型表達(dá)的TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)啟動子(Albert和karwasaki，(1982)，J.Mol.Appl.Genet.，1，419-434)，取代pYES2.0的誘導(dǎo)型GAL1-啟動子，并缺失URA3啟動子的一部分，可從pYES2.0得到表達(dá)質(zhì)粒pJSO37。
方法釀酒酵母YNG318的轉(zhuǎn)化將DNA片段和開放型載體混合并通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母YNG318。
測定比活并表示為kcat(sec.-1)750μL底物(1％麥芽糖，50mM乙酸鈉，pH4.3)在所選溫度例如37℃或60 ℃溫育5分鐘。
加入50μL稀釋在乙酸鈉中的酶。分別在0、3、6、9、12分鐘后取100μL等份試樣，轉(zhuǎn)移到100μL0.4M氫氧化鈉中終止反應(yīng)?？瞻滓舶ㄔ趦?nèi)。
將20μL移到微滴板上，加入200μL GOD-Perid溶液。室溫下溫育30分鐘后650nm測定吸收值。
用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，比活計算為kcat(sec.-1)。
測定AGU活性并表示為AGU/mg一個Novo淀粉葡糖苷酶單位(AGU)定義為37℃，pH4.3下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量。此分析方法的詳述(AEL-SM-0131)可要求NovoNordisk提供。
用Boehringer Mannheim，124036的葡萄糖GOD-Perid試劑盒以修飾的(AEL-SM-0131)方法將活性測定為AGU/ml。標(biāo)準(zhǔn)品AMG-標(biāo)準(zhǔn)品，批次7-1195，195AGU/ml。
375μL底物(50mM乙酸鈉中加入1％麥芽糖，pH4.3)37℃溫育5分鐘。添加25μL的酶的乙酸鈉稀釋液。10分鐘后，加入100μL0.25MNaOH終止反應(yīng)。取20μL轉(zhuǎn)到96孔微滴板上，加入200μL GOD-Perid溶液。室溫30分鐘后，測定650nm吸光度，參照AMG標(biāo)準(zhǔn)品以AGU/mg計算活性。
活性(AGU/ml)除以蛋白濃度(mg/ml)可算得以AGU/mg表示的比活。
曲霉的轉(zhuǎn)化(一般方法)以米曲霉孢子接種100ml YPD(Sherman等，(1981)，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗室)，振蕩培養(yǎng)約24小時。通過微孔布過濾收集菌絲體，用200ml0.6MMgSO4清洗。將菌絲體懸浮在15ml1.2M MgSO4，10mM NaH2PO4中，pH5.8中。將懸浮液于冰上冷卻，加入1ml含120mg NovozymTM234的緩沖液。5分鐘后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma H25型)，37℃下輕微振蕩連續(xù)培養(yǎng)1.5-2.5小時，直到通過鏡檢觀察到樣品中大量原生質(zhì)體出現(xiàn)。
微孔布過濾懸浮液，濾液移至無菌試管，加5ml 0.6M山梨糖醇，100mMTris-HCl，pH7.0覆蓋。1000g下離心5分鐘，從MgSO4層上層收集原生質(zhì)體。2倍體積的STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2)加入到該原生質(zhì)體懸浮液中，將該混合物1000g離心5分鐘。將原生質(zhì)體沉淀重懸在3ml STC中，重新沉積。重復(fù)該過程。最終，將原生質(zhì)沉體沉淀重懸在0.2-1ml STC中。
將100μL原生質(zhì)體懸浮液與5-25μg p3SR2(Hynes等，Mol.And Cel.Biol.，Vol.3，No.8，1430-1439，Aug.1983所述攜帶構(gòu)巢曲霉amdS基因的質(zhì)粒)混合在10μLSTC中?；旌弦菏覝仂o置25分鐘。加入0.2ml 60％PEG4000(BDH29576)，10 mM CaCl2，10mMTris-HCl，pH7.5，小心混合(兩次)，最終加入0.85ml同一溶液，小心混合。使該混合液室溫靜置25分鐘，2500g下旋轉(zhuǎn)15分鐘，得到的沉淀重懸于2ml 1.2M山梨糖醇中。再次沉淀后，將原生質(zhì)體鋪板在基本平板(Cove，(1996)，Biochem.Biophys.Acta113，51-56)上，該平板中含有1.0M蔗糖，pH7.0，10mM乙酰胺作氮源，20mM CsCl抑制背景生長。37℃培育4-7天后，揀出孢子，懸在無菌水中，劃線接種以獲得單菌落。重復(fù)該過程，第二次再分離后取單菌落保存為確定的轉(zhuǎn)化體。
補(bǔ)料分批發(fā)酵在含有以麥芽糖糊精為碳源，尿素為氮源，并含有酵母提取物的培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。將所需米曲霉宿主細(xì)胞的搖瓶培養(yǎng)液接種到含3.5％所述碳源和0.5％所述氮源的培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。在34℃pH5.0的條件下培養(yǎng)24小時后，開始連續(xù)補(bǔ)加碳源和氮源。保持碳源水平作為限制性因子，要確保氧過量供應(yīng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)進(jìn)行4天，然后通過離心，超濾，澄清過濾和除菌過濾來回收酶。
純化將培養(yǎng)液過濾，加入硫酸銨(AMS)到1.7M，pH調(diào)到5。離心除去沉淀的物質(zhì)，將含有葡糖淀粉酶活性的溶液上樣到Toyo Pearl Butyl柱，該柱已用1.7M AMS，20mM乙酸鈉，pH5預(yù)平衡。用平衡緩沖液洗出未結(jié)合的物質(zhì)。用10mM乙酸鈉，pH4.5，以10倍柱體積中1.7-0M AMS的線性梯度洗脫結(jié)合蛋白。收集含葡糖淀粉酶的級分，并對20mM乙酸鈉，pH4.5透析。然后將該溶液上樣到Q Sepharose柱，該柱已用10mM Piperazin，Sigma，pH5.5預(yù)平衡。用平衡緩沖液洗下未結(jié)合的物質(zhì)。以在10mM Piperazin中0-0.3M氯化鈉(10倍柱體積)的線性梯度洗脫結(jié)合蛋白。收集含葡糖淀粉酶的級分，通過SDS-PAGE確認(rèn)純度。
T1/2(半衰期)方法I變體的熱穩(wěn)定性使用下列方法測定為T1/268℃、70℃或75℃下將950μL50mM乙酸鈉緩沖液(pH4.3)(NaOAc)溫育5分鐘。緩沖液中加入50μL酶(4AGU/ml)。在，例如0，5，10，20，30和40分鐘時取樣2×40μL樣品，冰上冷卻。用溫育前(0分鐘)測定的活性(AGU/ml)為參照(100％)。穩(wěn)定性的降低(百分比)計算為保溫時間的函數(shù)。在不同時間測定葡糖淀粉酶的百分比殘余活性。T1/2表示相對活性降為50％所需的時間。
T1/2(半衰期)方法IIT1/2測定步驟如下在30％葡萄糖，50mM乙酸鈉，pH4.5，所需溫度(例如70℃)下溫育目標(biāo)酶(約0.2 AGU/ml)。在設(shè)定的時間間隔取樣，冰上冷卻，用pNPG方法(如下所述)測定殘余酶活性。
在不同的時間測定葡糖淀粉酶的百分比殘余活性。T1/2表示相對活性降為50％所需的時間。
殘余酶活的測定(pNPG法)pNPG試劑0.2g pNPG(對-硝基苯葡萄糖吡喃糖苷)溶解在0.1M乙酸鹽緩沖液(pH4.3)中，補(bǔ)足100ml。
硼酸鹽溶液3.8g Na2B4O7·10H2O溶解在Milli-Q water中，補(bǔ)足100ml。
25μL樣品中加入50μL底物，50℃下溫育2小時。加入150μL硼酸鹽溶液終止反應(yīng)。405nm測定光密度，計算殘余活性。
pAMGY的構(gòu)建pAMGY載體如下構(gòu)建用AMG基因取代pJSO026中的脂肪酶基因，所述AMG基因是用正向引物FG25’-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCAGCA ATG-3’(SEQ ID NO10)和反向引物RG25’-CTC AAA CGA CTCACC AGC CTC TAG AGT-3’(SEQ ID NO11)，以AMG基因的質(zhì)粒pLAC103為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得。用XbaI和SmaI在37℃消化pJSO026質(zhì)粒2小時，用Klenow片段使PCR擴(kuò)增子末端鈍化，然后用XbaI消化。連接該載體片段和PCR擴(kuò)增子，通過電轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。產(chǎn)生的載體為pAMGY。
pLaC103的構(gòu)建用黑曲霉AMGII cDNA克隆(Boel等，(1984)，同上)作為構(gòu)建pLaC103的來源以便在釀酒酵母中表達(dá)AMG的GII形式。
構(gòu)建分幾步，列于下用XbaI切割pT7-212(EP3 7856/US5162498)，用Klenow DNA聚合酶和dNTP進(jìn)行末端鈍化。用EcoRI切割后，得到的載體片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化，與pBoe153的2.05kb EcoR1-EcoRV片段連接，從而在所得質(zhì)粒pG2x的AMG編碼片段的EcoRV末端再造XbaI位點(diǎn)。
為除去AMG cds上游的DNA，以及用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識別位點(diǎn)裝飾AMG的編碼DNA，進(jìn)行下述的構(gòu)建分離p53的930kb EcoRI-PstI片段并進(jìn)行AluI切割，將得到的771bpAlu-PstI片段與帶有末端鈍化型EcoRI位點(diǎn)的pBR322(如上)連接，再用PstI切割。在得到的質(zhì)粒pBR-AMG’中，在距離AMG cds的起始密碼子34bp處再造EcoRI位點(diǎn)。
從pBR-AMG’分離得到775bp的EcoRI-PstI片段，并在包括pT7-212的XbaI-EcoRI載體片段的連接反應(yīng)中與pG2x中的1151bp PstI-XbaI片段連接。
得到的質(zhì)粒pT7GII在有堿性磷酸酶的存在下進(jìn)行BamHI切割，然后在磷酸酶失活后用SphI進(jìn)行部分切割。得到2489bp的SphI-BamHI片段，其包括連接到AMGII cds的S.c.TPI啟動子。上述片段與pT7GII的1052bpBamHI片段一起與經(jīng)SphI-BamHI消化及堿性磷酸酶處理的pMT743(EP37856/US5162498)載體片段連接。得到的質(zhì)粒是pLaC103。
篩選熱穩(wěn)定的AMG變體在下述熱穩(wěn)定性濾膜分析中篩選文庫。
用于熱穩(wěn)定性的濾膜分析酵母文庫鋪板在含100μg/ml氨芐青霉素的SCFura瓊脂板上的醋酸纖維素濾膜(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)-和硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)的夾層上，30℃下至少72小時。將菌落影印到已用甲醇活化1分鐘的PVDF濾膜(Immobilon-P，Millipore，Bedford)，或Protran濾膜(未活化)上，然后用0.1M NaAc洗膜，再室溫下溫育2小時。用自來水從PVDF/Protran濾膜上洗下菌落。溫育前用針分別標(biāo)記每一濾膜夾層和PVDF/Protran濾膜，這樣在篩選后可以在濾膜上定位陽性變體。將結(jié)合有變體的PVDF膜轉(zhuǎn)移到有0.1M NaAc，pH4.5的容器中，47℃或使用Protran膜時可選67-69℃下溫育15分鐘。將SCura-瓊脂平板上的醋酸纖維素和硝酸纖維素濾膜夾層室溫保存以備用。溫育后，在含5％麥芽糖，1％瓊脂糖，50mMNaAc，pH4.5的平板上測定殘余活性。含有PVDF的試驗板如濾膜夾層一樣標(biāo)記，并50℃溫育2小時。除去PVDF濾膜后，試驗板用Glucose GOD perid(Boehringer Mannheim GmbH，德國)染色。具有殘余活性的變體在試驗板上表現(xiàn)為白色背景上的墨綠點(diǎn)。改進(jìn)的變體位于保存板上。按照第一次篩選的條件再次篩選改進(jìn)的變體。
使用DOPE程序進(jìn)行隨機(jī)誘變的一般方法隨機(jī)誘變可按下列步驟進(jìn)行1.在親本酶中選擇用于修飾的目的區(qū)域，2.在所選目的區(qū)域中確定突變和非突變位點(diǎn)，3.確定可以進(jìn)行何種突變，例如考慮所要構(gòu)建的變體的所需穩(wěn)定性和/或性能，4.挑選結(jié)構(gòu)合理的突變，5.參照步驟4調(diào)整經(jīng)步驟3挑選的殘基，6.通過使用適當(dāng)?shù)腄OPE算法分析核苷酸分布，7.如果需要，調(diào)整所要?dú)埢詽M足遺傳密碼的實(shí)用性，例如考慮由遺傳密碼引起的約束，如為避免引入終止密碼子所引起的約束；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道一些密碼子組合并不實(shí)用，需要進(jìn)行調(diào)整。
8.制備引物9.使用引物進(jìn)行隨機(jī)誘變10.通過篩選所需改進(jìn)的特性來選擇所得葡糖淀粉酶變體。
Dope算法適用于步驟6的Dope算法為本領(lǐng)域所熟知。Tomandl，D.等，1997，計算機(jī)輔助分子設(shè)計雜志(Joumal of Computer-Aided Molecular Design)1129-38記述一種這樣的算法。另一算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Sevendsen，A，和Kretzschmar，T(1998)核酸研究26697-702)。
實(shí)施例實(shí)施例1AMGG2變體的構(gòu)建定點(diǎn)誘變?yōu)闃?gòu)建AMG G2酶(SEQ ID NO2)的變體，參照制造商說明書使用市售試劑盒，Chameleon雙鏈定點(diǎn)誘變試劑盒。
將編碼目的AMG G2酶的基因定位在pMT838上，所述質(zhì)粒是在含AMG G1型的質(zhì)粒pCAMG91(見
圖1)上缺失G2 nt.1362和G2 nt.1530間的DNA而得到的。
參照制造商說明書，利用下列引物將pMT838的氨芐青霉素基因的ScaI位點(diǎn)改變?yōu)镸lul位點(diǎn)72585’p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3’(SEQ ID NO3)(這樣就改變了氨芐青霉素抗性基因中發(fā)現(xiàn)并用于切割至MluI位點(diǎn)的ScaI位點(diǎn))。然后以含目的AMG基因的pMT838載體作DNA聚合酶的模板并使用oligo 7258(SEQ ID NO3)及21401(SEQ ID NO4)。
引物21401(SEQ ID NO4)用作選擇性引物。
214015’pgg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg ccttgg acc tgc gtt ata gcc 3’(在未改變氨基酸序列的情況下，改變了AMG基因中發(fā)現(xiàn)的ScaI位點(diǎn))。
通過加入含有所要突變的適合的oligo可引入所要的突變(例如，引入半胱氨酸殘基)到目的AMG基因中。
用引物107581引入T12P1075815’pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3’(SEQ ID NO5)通過整個基因的測序證實(shí)突變。使用上述“材料和方法”部分的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入米曲霉。按照上述變體“材料和方法”部分所述進(jìn)行變體的發(fā)酵及純化。
實(shí)施例2
通過定域隨機(jī)摻入誘變來構(gòu)建與親本酶相比穩(wěn)定性提高了的黑曲霉AMG變體為改進(jìn)黑曲霉AMG的熱穩(wěn)定性，在預(yù)選區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變。
殘基區(qū)域L19-G35區(qū)域A353-V374用DOPE軟件(見材料與方法)在上述區(qū)域確定每一所需改變所要摻入的密碼子以使終止密碼子的數(shù)量最少(參見表1)。在密碼子的三個位置計算確切的核苷酸分布以給出建議的氨基酸變化群。所要摻入的區(qū)域特別摻入在指定的位置，這可以有較多的機(jī)會獲得所要?dú)埢?，但是也有其它可能?br> 第一列是要突變的氨基酸，第二列是野生型的百分比，第三列是新的氨基酸。
表1在L19-G35中的摻入L19 90％ NN20 95％ TN21不變I22 不變G23 95％ AA24 90％ S，TD25 93％ S，T，RG26 95％ AA27 90％ S，TW28＜80％R，YV29不變S30 93％ T，NG31 95％ AA32 95％ VD33 80％ R，K，HS34 90％ N
G35不變得到的摻入寡核苷酸鏈在表2中作為有義鏈表示表中還有引物序列，野生型核苷酸序列，親本氨基酸序列和每一摻入位置的核苷酸分布。
表2位點(diǎn) 19 20 21 22 23 24 25 26 27氨基酸序列L NN I GAD G A引物 12TA3T AACATCG4G 5CG 67C G4T8CT野生型序列CTGAAT AACATCGGG GCG GAC GGTGCT位點(diǎn)(續(xù)) 28 29 30 31 32 33 34 35氨基酸序列(續(xù))W VS GA D S G引物 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC野生型序列TGGGTG TCGGGC GCGGACTCT GGC每一摻入位置的核苷酸分布1A10，C902A6，T943A95，C54G95，C55G91，A3，T3，C36G95，A3，C27G3，A95，C28G92，A4，T49A3，T9710G95，T511G3，A9712G95，A2，C313T5，C9514G88，A8，C415G7，A9316G4，C9617G4，A9618G95，A2，C3正向引物(SEQ ID NO6)FAMGII′ 5-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC 12T A3T AAC ATCG4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGCATT GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3′反向引物(SEQ ID NO7)
RAMG15′-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3′表3在區(qū)域A353-V374中的摻入A353＜80％ D，E，Q，N，YL35490％ Q，EY35590％ N，QS35690％ T，D，NG35780％ P，A，S，TA35893％ SA35990％ S，T，NT36090％ R，KG36185％ A，S，TT36290％ SY363不變S36493％ DS36593％ N，Q，KS36693％ P，DS367不變S36893％ D，N，TY36993％ Q，EY370不變S37193％ NS37293％ N，TI373不變V37493％ N，Y，H得到的摻入寡核苷酸鏈在表4中作為有義鏈表示表中還有引物序列，野生型核苷酸序列，親本氨基酸序列和每一摻入位置的核苷酸分布。
表4位點(diǎn) 353 354 355 356 357 358 359 360361 362氨基酸序列A L Y S DAA T G T引物 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T1415A 1617C 18CC野生型序列GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACT GGC ACC位點(diǎn)(續(xù)) 363 364 365366 367 368369370氨基酸序列(續(xù))Y S S S S S T Y引物(續(xù)) TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T野生型序列(續(xù))TAC TCT TCGTCC AGTTCG ACT TAT位點(diǎn)(續(xù)) 371 372 373 374氨基酸序列(續(xù))S S I V引物(續(xù)) A16T 2930T ATT 313233野生型序列(續(xù))AGT AGC ATT GTA每一摻入位置的核苷酸分布1G91，A3，T3，C32A13，C873A40，T604G3，A3，C945A6，T946G4，A4，T927G2，A96，C28G93，A3.5，C3.59G87，A8，C510A84，C1611G93，T712G92，A5，T313A3，C9714G3，A9715G2，A2，T4，C9216G93，A717G93，C718A90，T1019G4，A9620G95，A521G96，A422G3，C9723G2，A1，T95，C224A3，C97
25G95，A3，C226G2，A96，C227A5，C9528A95，T529G2，A9830G94，A4，C231G94，A3，T1，C232A4，T9633A20，C80引物FAMGIV(SEQ ID No8)5′-GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T1415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28TA16T 2930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3′引物RAMGVI(SEQ ID NO9)5′ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3′隨機(jī)誘變使用表2和表3中可見的摻入的寡核苷酸(通稱FAMG)和針對L19-G35區(qū)域的反向引物RAMG，以及，覆蓋了N-末端(FG25’-CAT CCC CAGGAT CCT TAC TCA GCA ATG-3’(SEQ ID NO10)和C-末端(RG25’-CTCAAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT(SEQ ID NO11)的特定SEQ IDNO2引物，通過重疊延伸方法(Horton等，基因，77(1989)，pp.61-68)產(chǎn)生PCR-文庫片段，有21個堿基對的重疊。質(zhì)粒pAMGY用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。在大腸桿菌/酵母穿梭載體pAMGY中通過同源重組克隆PCR片段(參見材料和方法)。
篩選如上述“材料和方法”部分所述，使用Protran膜在熱穩(wěn)定膜分析中篩選文庫，并在67-69℃下溫育。
實(shí)施例2在68℃的熱穩(wěn)定性使用實(shí)施例1所述方法構(gòu)建AMG G2變體。
使用“材料和方法”中的方法I在68℃下測定熱穩(wěn)定性，以T1/2表示，并與相同條件下的野生型黑曲霉AMG G2對比。
T2K+S30P+N427M+S444G+V470MA393R+T490A+V59A+PLASD(N-末端延伸)S119P+Y312Q+Y402F+S416H，T379A+S386K+A393R+T2E，S386P+S340G+D357S+T360V.
實(shí)施例3比活A(yù)MG G2變體如實(shí)施例1構(gòu)建。如“材料和方法”部分所述，在37℃pH4.5下測定比活為kcat或AGU/mg，使用麥芽糖為底物。
實(shí)施例4在75℃的熱穩(wěn)定性采用實(shí)施例1所述方法構(gòu)建AMG G2變體。
使用“材料和方法”中的方法I在75℃和pH4.5下測定熱穩(wěn)定性，以T1/2表示，并與相同條件下的野生型黑曲霉AMG G2對比。
實(shí)施例5AMG變體AGR130的糖化性能如下所述在70℃測定具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的變體AGR130(V59A+L66R+T72I+S119P+N313G+S340G+S356G+A393R+Y402F+E408R+N427M)的糖化性能。
參比酶是野生型黑曲霉AMG G2。糖化在下列條件下進(jìn)行底物10DE麥芽糖糊精，約30％DS(w/w)溫度70℃初始pH 4.3(在70℃)酶量0.24AGU/g DS糖化將麥芽糖糊精(從普通淀粉制備)溶解在煮沸的Milli-Q水中，制備糖化底物，將干物質(zhì)調(diào)為約30％(w/w)。pH調(diào)到4.3。相當(dāng)于15g干重的底物樣品轉(zhuǎn)移到50ml藍(lán)蓋玻璃燒瓶中，水浴攪拌。加入酶，必要時調(diào)pH。進(jìn)行平行實(shí)驗。定時取樣，HPLC分析確定碳水化合物組成。
序列表<110>諾沃挪第克公司(Novo Nordisk A/S)<120>葡糖淀粉酶變體<130>5967.204-WO<160>13<170>適用于Windows 3.0的FastSEQ<210>1<211>1605<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220><221>sig-peptide<222>(1)...(72)<221>mat-peptide<222>(73)...(1602)<221>CDS<222>(1)...(1602)<400>1atg tcg ttc cga tct cta ctc gcc ctg agc ggc ctc gtc tgc aca ggg 48Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-20 -15 -10ttg gca aat gtg att tcc aag cgc gcg acc ttg gat tca tgg ttg agc 96Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser-5 1 5aac gaa gcg acc gtg gct cgt act gcc atc ctg aat aac atc ggg gcg 144Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala10 15 20gac ggt gct tgg gtg tcg ggc gcg gac tct ggc att gtc gtt gct agt 192Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40ccc agc acg gat aac ccg gac tac ttc tac acc tgg act cgc gac tct 240Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser45 50 55ggt ctc gtc ctc aag acc ctc gtc gat ctc ttc cga aat gga gat acc 288Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr60 65 70agt ctc ctc tcc acc att gag aac tac atc tcc gcc cag gca att gtc 336Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val75 80 85cag ggt atc agt aac ccc tct ggt gat ctg tcc agc ggc gct ggt ctc 384Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu90 95 100ggt gaa ccc aag ttc aat gtc gat gag act gcc tac act ggt tct tgg 432Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115 120gga cgg ccg cag cga gat ggt ccg gct ctg aga gca act gct atg atc 480Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile125 130 135ggc ttc ggg cag tgg ctg ctt gac aat ggc tac acc agc acc gca acg 528Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr140 145 150gac att gtt tgg ccc ctc gtt agg aac gac ctg tcg tat gtg gct caa 576Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln155 160 165tac tgg aac cag aca gga tat gat ctc tgg gaa gaa gtc aat ggc tcg 624Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser170 175 180tct ttc ttt acg att gct gtg caa cac cgc gcc ctt gtc gaa ggt agt 672Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200gcc ttc gcg acg gcc gtc ggc tcg tcc tgc tcc tgg tgt gat tct cag 720Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln205 210 215gca ccc gaa att ctc tgc tac ctg cag tcc ttc tgg acc ggc agc ttc 768Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe220 225 230att ctg gcc aac ttc gat agc agc cgt tcc ggc aag gac gca aac acc 816Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr235 240 245ctc ctg gga agc atc cac acc ttt gat cct gag gcc gca tgc gac gac 864Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp250 255 260tcc acc ttc cag ccc tgc tcc ccg cgc gcg ctc gcc aac cac aag gag 912Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270275 280gtt gta gac tct ttc cgc tca atc tat acc ctc aac gat ggt ctc agt 960Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser285 290 295gac agc gag gct gtt gcg gtg ggt cgg tac cct gag gac acg tac tac 1008Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr300 305 310aac ggc aac ccg tgg ttc ctg tgc acc ttg gct gcc gca gag cag ttg 1056Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu315 320 325tac gat gct cta tac cag tgg gac aag cag ggg tcg ttg gag gtc aca 1104Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr330 335 340gat gtg tcg ctg gac ttc ttc aag gca ctg tac agc gat gct gct act 1152Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360ggc acc tac tct tcg tcc agt tcg act tat agt agc att gta gat gcc 1200Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala365 370 375gtg aag at ttc gcc gat ggc ttc gtc tct att gtg gaa act cac gcc 1248Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala380 385 390gca agc aac ggc tcc atg tcc gag caa tac gac aag tct gat ggc gag 1296Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu395 400 405cag ctt tcc gct cgc gac ctg acc tgg tct tat gct gct ctg ctg acc 1344Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr410 415 420gcc aac aac cgt cgt aac tcc gtc gtg cct gct tct tgg ggc gag acc 1392Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440tct gcc agc agc gtg ccc ggc acc tgt gcg gcc aca tct gcc att ggt 1440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly445 450 455acc tac agc agt gtg act gtc acc tcg tgg ccg agt atc gtg gct act 1488Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr460 465 470ggc ggc acc act acg acg gct acc ccc act gga tcc ggc agc gtg acc 1536Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr475 480 485tcg acc agc aag acc acc gcg act gct agc aag acc agc acc acg acc 1584Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr490 495 500cgc tct ggt atg tca ctg tga 1605Arg Ser Gly Met Ser Leu505 510<210>2<211>534<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220><221>signal<222>(1)…(24)<400>2Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-20 -15 -10Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser-5 1 5Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala10 15 20Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser45 50 55Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr60 65 70Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val75 80 85Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu90 95 100Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115 120Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile125 130 135Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr140 145 150Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln155 160 165Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser170 175 180Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln205 210 215Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe220 225 230Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr235 240 245Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp250 255 260Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270 275 280Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser285 290 295Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr300 305 310Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
315 320 325Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr330 335 340Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala365 370 375Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala380 385 390Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu395 400 405Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr410 415 420Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440Ser Ala Sar Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly445 450 455Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr460 465 470Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr475 480 485Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr490 495 500Arg Ser Gly Met Ser Leu505 510<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物7258<400>3gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac 30<210>4<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物21401<400>4ggggatcatg ataggactag ccatattaat gaagggcata taccacgcct tggacctgcg60ttatagcc 68<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物107581<400>5gcaacgaagc gcccgtggct cgtac 25<210>6<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物FAMGII<400>6cgaagcgacc gtggctcgta ctgccatcta taacatcggc gcgtctgtgc gcggtggcat60tgtcgttgct agtcccagca cggataac 88<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物RAMG1<400>7gatggcagta cgagccacgg tcgcttcg 28<210>8<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物FAMGIV<400>8gtgtcgctgg acttcttcaa gaacctctta ccctactaca gtcgttatca ttgatgccgt60gaagactttc gccga 75<210>9<211>21<212>DNA<213>引物RAMGVI<400>9cttgaagaag tccagcgaca c 21<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物FG2
<400>10catccccagg atccttactc agcaatg 27<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物RG2<400>11ctcaaacgac tcaccagcct ctagagt 27<210>12<211>2602<212>DNA<213>黑曲霉(ASPERGILLUS NIGER)<400>12ttcgtcgcct aatgtctcgt ccgttcacaa actgaagagc ttgaagtggc gagatgtctc 60tgcaggaatt caagctagat gctaagcgat attgcatggc aatatgtgtt gatgcatgtg 120cttcttcctt cagcttcccc tcgtgcgagt gaggtttggc tataaattga agtggttggt 180cggggttccg tgaggggctg aagtgcttcc tcccttttag gcgcaactga gagcctgagc 240ttcatcccca gcatcattac acctcagcaa tgtcgttccg atctctactc gccctgagcg 300gcctcgtctg cacagggttg gcaaatgtga tttccaagcg cgcgaccttg gattcatggt 360tgagcaacga agcgaccgtg gctcgtactg ccatcctgaa taacatcggg gcggacggtg 420cttgggtgtc gggcgcggac tctggcattg tcgttgctag tcccagcacg gataacccgg 480actgtatgtt tcgagctcag atttagtatg agtgtgtcat tgattgattg atgctgactg 540gcgtgtcgtt tgttgtagac ttctacacct ggactcgcga ctctggtctc gtcctcaaga 600ccctcgtcga tctcttccga aatggagata ccagtctcct ctccaccatt gagaactaca 660tctccgccca ggcaattgtc cagggtatca gtaacccctc tggtgatctg tccagcggcg 720ctggtctcgg tgaacccaag ttcaatgtcg atgagactgc ctacactggt tcttggggac 780ggccgcagcg agatggtccg gctctgagag caactgctat gatcggcttc gggcagtggc 840tgcttgtatg ttctccaccc ccttgcgtct gatctgtgac atatgtagct gactggtcag 900gacaatggct acaccagcac cgcaacggac attgtttggc ccctcgttag gaacgacctg 960tcgtatgtgg ctcaatactg gaaccagaca ggatatggtg tgtttgtttt attttaaatt1020tccaaagatg cgccagcaga gctaacccgc gatcgcagat ctctgggaag aagtcaatgg1080ctcgtctttc tttacgattg ctgtgcaaca ccgcgccctt gtcgaaggta gtgccttcgc1140gacggccgtc ggctcgtcct gctcctggtg tgattctcag gcacccgaaa ttctctgcta1200cctgcagtcc ttctggaccg gcagcttcat tctggccaac ttcgatagca gccgttccgg1260caaggacgca aacaccctcc tgggaagcat ccacaccttt gatcctgagg ccgcatgcga1320cgactccacc ttccagccct gctccccgcg cgcgctcgcc aaccacaagg aggttgtaga1380ctctttccgc tcaatctata ccctcaacga tggtctcagt gacagcgagg ctgttgcggt1440gggtcggtac cctgaggaca cgtactacaa cggcaacccg tggttcctgt gcaccttggc1500tgccgcagag cagttgtacg atgctctata ccagtgggac aagcaggggt cgttggaggt1560cacagatgtg tcgctggact tcttcaaggc actgtacagc gatgctgcta ctggcaccta1620ctcttcgtcc agttcgactt atagtagcat tgtagatgcc gtgaagactt tcgccgatgg1680cttcgtctct attgtggtaa gtctacgcta gacaagcgct catgttgaca gagggtgcgt1740actaacagaa gtaggaaact cacgccgcaa gcaacggctc catgtccgag caatacgaca1800agtctgatgg cgagcagctt tccgctcgcg acctgacctg gtcttatgct gctctgctga1860ccgccaacaa ccgtcgtaac tccgtcgtgc ctgcttcttg gggcgagacc tctgccagca1920gcgtgcccgg cacctgtgcg gccacatctg ccattggtac ctacagcagt gtgactgtca1980cctcgtggcc gagtatcgtg gctactggcg gcaccactac gacggctacc cccactggat2040ccggcagcgt gacctcgacc agcaagacca ccgcgactgc tagcaagacc agcaccagta2100cgtcatcaac ctcctgtacc actcccaccg ccgtggctgt gactttcgat ctgacagcta2160ccaccaccta cggcgagaac atctacctgg tcggatcgat ctctcagctg ggtgactggg2220aaaccagcga cggcatagct ctgagtgctg acaagtacac ttccagcgac ccgctctggt2280atgtcactgt gactctgccg gctggtgagt cgtttgagta caagtttatc cgcattgaga2340gcgatgactc cgtggagtgg gagagtgatc ccaaccgaga atacaccgtt cctcaggcgt2400gcggaacgtc gaccgcgacg gtgactgaca cctggcggtg acaatcaatc catttcgcta2460tagttaaagg atggggatga gggcaattgg ttatatgatc atgtatgtag tgggtgtgca2520taatagtagt gaaatggaag ccaagtcatg tgattgtaat cgaccgacgg aattgaggat2580atccggaaat acagacaccg gg 2602<210> 13<211> 640<212> PRT<213> 黑曲霉(ASPERGILLUS NIGER)<400> 13Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly1 5 10 15Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser20 25 30Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala35 40 45Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser50 55 60Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser65 70 75 80Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr85 90 95Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val100 105 110Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu115 120 125Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp130 135 140Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile145150 155 160Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr165 170 175Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln180 185190Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser195 200 205Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser210 215 220Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln225 230 235 240Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe245 250 255Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr260 265 270Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp275 280 285Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu290 295 300Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser305 310 315 320Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr325 330 335Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu340 345 350Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr355 360 365Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr370 375 380Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val 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Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val610 615 620Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg625 630 635 640
權(quán)利要求
1.親本葡糖淀粉酶的變體，其包含在下列一或多個位置的改變59，66，72，119，189，223，227，313，340，342，352，379，386，393，395，402，408，416，425，427，444，486，490，494，其中(a)所述每一改變是(i)在占據(jù)此位置的氨基酸下游插入氨基酸，(ii)占據(jù)此位置的氨基酸的缺失，或(iii)占據(jù)此位置的氨基酸用另一氨基酸取代，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性且(c)每一位置對應(yīng)于具有SEQ IDNO2之氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶氨基酸序列的位置。
2.親本葡糖淀粉酶的變體，其包含下列的一或多個改變V59A，L66V/R，T72I，S119P，I189T，Y223F，F(xiàn)227Y，N313G，S340G，K352R，S356G，T379A，S386K，N，R，P，A393R，S395R，Y402F，E408R，T416A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，E，W，Y，V，優(yōu)選T416H，A425T，N427S/M，S444G，S486G，T490A，T494P/A，其中(a)所述變體具有葡糖淀粉酶活性且(b)每一位置對應(yīng)于具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶氨基酸序列的位置。
3.權(quán)利要求1或2的變體，其中親本葡糖淀粉酶具有與SEQ ID NO2之氨基酸序列同一性至少約65％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％，還最優(yōu)選至少約97％的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1-3的變體，其中的親本葡糖淀粉酶為能在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1的核酸序列或互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列編碼。
5.權(quán)利要求1-4任一項的變體，其中親本葡糖淀粉酶從曲霉屬得到，特別是黑曲霉，或踝節(jié)菌屬，特別是Talaromyces emersonii。
6.權(quán)利要求1-5任一項的變體，其中親本葡糖淀粉酶是從黑曲霉得到的黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶。
7.權(quán)利要求1-6任一項的變體，其中的改變是取代。
8.權(quán)利要求1-7任一項的變體，其中的改變是插入。
9.權(quán)利要求1-8任一項的變體，其中的改變是缺失。
10.權(quán)利要求1-9任一項的變體，其中的變體相對于親本葡糖淀粉酶具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。
11.權(quán)利要求1-10任一項的變體，其中的變體相對于親本葡糖淀粉酶具有提高的比活。
12.含有編碼權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體的DNA序列的DNA構(gòu)建體。
13.帶有權(quán)利要求12的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
14.用權(quán)利要求12的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的細(xì)胞，它是微生物，特別是細(xì)菌或真菌。
16.權(quán)利要求18的細(xì)胞，它是曲霉屬菌株，特別是黑曲霉菌株。
17.權(quán)利要求17-19的細(xì)胞，它是踝節(jié)菌屬菌株，特別是Talaromycesemersonii的菌株。
18.將淀粉轉(zhuǎn)化或部分水解為含葡萄糖的糖漿的方法，該方法包括在權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體存在下糖化淀粉水解產(chǎn)物的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中葡糖淀粉酶變體的用量范圍為0.05-0.5AGU/g干物質(zhì)。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中包含至少30％干重的淀粉水解產(chǎn)物的糖化。
21.權(quán)利要求18-20任一項的方法，其中在選自支鏈淀粉酶和異淀粉酶組的脫支酶的存在下進(jìn)行糖化，所述脫支酶優(yōu)選得自Bacillusacidopullulyticus或Bacillus deramificans的支鏈淀粉酶或得自淀粉皮假單胞菌的異淀粉酶。
22.權(quán)利要求18-21任一項的方法，其中糖化條件為pH3-5.5，溫度60-80℃，優(yōu)選63-75℃，進(jìn)行24-72小時，優(yōu)選在pH4-4.5進(jìn)行36-48小時。
23.權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體在連續(xù)淀粉轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用。
25.權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)寡糖過程中的應(yīng)用。
26.權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)麥芽糖糊精或葡萄糖糖漿過程中的應(yīng)用。
27.權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)燃用或食用醇類過程中的應(yīng)用。
28.權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)飲料中的應(yīng)用。
29.權(quán)利要求1-11任一項的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)有機(jī)化合物，例如檸檬酸，抗壞血酸，賴氨酸，谷氨酸的發(fā)酵過程中的應(yīng)用。
30.通過將權(quán)利要求1-11中設(shè)定的一或多個位置改變從而改進(jìn)親本葡糖淀粉酶熱穩(wěn)定性和/或比活的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及親本真菌葡糖淀粉酶的變體,其表現(xiàn)出特性改變,具體是熱穩(wěn)定性和/或比活提高。
文檔編號C12N15/09GK1360630SQ00810132
公開日2002年7月24日 申請日期2000年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月9日
發(fā)明者比賈恩·R·尼爾森, 艾倫·斯文德森, 亨里克·彼得森, 杰斯珀·文德, 漢尼·V·亨德里克森, 托本·P·弗蘭德森 申請人:諾維信公司