專利名稱：景天庚酮糖－1,7－二磷酸酶在轉基因植物中的表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在轉基因植物中表達景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)，以增加或改善作物生長和發(fā)育、產量、活力以及碳同化產物的分配。表達SBPase的轉基因植物在植物源器官和庫器官(sinkorgan)中的碳同化、碳輸出和碳貯藏得到改善，從而導致作物生長、產量和品質改善。
背景技術：
遺傳工程學的最新進展已經提供了轉化植物以使其包含外源(常常稱為“異源的”或“異種的”)基因或改良的內源基因的必要工具。在植物中引入這樣一個基因將有利地改善植物組織中已經存在的途徑或是引入新途徑，以改變所需產物的水平、增加代謝效率和/或節(jié)省細胞的能量消耗。目前有可能產生這樣的植物所述植物具有獨特的、在農學和作物加工上高度重要的生理和生化性狀和特征。對于作物改良，尤其有價值的目標是在植物生長和發(fā)育、作物產量潛力和穩(wěn)定性、以及作物品質和組成方面起基本作用的性狀。通過遺傳修飾作物，獲得碳同化的改善、更有效的碳貯藏、和/或碳輸出和分配能力增加，可以達到這些改良。
植物、藻類和光合作用細菌的大氣碳固定(光合作用)是在這樣的生物中支持各種過程的主要能量源。在葉綠體基質中進行的卡爾文循環(huán)是高等植物中進行碳同化的主要途徑。碳同化產物或者離開卡爾文循環(huán)進入蔗糖或淀粉的生物合成，或者繼續(xù)進行所述循環(huán)以再生碳受體分子，即核酮糖-1，5-二磷酸。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶是一種催化分支區(qū)中一個基本不可逆反應的酶，在該分支區(qū)中中間產物可以離開所述循環(huán)，因此該酶可能對于調節(jié)在所述循環(huán)的再生階段和蔗糖及淀粉生物合成之間的碳分配是至關重要的。
SBPase沒有已知的胞質對應物，并且據報道僅在葉綠體中發(fā)現(xiàn)該酶，在葉綠體中該酶將景天庚酮糖-1，7-二磷酸(SBP)去磷酸化，生成景天庚酮糖-7-磷酸和無機磷酸。該酶對SBP具有特異性，并受到其產物和甘油酸(Schimkat等，1990)以及果糖-2，6-二磷酸(Cadet和Meunier，1988b)的抑制。光、還原劑和Mg2+是其活性所必需的(Woodrow，1982；Cadet和Meunier，1988a)。該酶是同源二聚體，其亞基分子量為35-38kDa(Nishizawa和Buchanan，1981；Cadet和Meunier，1988c)。
已經報道使用反義技術在煙草植物中去除80％以上的SBPase酶活性，導致缺綠癥、生長速度降低、以及碳同化水平降低(Harrison等，1998)。還觀察到光合系統(tǒng)II的量子效率降低，這導致葉中的糖類含量降低。對糖類狀態(tài)的分析顯示淀粉水平有變化，而蔗糖水平保持不變。這些結果指出SBPase是糖類代謝中可能的限速步驟。
已經在生化上表征了各種景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶，并且已經從下列生物中克隆了對應的mRNA(cDNA)藻類(Genbank登記號X74418；Hahn和Kuck，1994)和一些高等植物如普通小麥(Triticumaestivum)(Genbank登記號X65540；Miles等，1993)、菠菜(Spinaciaoleracea)(Genbank登記號L76556；Martin等，1996)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Genbank登記號S74719；Willingham等，1994)。因此，在轉基因植物中過量表達編碼SBPase的核酸序列將在所述植物中提供有利的結果，例如碳同化、輸出和貯藏得到改善，光合作用能力增強，以及光合作用能力得到擴展。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了使用編碼景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)的結構核酸構建體以改善植物中的碳同化的方法。
為達到上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了改善植物中碳同化的方法，所述方法包括下列步驟(a)在植物的基因組中插入以5’到3’方向包含可操作性連接的下列元件的核酸序列(i)在選定植物組織的細胞中起作用的啟動子，(ii)導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列，(iii)3’非翻譯核酸序列，所述序列在植物細胞中起作用，導致轉錄終止并在RNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸；(b)獲得包含步驟(a)的核酸的轉化植物細胞；和(c)由轉化植物細胞再生轉化植株，所述轉化植株在所述植物細胞中過量表達景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了分離的核酸序列，所述核酸序列包含能夠在植物細胞中起作用的啟動子、能夠導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的有義方向的結構核酸序列、以及能夠導致轉錄終止并在所轉錄mRNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸的3’非翻譯核酸序列。該核酸序列可以可選地包括內含子、5’非翻譯前導序列或其它設計用于增強轉錄和/或翻譯的核酸序列。
在本發(fā)明的再一實施方案中，提供了來自一種綠藻Chlorellasorokiniana的編碼景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的新型分離的核酸序列。
在本發(fā)明的又一實施方案中，提供了編碼景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的變異體核酸序列，由此將多肽序列中的半胱氨酸殘基以一定方式修飾成為另一氨基酸，以提供不論光存在與否都有活性的酶。
因此，按照本發(fā)明，提供了改善植物的源組織中碳同化、貯藏和輸出的方法。提供了改善庫組織(如根、塊莖、種子、莖和鱗莖)中碳積累的其它方法，因此增加各種庫組織的大小(更大的根和塊莖)，并隨之增加產量。這些庫組織的碳有效性增加將改善和/或改變所述植物細胞成分的組成(如油、蛋白質、淀粉和蔗糖產量和干物質均勻性(solids uniformity))。本發(fā)明的一個目標是通過在植物中引入異源景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶、或通過增加內源形式的所述基因在所述植物中的表達，而在所述植物中過量表達景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶。
通過本發(fā)明的目的可以獲得各種好處。增加景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶在葉綠體中的表達將增加通過卡爾文循環(huán)的碳流量，并潛在地增加在光存在時的大氣碳同化。這將導致光合作用效率提高、葉綠體淀粉產量增加(一種葉的碳貯藏形式，在光合作用低或缺乏的時期降解)、以及葉的蔗糖產量增加，從而引起在給定的光周期內可以預期到達庫組織和發(fā)育中組織的碳輸出凈增加。這種源能力的增加在作物中是有利的性狀，并將導致作物生長、貯藏能力、產量和活力增加。
附圖簡述


圖1顯示了克隆載體pMON47205的質粒圖譜。
圖2顯示了克隆載體pMON47207的質粒圖譜。
圖3顯示了克隆載體pMON47208的質粒圖譜。
圖4顯示了植物轉化載體pMON10098的質粒圖譜。
圖5顯示了植物轉化載體pMON47200的質粒圖譜。
圖6顯示了穿梭載體pMON999的質粒圖譜。
圖7顯示了瞬時轉化載體pMON47203的質粒圖譜。
圖8顯示了在用pMON47203轉化的玉米原生質體中，SBPase蛋白表達的免疫印跡。
圖9顯示了一個柱形圖，比較了在表達小麥SBPase的玉米原生質體和對照原生質體中的SBPase活性。
圖10顯示了景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶蛋白的序列比對。
序列描述SEQ ID NO1合成引物SEQ ID NO2合成引物SEQ ID NO3成熟SBPase的DNA序列(沒有CTP)SEQ ID NO4合成引物SEQ ID NO5連接引物SEQ ID NO6合成引物SEQ ID NO7連接引物SEQ ID NO8包含CTP的SBPase的DNA序列SEQ ID NO9SBPase的氨基酸序列SEQ ID NO10 簡并引物SEQ ID NO11 基因特異性引物SEQ ID NO12 預測的氨基酸序列SEQ ID NO13 基因特異性引物SEQ ID NO14 嵌套基因特異性引物SEQ ID NO15 基因特異性引物SEQ ID NO16 基因特異性引物SEQ ID NO17 嵌套基因特異性引物SEQ ID NO18 基因特異性引物SEQ ID NO19 載體特異性引物SEQ ID NO20 全長Chlorella sorokiniana SBPase cDNA序列SEQ ID NO21 將Chlorella sorokiniana SBPase中的半胱氨酸110和115改變成絲氨酸的誘變引物。
SEQ ID NO22 變異體cDNA序列，其中Chlorellasorokinana SBPase中的半胱氨酸110和115改變成絲氨酸。
SEQ ID NO23 預測的Chlorella sorokiniana SBPase的變異體蛋白序列，其中半胱氨酸110和115被改變成絲氨酸。
發(fā)明詳述提供下面的定義以幫助本領域技術人員理解本發(fā)明的詳細描述。
術語“同一性”是指這樣的氨基酸序列或核酸序列當在BestFit程序(Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc.)中用Smith和Waterman(1981)的局部同源性(localhomology)算法進行比較時，它們完全相同。
術語“相似性”是指這樣的氨基酸序列當在BestFit程序(Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc.)中用Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法進行比較時，在考慮保守氨基酸取代的情況下，它們相互匹配。
“C末端區(qū)”是指肽鏈、多肽鏈或蛋白鏈中，從所述鏈中點到帶有具有游離羧基的氨基酸的末端的區(qū)。
詞組“與啟動子區(qū)異源的核酸或DNA區(qū)段”是指編碼DNA或核酸區(qū)段與它們目前可操作性連接或偶聯(lián)的啟動子在自然界中并不共同存在。
術語“編碼DNA’指編碼任何本文所討論的酶的染色體DNA、質粒DNA、cDNA或合成DNA。
術語“基因組”當用于指細菌時，包括細菌宿主細胞內的染色體和質粒。因此，引入細菌宿主細胞的本發(fā)明的編碼DNA不是整合到染色體上，就是定位在質粒上。術語“基因組”當應用于植物細胞時，不僅包括在細胞核中發(fā)現(xiàn)的染色體DNA，還包括在所述細胞的亞細胞成分中發(fā)現(xiàn)的細胞器DNA。因此，引入植物細胞的本發(fā)明的DNA不是整合進染色體，就是定位在細胞器內。
術語“微生物”指藻類、細菌、真菌和原生動物。
術語“突變蛋白”指肽、多肽或蛋白質的突變形式。
“N末端區(qū)”指肽鏈、多肽鏈或蛋白鏈中，從帶有游離氨基的氨基酸到所述鏈中點的區(qū)。
“過量表達”是指由引入宿主細胞的DNA編碼的多肽或蛋白質表達，其中所述多肽或蛋白質或者在正常情況下在所述宿主細胞中并不存在，或者與由編碼所述多肽或蛋白的內源基因正常表達的水平相比，所述多肽或蛋白質在所述宿主細胞中以更高水平存在，術語“質體”是指一類植物細胞器，其中包括造粉體、葉綠體、色質體、油質體、eoplast、黃化質體、白色體和前質體。這些細胞器能夠自我復制，并包含通常所稱的“葉綠體基因組”，所述“葉綠體基因組”是環(huán)狀DNA分子，根據植物物種，其大小從約120kb到約217kb，并且通常包含一個反向重復區(qū)。
本發(fā)明涉及產生顯示植物生長和發(fā)育、產量以及活力提高或改善的植物細胞的方法。所述方法利用通過遺傳工程整合進植物的細胞基因組的編碼sbpase(景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶)基因的DNA序列，并導致SBPase的表達。本發(fā)明還設想了這樣的植物所述植物過量表達SBPase并且在植物源器官和庫器官中具有改善的碳同化、輸出和貯藏，并因此導致生長、產量和品質改善。
外源SBPase的表達改變碳關系的機制起源于源-庫關系。葉組織是蔗糖源，假如有由于SBPase表達增加產生的活性而得到的更多的蔗糖，則所述蔗糖被轉運到庫組織中，這將導致每給定庫組織重量的貯藏碳(糖、淀粉等)增加。
產生表達SBPase水平增加的遺傳轉化植物的方法要求將雙鏈重組DNA分子引入植物細胞的核基因組。所述DNA分子必須(1)包含要引入所述植物細胞的SBPase酶的結構DNA；(2)具有在植物中起作用，調節(jié)通過RNA聚合酶以組成性方式或組織特異性方式產生RNA序列的啟動子；以及(3)具有3’非翻譯區(qū)，所述3’非翻譯區(qū)用來導致轉錄終止以及在所述RNA的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸。得到的主要RNA分子隨后在核中受到加工，這個過程涉及除去內含子序列并在所述mRNA的3’末端添加聚腺苷酸核苷酸。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶如本文所用，術語“景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶”指催化景天庚酮糖-1，7-二磷酸去磷酸化生成景天庚酮糖-7-磷酸和無機磷酸的酶(E.C.3.1.3.37)。
在本發(fā)明DNA構建體中使用的SBPase基因可以是任何SBPase基因。在本領域內已知許多SBPase cDNA序列，包括來自小麥的序列(Raines等，1992)、來自菠菜的序列(Martin等，1996)、來自擬南芥屬(Arabidopsis)的序列(Willingham等，1994)以及來自Ralstonia的序列(Yoo和Bowien，1995)。本文提供的例子僅說明SBPase的應用，而不應當以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員將認識到在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以應用各種其它基因，以及可以對本文所描述的基因和方法進行改變。例如，可以利用這樣的SBPase所述SBPase已經從可選的其它生物中選出，或者所述SBPase已經受到修飾而缺乏或改變了正磷酸和甘油酸的酶的反饋抑制。由于SBPase被硫氧還蛋白或DTT激活，因此人們也可以利用誘變來操作所述酶，使其不需還原劑的存在而仍保持激活狀態(tài)。然后也可以利用這些突變形式來改變植物代謝。糖類的過量產生也可以通過提供更多的碳骨架，達到增加對影響植物的水勢脅迫的耐性。提供了改善庫組織(如根、塊莖、種子、莖和鱗莖)中碳積累的其它方法，由此增加各種庫組織的大小(更大的根和塊莖)，并隨之增加產量。這些庫組織的碳有效性增加將改善細胞成分的組成(如油、蛋白質、淀粉和蔗糖產量和干物質均勻性)。因此，可以分離許多不同的編碼景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶活性的核酸序列并應用于本發(fā)明中。
本文鑒定了來自Chlorella sorokiniana的SBPase cDNA，并且所述cDNA可以有利地連同本發(fā)明使用。也可以通過將所述半胱氨酸殘基改變?yōu)榱硪环N氨基酸如絲氨酸，使該基因對于光去調節(jié)。在本發(fā)明的范圍內，優(yōu)選任何與所述Chlorella sorokiniana cDNA約85％相同的編碼SBPase的cDNA序列，更優(yōu)選與Chlorella sorokiniana cDNA約90％相同的這樣的cDNA序列，最優(yōu)選與Chlorella sorokiniana cDNA約95％相同的這樣的cDNA。此外，任何編碼與本文所公開的Chlorellasorokiniana預測的氨基酸序列約85％相似、更優(yōu)選約90％相似的SBPase的氨基酸序列被認為在本發(fā)明范圍內。
來自兼性化能自養(yǎng)生物真養(yǎng)產堿菌(Alcaligenes europhus)(目前命名為Ralstonia eutropha)的二磷酸酶基因以及來自藻類Synechococcuslepoliensis的二磷酸酶基因編碼在卡爾文循環(huán)中具有雙重活性(FBPase和SBPase)的蛋白(Yoo和Bowien，1995；Gerbling等，1986)。本領域內的任何技術人員可以使用良好建立的方法，從這些生物或其它生物克隆編碼具有SBPase活性的蛋白的基因。如所述在本發(fā)明中使用的SBPase基因的來源并不限于上面描述的生物，并且不應以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以將所述SBPase基因與葉綠體轉運肽融合，以使所述SBPase蛋白靶向質體。本領域技術人員也將認識到可以構建各種其它嵌合構建體，所述嵌合構建體利用特定質體轉運肽的功能性，將所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶輸入所述啟動子組織特異性所決定的植物細胞質體?；驑嫿ê托揎棻景l(fā)明考慮的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶包括任何顯示具有催化景天庚酮糖-1，7-二磷酸去磷酸化成為景天庚酮糖-7-磷酸和無機磷酸的能力的氨基酸序列，例如蛋白質、多肽或肽片段。如上文所述，這些可以是從異源來源獲得的序列，所述異源來源如藻類、細菌、真菌和原生動物，或者這些可以是內源植物序列，這意味著可以在自然界的植物細胞中發(fā)現(xiàn)的任何序列，其中包括天然(固有的)植物序列以及來自植物病毒或植物病原菌的序列。
本領域技術人員將認識到也可以使用標準技術，如定點誘變或PCR來修飾SBPase酶基因序列，或者可以通過產生合成核酸序列完成所述序列的修飾，并且這些序列仍將被認為是本發(fā)明的SBPase酶核酸序列。例如，可以改變密碼子中的擺動位置以便所述核酸序列編碼相同的氨基酸序列，或者，可以改變密碼子以便產生保守性或非保守性氨基酸取代。在任何一種情況下，所述肽或蛋白質都保持所需的酶活性，并且因此被認為是本發(fā)明的一部分。
在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾SBPase核酸序列，將所述氨基酸序列中的半胱氨酸殘基改變成為不同的氨基酸，防止在成熟多肽的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，由此提供了不論光存在與否都有活性的酶，并因此也防止由于氧化作用使天然蛋白失活。例如，在小麥SBPase中，改變在第52位和第57位(數字對應于Raines等(1999)中所述的成熟小麥SBPase)的半胱氨酸殘基成為不同的氨基酸如絲氨酸、丙氨酸或甘氨酸，以防止在它們之間形成二硫鍵。相應地，也可以改變小球藻屬(Chlorella)SBPase氨基酸第110位和氨基酸第115位(對應于SEQ ID NO12中的小球藻屬SBPase編號)的半胱氨酸殘基，以達到相同效果。
SBPase酶的核酸序列可以是源于基因組DNA、cDNA、mRNA的DNA序列或RNA序列，或者可以全部或部分是合成的?？梢酝ㄟ^從合適來源分離基因組DNA，并使用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和克隆目標序列，從而克隆所述結構基因序列?；蛘?，可以完全合成或部分合成所述基因序列，尤其是當需要提供植物偏倚(plant-preferred)的序列時。因此，可以使用選定植物宿主偏倚的密碼子合成全部或部分所需結構基因。植物偏倚的密碼子可以如下確定例如，根據在特定植物宿主物種表達的蛋白中最經常使用的密碼子確定。對所述基因序列的其它修飾可能導致活性稍微改變的突變異體。
如有需要，可以改變所述sbpase基因的基因序列而不改變蛋白/氨基酸序列，所述改變的方式使得可以增加表達，并因此甚至更有利地影響轉化植物中的糖類含量。在PCT出版物WO 90/10076中陳述了在sbpase基因序列中造成所述改變的優(yōu)選方式?？梢詫⒏鶕鑫墨I中陳述的方法合成的基因如下文所述引入植物，并導致所述SBPase酶的表達水平提高。這在單子葉植物如玉米、水稻、小麥、甘蔗和大麥中尤其有用。啟動子在文獻中已經描述了在植物細胞中有活性的許多啟動子。這些啟動子包括胭脂氨酸合酶(NOS)啟動子和章魚氨酸合酶(OCS)啟動子(由根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的根瘤誘導質粒攜帶)、花椰菜花葉病毒啟動子如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子和35S啟動子以及玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子、來自一種非常豐富的植物多肽即核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導型啟動子、以及葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子等等。所有這些啟動子都已經用于產生在植物中已經表達的各種類型的DNA構建體；參見，例如，PCT出版物WO 84/02913。
在本發(fā)明中可以使用已知或已經發(fā)現(xiàn)在植物細胞中導致DNA轉錄的啟動子。這樣的啟動子可以從各種來源如植物和植物病毒得到，這樣的啟動子包括但不限于增強的CaMV35S啟動子和從植物基因如ssRUBISCO基因分離的啟動子。優(yōu)選所述選定的特定啟動子應該能夠引起充分表達，導致產生有效量的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶以引起所需的碳同化、輸出和貯藏增加。本發(fā)明的雙鏈DNA分子的表達可以由組成型啟動子驅動，從而在所有或大多數植物組織中表達所述DNA分子。此外，還優(yōu)選在特定植物組織如葉或莖中引起所述sbpase基因的表達，而所選擇的啟動子應當具有所需的組織和發(fā)育特異性。本領域技術人員將認識到誘導所希望的碳同化、輸出或貯藏增加所需要的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的量可能根據植物類型而有所不同。因此，可以如下優(yōu)化啟動子功能選擇具有所需組織表達能力和合適啟動子強度的啟動子，并選擇產生所需的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶活性的轉化子或是在靶組織產生所需的糖類代謝的改變的轉化子。在異源結構基因在植物中表達方面，這種從轉化子庫選擇的方法是常規(guī)使用的，因為在含有同一異源基因的轉化子之間由于在所述植物基因組中基因插入位點而有變異(通常稱為“位置效應”)。除了已知導致DNA在植物細胞內轉錄(組成型或組織特異性)的啟動子外，可以鑒定其它啟動子以用于本發(fā)明中在植物cDNA文庫中篩選在靶組織中選擇性表達或優(yōu)先表達的基因，并隨后確定啟動子區(qū)。
為了在植物源組織如葉或莖中表達所述sbpase基因，優(yōu)選在本發(fā)明的雙鏈DNA分子中使用的啟動子在這些特定的組織中有增加的表達。為達到這個目的，可以從具有葉特異性或葉增強表達的基因的多種啟動子中進行選擇。由文獻已知的這樣的基因的例子有來自豌豆的葉綠體谷氨酰胺合成酶GS2(Edwards等，1990)、來自小麥的葉綠體果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)(Lloyd等，1991)、來自馬鈴薯的核光合作用ST-LS1(Stockhaus等，1989)、以及來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸脫氨酶(PAL)基因和查耳酮合酶(CHS)基因(Leyva等，1995)。其它在光合活性組織中顯示活性的有分離自美洲落葉松(Larixlaricina)的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RUBISCO)(Campbell等，1994)；從松樹(cab6；Yamamoto等，1994)、小麥(Cab-1；Fejes等，1990)、菠菜(CAB-1；Luebberstedt等，1994)和水稻(cab1RLuan等，1992)分離的編碼PSII葉綠素a/b結合蛋白的cab基因；來自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)(Matsuoka等，1993)；煙草Lhcb1*2基因(Cerdan等，1997)；擬南芥SUC2蔗糖-H+同向轉運蛋白(symporter)基因(Truernit等，1995)；以及從菠菜分離的類囊體膜蛋白(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS；Oelmueller等，1992)。已經研究和在文獻中描述了其它葉綠素a/b結合蛋白，例如來自白芥(Sinapis alba；Kretsch等，1995)的LhcB和PsbP。導致SBPase特異性地在莖、葉或這些組織的特定細胞類型中產生的啟動子可用于本發(fā)明。例如，RbcS維管束鞘特異性啟動子就是這樣一種組織特異性啟動子。因此，可以獲得用于玉米、小麥、大麥和水稻的天然啟動子并用于本發(fā)明，也可從其它生物獲得以組成型/組織特異性方式起作用的異源啟動子并用于本發(fā)明。在C4植物如玉米中的碳代謝比C3植物如煙草中的碳代謝更加特化。在C4植物中，在維管束鞘細胞葉綠體中通過卡爾文循環(huán)產生的代謝物必須轉運到葉肉細胞的胞質中，在那里進行蔗糖的生物合成。因此，在C4作物的適當細胞類型中進行正確的基因表達需要細胞特異性啟動子。例如，RbcS維管束鞘特異性啟動子將可以用于在玉米的合適細胞類型中表達SBPase。
為了在僅當植物有光合活性的情況下表達sbpase基因(編碼光調節(jié)蛋白或經修飾成為有組成型活性的蛋白)，優(yōu)選在本發(fā)明的雙鏈DNA分子中利用的啟動子僅在光存在的情況下進行表達。為此目的，可以從多種光調節(jié)基因的啟動子中進行選擇，所述光調節(jié)基因包括來自小麥的FBPase(Miles等，1993)、來自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(Sheen，1991)以及來自水稻的葉綠體醛縮酶(Kagaya等，1995)。
由本發(fā)明的DNA構建體產生的RNA也可以包含5’非翻譯前導序列。該序列可以來自選出以表達所述基因的啟動子，并且可以對其進行特異性修飾以增加mRNA的翻譯。也可以從病毒RNA、合適的真核基因或合成的基因序列獲得5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明并不限于如下面實施例展示的構建體，其中所述非翻譯區(qū)源自伴隨所述啟動子序列的5’非翻譯序列。相反，所述非翻譯前導序列可以來自無關的啟動子或編碼序列。
一般來說，當在啟動子序列和結構基因序列之間插入內含子序列，或者可選地在結構編碼序列中插入內含子序列以提供中斷的編碼序列時，將獲得在單子葉植物和一些雙子葉植物中的最佳表達。這樣的內含子序列的例子是在WO 93/19189中描述的HSP 70內含子。聚腺苷酸信號嵌合植物基因的3’非翻譯區(qū)包括聚腺苷酸化信號，該信號在植物中起作用，導致在RNA的3’末端添加聚腺苷酸核苷酸。合適的3’區(qū)的例子有(1)包含農桿菌屬根瘤誘導(Ti)質粒基因如胭脂氨酸合酶(NOS)基因的聚腺苷酸化信號的3’轉的但非翻譯區(qū)，以及(2)植物基因，如大豆貯藏蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)基因。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶活性的質體定向表達在本發(fā)明的一個實施方案中，可以將sbpase基因與葉綠體轉運肽融合，從而將所述SBPase蛋白導向質體。如下文所用，葉綠體和質體將包括各種形式的質體，其中包括造粉體。許多定位在質體中的蛋白質從核基因作為前體表達，然后由葉綠體轉運肽(CTP)靶向質體，所述葉綠體轉運肽在輸入步驟中被去除。這樣的葉綠體蛋白的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO，SSU)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、集光復合體蛋白I和集光復合體蛋白II、以及硫氧還蛋白F。所述質體導向序列可以是但不限于在小麥SBPase cDNA中鑒定的天然葉綠體引導肽(CTP)。已經證明利用具有CTP的蛋白融合物，可以將非質體蛋白靶向葉綠體，并且CTP序列足以將蛋白靶向質體。本領域技術人員也將認識到可以構建各種其它嵌合構建體，所述嵌合構建體利用特定質體轉運肽的功能，將所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶輸入所述啟動子組織特異性所決定的植物細胞質體。與其它轉基因的組合可以通過將sbpase與其它有利地影響糖類同化或含量的基因組合，增強sbpase在轉基因植物中的效應，所述基因如在PCT出版物WO 96/24679中描述的編碼蔗糖磷酸化酶的基因、或ADPGPP基因如大腸桿菌(E.coli)glgC基因和其突變異體glgC16。PCT出版物WO91/19806公開了如何將后面一種基因摻入許多植物物種中以增加淀粉或干物質。另一個可以與sbpase組合以增加碳同化、輸出或貯藏的基因是編碼蔗糖磷酸合酶(SPS)的基因。PCT出版物WO 92/16631公開了一種這樣的基因以及其在轉基因植物中的應用。另一個可以與SBPase組合的基因是果糖-1，6-二磷酸醛縮酶。植物轉化/再生在開發(fā)本發(fā)明的核酸構建體時，一般將所述構建體的各種成分或其片段插入方便的克隆載體中，所述克隆載體如能夠在細菌宿主如大腸桿菌中復制的質粒。有許多已經在文獻中描述的載體，其中許多載體是市售的。在每一次克隆后，可以分離具有所需插入片段的克隆載體并對其進行進一步的操作，如限制酶切消化、插入新片段或核苷酸、連接、缺失、突變、切除等等，以定制所需序列的成分。一旦完成所述構建體，就可將其轉移到合適的載體以按照轉化所述宿主細胞的方式進行進一步的操作。
包含sbpase基因的本發(fā)明的雙鏈DNA分子可以通過任何合適的方法插入植物基因組。轉化植物細胞或組織的優(yōu)選方法是農桿菌屬介導的轉化法以及基因槍(biolistics)或粒子槍介導的轉化法。用于農桿菌屬介導轉化的合適植物轉化載體包括那些由根癌農桿菌的Ti質粒衍生的轉化載體，以及那些如由Herrera-Estrella等(1983)，Bevan(1984)，Klee等(1985)和EPO出版物120,516公開的轉化載體。除了衍生自農桿菌屬的Ti質?；蛎T導(Ri)質粒的植物轉化載體外，可以使用其它可選的方法將本發(fā)明的DNA構建體插入植物細胞。這樣的方法可以包括但不限于，例如，應用脂質體、電穿孔、增加游離DNA攝入的化學藥品、通過微粒轟擊傳遞游離DNA、以及使用病毒或花粉的轉化。
適于在單子葉植物中使用電穿孔或粒子槍介導轉化引入sbpase基因的質粒表達載體包括如下成分組成型或組織特異性的啟動子；提供剪接位點以利于所述基因表達的內含子，如Hsp70內含子(PCT出版物WO 93/19189)；以及3’聚腺苷酸化序列如胭脂氨酸合酶3’序列(NOS 3’；Fraley等，1983)。該表達盒可以裝配到適于產生大量DNA的高拷貝復制子中。
用于植物轉化的可用的Ti質粒盒載體的一個例子是pMON-17227。PCT出版物WO 92/04449描述了該載體，該載體包含編碼賦予草甘膦抗性的酶(命名為CP4)的基因，而所述酶基因對于許多植物是極好的選擇標記基因。如所述PCT出版物所述，將該基因與擬南芥屬EPSPS葉綠體轉運肽(CTP2)融合并從FMV啟動子表達。當獲得足量的包含景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶基因或eDNA的細胞(或原生質體)時，將所述細胞(或原生質體)再生成為整株植物。所述再生步驟的方法的選擇并不是至關重要的，對于來自下列的宿主已經有合適的方法豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三葉草等)、傘形科(Umbelliferae)(胡蘿卜、芹菜、歐洲防風)、十字花科(Cruciferae)(甘藍、蘿卜、canola/油菜籽(rapeseed)等)、葫蘆科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黃瓜)、禾本科(Gramineae)(小麥、大麥、水稻、玉米等)、茄科(Solanaceae)(馬鈴薯、煙草、番茄、胡椒)和各種花卉作物(floral crops)如向日葵、和產堅果的樹如杏仁、腰果樹、胡桃和薄殼山核桃。見，例如，Ammirato等(1984)；Shimamoto等(1989)；Fromm(1990)；Vasil等(1990)；Vasil等(1992)；Hayashimoto(1990)；和Datta等(1990)。
可以通過本發(fā)明的實施而增強和/或改善碳同化、增加碳輸出和分配的植物包括但不限于金合歡、苜蓿、aneth、蘋果、杏、菊芋、arugula、石刁柏、鱷梨、香蕉、大麥、豆科植物、甜菜、黑刺莓、越桔、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、卷心菜、canola、網紋甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、芫荽葉、柑桔類、克萊門氏小柑橘(clementine)、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、黃杉樹、茄子、苣荬菜、寬葉苦苣、桉樹、茴香、無花果、葫蘆、葡萄、葡萄柚、蜜瓜、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭蔥、檸檬、椴樹、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、堅果、燕麥、秋葵、洋蔥、橙、觀賞植物、番木瓜、歐芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松、菠蘿、大蕉、李、石榴、楊、馬鈴薯、西葫蘆、榲桲、輻射松、radiccohio、蘿卜、懸鉤子、水稻、黑麥、高梁、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、美國楓香、紅桔、茶樹、煙草、番茄、草坪、藤本植物、西瓜、小麥、薯蕷和綠皮南瓜。
提供下面的實施例以更好地闡述本發(fā)明的實施，而下面的實施例不應以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員將認識到，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本文所述的方法和基因作出各種修改、截短等等。
實施例實施例1SBPase的cDNA克隆和過量表達以產生抗體為分離編碼成熟SBPase蛋白(不含CTP)的基因區(qū)，進行RT-PCR反應。將一微克普通小麥(Triticum aestivum)CV OSLO葉RNA與100pmol隨機六聚體引物(BRL/Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)混合或者與100pmol寡聚dT引物(Promega，Madison，WI)混合，在75℃加熱5分鐘，然后在冰上冷卻。使用Superscript IITM逆轉錄酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照廠商的方案，進行第一鏈cDNA合成。將終止的逆轉錄反應物以1∶7稀釋。將三微升稀釋的第一鏈合成產物與下列物質在100μL內混合100μM每種dNTP，50pmol與所述基因的5’末端具有同源性、設計產生一個NdeI切割位點以用于亞克隆的基因特異性引物(5’-ACATATGTGCGCGATCGGCGA-3’，SEQ ID NO1)，50pmol與所述基因的3’末端具有同源性的基因特異性引物(5’-GGATCCAGAAGAAGATTATTAGGCG-3’，SEQ ID NO2)，以及5單位PWOTM聚合酶(Boehringer，Mannheim，德國)。PCR循環(huán)條件如下95℃，40秒鐘；56℃，1分鐘；72℃，1分鐘30秒(5個循環(huán))隨后是95℃，40秒鐘；61℃，1分鐘；72℃，1分鐘30秒(30個循環(huán))。將982bp的SBPase成熟蛋白基因PCR產物經凝膠純化，克隆進PCR-Blunt克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)以形成pMON47205(
圖1)，然后將其轉化進感受態(tài)大腸桿菌細胞。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇帶有插入片段的克隆，純化質粒并用BamHI消化，以根據克隆載體中的正確取向進行選擇。序列分析揭示雖然核苷酸序列(SEQ ID NO3)在兩個位置有所不同(殘基294從T到C；殘基572從C到T)，但預測的氨基酸序列(SEQ ID NO9)從殘基73開始與公開的序列(Raines等，1992)相同。選出的質粒用NdeI和BamHI限制性消化，按一定方向克隆，將其置于用NdeI/BamHI線性化的pET 15b細菌表達載體(Novagen，Madison，WI)的IPTG誘導型T7聚合酶啟動子控制之下，并轉化進DH5α。通過NdeI/BamHI限制酶切分析篩選轉化子，選出攜帶插入片段的克隆，純化質粒，并將其轉化進大腸桿菌BL21(DE3)以用于蛋白表達的目的。
用2mM IPTG誘導用所述pETl5b-SBPase cDNA構建體轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞達2.5小時，然后在SDS-PAGE凝膠上可以見到一條清楚的約38kDa的蛋白帶，這條帶與二聚體SBPase的亞基多肽鏈的大小相對應。根據組氨酸殘基對固定化鎳離子的親和力，純化由成熟SBPase表達的蛋白。使用Ni-NTA Superflow樹脂(QIAGEN，Valencia，CA)，按照廠商的方案，在變性條件下進行所述純化。使用標準方法(Antech Company，St.Louis，MO)，將用等體積完全佐劑(Complete Adjuvant)(Sigma，St.Louis，MO)乳化的2mL包含1mg純化SBPase蛋白的組分接種山羊以產生抗體。免疫前血清顯示與SBPase沒有反應性。實施例2克隆SBPase cDNA以用于在植物中表達為克隆編碼葉綠體轉運肽的SBPase基因區(qū)，采用一種快速擴增cDNA末端的改良的錨式PCR程序(Frohman，1990；Jain等，1992)。將八百毫微克總RNA與10ng基因特異性引物(5’-TTCCTCAGAGCACGCGTACTTG-3’，SEQ ID NO4)混合，加熱到75℃達5分鐘，然后在冰上冷卻。使用Superscript IITM逆轉錄酶(BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照供應商的方案，進行第一鏈的DNA合成。將所述終止的逆轉錄反應物用一單位核糖核酸酶H在37℃處理20分鐘、在95℃處理5分鐘，然后在冰上冷卻。通過在2,000xg離心通過Ultrafree-MC filterfuge(截止分子量30,000，Millipore，Bedford，MA)而去除多余的引物和dNTP，將保留液在Savant Speedvac(Savant Instruments，Holbrook，NY)中濃縮到15μL。將第一鏈合成產物與10μL加尾混合物(1X加尾緩沖液[BRL/L/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD]，0.4mM dATP，10單位末端脫氧核苷酸轉移酶(deoxytransferase))混合，并在37℃溫育10分鐘。將所述反應混合物加熱到95℃達5分鐘，用TE，pH8.0稀釋到0.5mL，然后用作cDNA庫。在100μL混合物中進行擴增，所述混合物中包含10μL cDNA庫、10μL PWOTM聚合酶10X緩沖液(BRL/L/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，100μM每種dNTP，25pmol基因特異性引物(SEQID NO4)、10pmol多聚(dT)連接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3’；SEQ IDNO5)、以及5單位PWOTM聚合酶(BRL/L/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循環(huán)條件如下95℃，2分鐘；45℃，5分鐘；72℃，40分鐘(1個循環(huán))隨后是95℃，50秒鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘(3個循環(huán))。通過乙醇沉淀除去多余引物，純化PCR產物。將所述沉淀重懸浮于50μL水中，使用新的嵌套基因特異性引物(5’-CATGGGAGTACTCCAACGCCTC-3’，SEQ ID NO6)和連接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3’，SEQ ID NO7)進行另一輪擴增。PCR循環(huán)條件如下95℃，40秒鐘；58℃，1分鐘；72℃，30秒(30個循環(huán))。將約500bp的PCR產物經凝膠純化，亞克隆進PCR-Blunt克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)形成pMON47207(圖2)，然后轉化進One Shot Top 10細胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)以進一步地鑒定特征。序列分析(SEQ ID NO8)顯示，該序列與已公開的序列在9個位置上不同(30，C到T；42，G到C；44，A到G；187，C到A；204，C到G；228，C到G；259，C到T；348，G到C；和351，C到G)，導致三個預測的氨基酸發(fā)生變化(30，Arg變?yōu)镃ys；44，His變?yōu)锳rg；207，Gln變?yōu)镚lu)。
為測試小麥SBPase在植物中的表達，用SalI和BamHI分別限制性消化pMON47205(
圖1)和pMON47207(圖2)。將包含編碼成熟SBPase和CTP區(qū)的序列的片段分別經凝膠純化并相互連接以形成pMON47208(圖3)。用XbaI和BamHI限制性消化pMON47208，將編碼SBPase的序列經凝膠純化并連接進XbaI/BamHI線性化的pMON10098(圖4)。最終形成的載體是pMON47200(圖5)，該載體帶有CaMV E35S啟動子、完整SBPase基因的編碼序列、NOS 3’非翻譯聚腺苷酸化區(qū)、以及用于在植物中進行選擇的卡那霉素抗性。實施例3玉米原生質體的瞬時表達為測試小麥SBPase亞基的表達及它們裝配成為有活性的酶，構建包含以下元件的載體CaMV E35S啟動子、包括CTP的完整SBPase蛋白的編碼序列、NOS 3’終止信號、以及用于在大腸桿菌中進行選擇的氨芐青霉素抗性。所述SBPase基因從pMON47200作為XbaI/BamHI片段分離。將所述SBPase基因連接進XbaI/BamHI線性化的pMON999(圖6)中帶有CaMV E35S、NOS 3’的區(qū)，產生pMON47203(圖7)。依照Sheen等(1991)的方法，將所述DNA構建體電穿孔進玉米原生質體。實施例4轉化玉米原生質體的分析用pMON47203(SBPase)轉化沉淀的原生質體樣品，在冰上的0.18mL提取緩沖液(50mM HEPES pH7.5，1mM果糖二磷酸，1mM景天庚酮糖-1，7-二磷酸，10mM MgCl2，10mM MnCl2，10mM DTT，1％聚乙烯聚吡咯烷酮，10％甘油和CompleteTM蛋白酶抑制劑(Boehringer，Mannheim，德國))中沒有DNA被融解。將每一懸浮物中的細胞渦旋混合均勻并在2,000xg下澄清15分鐘。上清液用G25離心柱(The Nest Group，Southboro，MA)脫鹽。使用BioRad微量蛋白測定(BioRad，Hercules，CA)，根據廠家的方法，測定所述脫鹽蛋白的總蛋白含量。
通過蛋白質印跡分析(圖8)測定蛋白表達和大小。通過與山羊抗小麥SBPase抗體的交叉反應性，檢測到在用pMON47203轉化的原生質體中有比對照原生質體顯著更多的蛋白，指示SBPase酶成功地在植物細胞中過量表達。在玉米原生質體中表達的小麥SBPase(pMON47203)的遷移率是約38kDa，與內源小麥葉SBPase的遷移率相同，指示CTP的正確加工。
如下測定SBPase活性首先水解SBP 10分鐘，然后測量磷酸的釋放量。通過將含有5μg脫鹽蛋白提取物的20μL緩沖液(100mM Tris，8.2，10mM MgCl2，10mM DTT，1.5mM EDTA，10％甘油)與55μL測定緩沖液(50mM Tris，8.2，10mM MgCl2，10mM DTT，1.5mM EDTA，0.27mM景天庚酮糖-1，7-二磷酸)混合，起始反應。在室溫下溫育10分鐘后，通過加入30μL 1M高氯酸而終止反應。通過離心去除沉淀的蛋白，在50μL上清液中加入250μL顯色劑(1％鉬酸銨，1N HCl，0.05％孔雀綠(Itaya和Michio，1966))，通過在660nm處測定吸光度而確定釋放的磷酸的量。使用磷酸標準曲線(0.5-10nmol)進行定量。用pMON47203轉化的原生質體釋放的景天庚酮糖-1，7-二磷酸中的磷酸的量是對照原生質體的釋放量的3倍(圖9)。
針對用小麥SBPase基因轉化的原生質體觀察到的高水平活性提供了證據證明蛋白質印跡分析檢測到的SBPase蛋白是有功能的。實施例5小麥SBPase在煙草中的表達為測試過量表達的來自小麥的SBPase在煙草中的效應，制備pMON47200(圖5)并用作轉化煙草植物的轉化載體。根據Horsch等所述方法(1985)，通過農桿菌屬介導的轉化來轉化煙草植物細胞。通過電穿孔將植物轉化載體轉移進ABI農桿菌屬菌株。
產生在生長室內培養(yǎng)的煙草轉化體系，首先使用針對小麥表達的SBPase產生的山羊抗體通過蛋白質印跡分析進行篩選，以鑒定表達子。然而，不可能使用梯度SDS-PAGE凝膠或等電聚焦凝膠將這些煙草轉化子系中的內源煙草SBPase和轉基因小麥SBPase分開。實施例6從Chlorella sorokiniana中克隆SBPase cDNA以在植物中表達為確定來自Chlorella sorokiniana的編碼SBPase蛋白的基因的序列，進行幾次RT-PCR反應。將一微克Chlorella sorokiniana RNA與100pmol寡聚dT引物(Promega，Madison，WI)混合，在75℃加熱達5分鐘，然后在冰上冷卻。使用Superscript IITM逆轉錄酶(BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照廠商的方案，進行第一鏈的cDNA合成。將終止的逆轉錄反應物以1∶7稀釋。將二十微升稀釋的第一鏈合成產物與下列物質在100μL內混合100μM每種dNTP、50pmol與所述基因的5’末端具有同源性的簡并引物(5’-GGIACIATHTTYGGIGTITGG-3’，SEQ ID NO10)、50pmol與所述基因的3’末端具有同源性的基因特異性引物(5’-RTAICKIARIGTRTAYTTYTC-3’，SEQ ID NO11)、以及5單位Taq聚合酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循環(huán)條件如下95℃，5分鐘(1個循環(huán))；隨后是95℃，40秒鐘；35℃，1分鐘；72℃，1分鐘(5個循環(huán))；隨后是95℃，40秒鐘；40℃，1分鐘；72℃，1分鐘(30個循環(huán))。將比預期大小大250bp的550bp PCR產物用凝膠純化，克隆進PCR-Blunt克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后轉化進感受態(tài)大腸桿菌細胞。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇帶有插入片段的克隆，從所述克隆中純化質粒。序列分析揭示該550bpPCR產物的預測氨基酸序列與雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)序列41％相同。雷氏衣藻序列的殘基226-251與小球藻屬序列有81％相同，衣藻屬序列的殘基252-287與小球藻屬(Chlorella)序列有86％相同，但有一個編碼62個小球藻屬殘基的缺口，推測對應于一個內含子。因此，該片段最有可能從污染的基因組DNA擴增。用所述297bp的編碼序列設計用于5’RACE和3’RACE的引物，以鑒定所述基因其余部分的序列。
為克隆所述SBPase的剩余5’序列，使用快速擴增cDNA末端的改良的錨式PCR程序(Frohman，1990；Jain等，1992)。將九百毫微克總Chlorella sorokiniana RNA與20pmol基因特異性引物(5’-GATGGTCTCGGTCTCCTTCACG-3’，SEQ ID NO13)混合，加熱到75℃達5分鐘，然后在冰上冷卻。使用ThermoscriptTM逆轉錄酶(BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照供應商的方法，在55℃進行第一鏈的DNA合成。將所述終止的逆轉錄反應物用一單位核糖核酸酶H在37℃處理20分鐘、在95℃處理5分鐘，然后在冰上冷卻。通過在2,000xg離心通過Ultrafree-MC filterfuge(截止分子量30,000，Millipore，Bedford，MA)而去除多余的引物和dNTP，將保留液在Savant Speedvac(Savant Instruments，Holbrook，NY)中濃縮到15μL。將第一鏈合成產物與10μL加尾混合物(1X加尾緩沖液[BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD]，0.4mM dATP，10單位末端脫氧核苷酸轉移酶)混合，并在37℃溫育10分鐘。將所述反應混合物加熱到95℃達5分鐘，用10mM Tris，pH8.5稀釋到0.2mL，然后用作cDNA庫。在100μL混合物中進行擴增，所述混合物中包含20μL cDNA庫、10μL PWOTM聚合酶10X緩沖液(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)、100μM每種dNTP，25pmol基因特異性引物(SEQID NO13)、10pmol多聚(dT)連接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3’；SEQ IDNO5)、以及5單位PWOTM聚合酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循環(huán)條件如下95℃，2分鐘；45℃，5分鐘；72℃，40分鐘(1個循環(huán))隨后是95℃，50秒鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘(3個循環(huán))。通過乙醇沉淀除去多余引物，純化PCR產物。將所述沉淀重懸浮于50μL水中，并且在100μl中與下列物質混合10μl PWOTM聚合酶10X緩沖液(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)、50μM每種dNTP、50pmol新的嵌套基因特異性引物(5’-CAGCCACTTGCCATCGTC-3’，SEQ ID NO14)、50pmol連接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3’，SEQ ID NO7)、5單位PWOTM聚合酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循環(huán)條件如下95℃，40秒鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘30秒(30個循環(huán))。將400bp的PCR產物經凝膠純化，亞克隆進PCR-BluntTOPO II克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后轉化進感受態(tài)大腸桿菌細胞以進一步地鑒定特征。序列分析顯示該PCR片段是所述Chlorella sorokiniana SBPase的部分5’序列。
然后使用該序列設計其它引物，使用改良的錨式PCR程序快速擴增cDNA末端(Frohman，1990；Jain等，1992)，以克隆所述SBPase的其余5’序列。將九百毫微克總RNA與20pmol基因特異性引物(5’-GATGGTCTCGGTCTCCTTCACG-3’，SEQ ID NO15)混合，加熱到75℃達5分鐘，然后在冰上冷卻。使用ThermoscriptTM逆轉錄酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照供應商的方法，在55℃進行第一鏈的DNA合成。將所述終止的逆轉錄反應物用一單位核糖核酸酶H在37℃處理20分鐘、在95℃處理5分鐘，然后在冰上冷卻。通過在2,000xg離心通過Ultrafree-MC filterfuge(截止分子量30,000，Millipore，Bedford，MA)，去除多余的引物和dNTP，將保留液在Savant Speedvac(Savant Instruments，Holbrook，NY)中濃縮到15μL。將第一鏈合成產物與10μL加尾混合物(1X加尾緩沖液[BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD]，0.4mM dATP，10單位末端脫氧核苷酸轉移酶)混合，并在37℃溫育10分鐘。將所述反應混合物加熱到95℃達5分鐘，用TE，pH8.0稀釋到0.2mL，并用作cDNA庫。在100μL混合物中進行擴增，所述混合物中包含20μL所述cDNA庫、10μL HotStarTaqTM聚合酶10X緩沖液(Qiagen，Valencia，CA)、20μl的Q 5X緩沖液(Qiagen，Valencia，CA)、50μM每種dNTP、25pmol基因特異性引物(5’-TCCTCAGAGCACGCCAGCTIGC-3’，SEQ IDNO16)、10pmol多聚(dT)連接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3’；SEQ IDNO5)、以及5單位HotStarTaqTM聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)。PCR循環(huán)條件如下95℃，15分鐘；45℃，5分鐘；72℃，40分鐘(1個循環(huán))隨后是95℃，50秒鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘(3個循環(huán))。通過乙醇沉淀除去多余引物，純化PCR產物。將所述沉淀重懸浮于50μL水中，并且與下列物質混合10μL HotStarTaqTM聚合酶10X緩沖液(Qiagen，Valencia，CA)，20μl的Q 5X緩沖液(Qiagen，Valencia，CA)、50μM每種dNTP、50pmol新的嵌套基因特異性引物(5’-AGCTGCTCATCGCCGAACGAGTTG-3’，SEQ ID NO17)、50pmol連接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3’，SEQ ID NO7)、和5單位HotStarTaqTM聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)。PCR循環(huán)條件如下95℃，15分鐘(1個循環(huán))；隨后是95℃，40秒鐘；50℃，1分鐘；72℃，1分鐘30秒(30個循環(huán))。將380 bp的PCR產物經凝膠純化，亞克隆進PCR-Blunt TOPO II克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后轉化進感受態(tài)大腸桿菌細胞以進一步地鑒定特征。序列分析顯示該PCR片段包含所述小球藻屬SBPase的其余5’序列。
使用PCR從Chlorella sorokiniana cDNA文庫分離所述SBPase的其余3’序列，其中所述cDNA庫使用針對cDNA合成和質?？寺〉腟uperscriptTM質粒系統(tǒng)(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)按照供應商的方法在pSport1中構建。將一微克Chlorella sorokinianaRNA與100pmol寡聚dT引物(Promega，Madison，WI)混合，在75℃加熱5分鐘，然后在冰上冷卻。不使用隨所述試劑盒提供的SuperscriptTM逆轉錄酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，而使用ThermoscriptTM逆轉錄酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照廠商的方案，在60℃進行第一鏈的cDNA合成。在100μL的混合物內進行擴增，所述混合物包括200ng文庫DNA、10μL HotStarTaqTM聚合酶10X緩沖液(Qiagen，Valencia，CA)、50μM每種dNTP、50pmol基因特異性引物(5’-AGTTCCTGCTGCAGGACGATGG-3’，SEQ ID NO18)、50pmol載體特異性引物(5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’，SEQ ID NO19)、和5單位HotStarTaqTM聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)。PCR循環(huán)條件如下95℃，15分鐘(1個循環(huán))；隨后是95℃，40秒鐘；62℃，1分鐘；72℃，1分鐘30秒(30個循環(huán))。裝配重疊的5’序列和3’序列，得到具有預測氨基酸序列(SEQ ID NO12)的全長Chlorellasorokiniana SBPase序列(SEQ ID NO20)。
表1.Chlorella sorokiniana SBPase來源的氨基酸序列(SEQ ID NO12)與已知SBPase氨基酸序列的比較。使用Bestfit程序進行序列比較，以確定在下表中的同源性百分率。BestFit程序使用Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法找出兩個序列間最具有相似性的區(qū)段(the best segment of similarity)。
相似性 同一性擬南芥 76.7％ 71.6％雷氏衣藻 82.0％ 78.0％菠菜 74.3％ 68.4％普通小麥 72.0％ 66.8％實施例7克隆編碼FBPase和SBPase兩種活性的基因來自兼性化能自養(yǎng)生物Ralstonia eutropha(真養(yǎng)產堿菌)和來自藻類Synechococcus lepoliensis的二磷酸酶基因編碼在卡爾文循環(huán)中具有兩種活性，即FBPase和SBPase的蛋白(Yoo和Bowien，1995；Gerbling等，1986)?？梢愿鶕赮oo和Bowien(1995)中描述的序列，使用PCR從Ralstonia eutropha克隆編碼具有SBPase活性的蛋白的基因。然后可以將該基因與葉綠體轉運肽融合，以將所述SBPase蛋白靶向質體。實施例8在煙草中表達小球藻屬SBPase和Ralstonia SBPase為測試在煙草中過量表達野生型或去調節(jié)的小球藻屬SBPase以及Ralstonia SBPase的效用，首先將每個基因克隆進pCR-Blunt IITM克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。然后用EcoRI消化每種載體，并將經凝膠純化的編碼每種SBPase的片段分別連接進用EcoRI線性化的pMON10098(圖4)。將使用3種載體中的每一種如Horsch等(1985)所述轉化煙草植物。通過電穿孔將所述植物轉化載體轉移進ABI農桿菌屬菌株。
產生在生長室中培養(yǎng)的煙草轉化子系，首先用針對小麥表達的SBPase產生的山羊抗體通過蛋白質印跡分析進行篩選，鑒定表達子。隨后，對于表達野生型小球藻屬-SBPase的煙草系、表達去調節(jié)小球藻屬SBPase的煙草系以及表達Ralstonia SBPase的煙草系，在植物發(fā)育的不同階段取葉的樣品，采用蔗糖/D-葡萄糖/D-果糖試劑盒(Boehringer Mannheim，德國)分析葉的非結構性糖類(蔗糖、葡萄糖、以及水解成為葡萄糖的淀粉)的每日變化。
將三十到五十毫克冰凍的煙草葉組織樣品在1mL 85℃的水中溫育15分鐘。將離心管在10,000xg離心1分鐘，保留上清液以用于可溶性糖分析。將沉淀重懸浮于1mL 85℃的水中，用Vortex混合，并如上所述離心。小心地取出上清，加入到前面所述的上清組分中，用蔗糖/D-葡萄糖/D-果糖試劑盒(Boehringer Mannheim，德國)分析可溶性糖(蔗糖和葡萄糖)。
通過在所述沉淀中加入3mL 0.1M乙酸鈉，pH5.6并在90℃溫育10分鐘，從所述沉淀中提取淀粉。一旦冷卻后，加入3mL 0.1M乙酸鈉，pH5.6中的1％淀粉葡糖苷酶并渦旋混合。所述樣品在50℃水浴中溫育3小時，每半小時渦旋混合一次。在一臺臺式離心機中以900xg離心30分鐘后，分析上清液中的葡萄糖含量。將游離的葡萄糖換算(adjust)成為無水葡萄糖(當在淀粉中計算該值時，需要乘以比率162/182)。
可以使用標準HPLC、質譜和基于酶促反應的代謝物測定，通過代謝分布型分析(metabolic profiling)，監(jiān)測在轉基因植物組織中的碳同化的變化。實施例9SBPase的去調節(jié)在黑暗中，小麥SBPase由于在Cys-52和Cys-57(編號對應于成熟小麥SBPase，CARaines等，1999.J.Exp.Bot.501-8)之間形成二硫鍵而失活。在光照下，硫氧還蛋白還原所述二硫鍵，產生有活性的酶。通過誘變修飾所述Cys殘基將防止二硫鍵的形成，并因此防止該蛋白由于氧化而失活。使用QuikChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)以及誘變引物(5’-AAGGTGCGCACCGCCTCGTCCGGCGGCACCGCCTCCGTCAACTCGTTCGGCGATG-3’；SEQ ID NO21)，依照廠家的方法，將Cys-110和Cys-115(編號對應于包括CTP的小球藻屬SBPase，SEQ ID NO12)定點誘變成為Ser。將得到的序列SEQ ID NO22插入合適的轉化載體并用于轉化煙草和玉米。測試得到的植株中SBPase在植物組織中的表達，并進行酶促測定以證實活性。分析所述植株，以確定所述植株中碳同化、以及到庫組織中的碳輸出和碳貯藏得到改善。從DNA序列(SEQ ID NO22)得到的預測的氨基酸序列顯示為SEQ ID NO23。
也應當理解，本文所述的實施例和實施方案僅作說明目的，本領域技術人員會提出按照所述實施例和實施方案的各種修改或改變，這些修改或改變將包括在本申請的精神和范圍內，并在本文所附的權利要求書的范圍內。
在本說明書中提到的所有出版物和專利申請指出本發(fā)明所屬領域內技術人員的水平。所有出版物和專利申請都通過引用結合到本文中，其程度同每個出版物或專利申請具體而單獨地通過引用結合到本文中的程度一樣。
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caaggacacc 540acgagcatcg gagaagggaa gatgttctcc cctggcaatc tgagggccac gttcgacaac 600cctgattatg acaagcttgt caactactat gtgaaggaga agtacactct gcgttacacc 660ggaggaatgg tccctgatgt caaccagatc atcgtgaagg agaagggcat cttcacgaac 720gtgacgtcgc cgacggcgaa ggcgaagctg cggctgctgt tcgaggtggc gccgctgggg 780ttcttgatag agaaggccgg cgggcacagc agcgacggca agcagtcggt gctggacaag 840gtgatctccg tcctggacga gcggacccag gtggcctacg gctccaagaa cgagatcatc 900cgcttcgagg agaccctcta cggctcctcc agactcgccg ccagcgccac cgtcggcgcc 960accgcc966<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成引物<400>4ttcctcagag cacgcgtact tg 22<210>5<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述連接引物<400>5gggtcgacat tctagacaga attcgtggat cctttttttt tttttttttt ttt53<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成引物<400>6catgggagta ctccaacgcc tc22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述連接引物<400>7gggtcgacat tctagacaga a 21<210>8<211>1208<212>DNA<213>普通小麥(Triticum aestivum)<400>8tctagagcag caatggagac cgtcgcggct gccggctacg cccgcggggc cgccacgcgc 60tccccggcgt gctgcgccgc catgtccttc tcgcagtcct acaggcccaa ggctgccagg 120ccggcgacct cgttctacgg cgagtcgctg cgggcgaaca cggcgaggac gtcgttcccg 180gcggggaggc agtccaaggc ggcgagccgg gcggcgctca ccacccggtg cgcgatcggc 240gacagcctgg aggagttctt gaccaaggcg acgccggaca agaacctcat caggctgctg 300atctgcatgg gggaggcgat gaggacgatc gccttcaagg tccggaccgc gtcctgcggc 360ggcacggcct gcgtcaactc cttcggcgac gagcagctcg ccgtcgacat gctcgccgac 420aagctcctct tcgaggcgtt ggagtactcc catgtgtgca agtacgcgtg ctctgaggaa 480gtccccgagc tgcaggacat gggtggcccg gtcgaaggcg gattcagtgt ggcgttcgac 540ccccttgacg gctccagcat cgtggacacc aacttcaccg tgggaaccat cttcggcgtc 600tggcccggcg acaagctgac cggcgtcacc ggcggtgacc aggttgctgc cgccatgggc 660atctacggcc ctcgcaccac cttcgtagtt gccctcaagg actgccccgg gacacacgaa 720ttccttctcc tcgacgaagg taaatggcag catgtcaagg acaccacgag catcggagaa 780gggaagatgt tctcccttgg caatctgagg gccacgttcg acaaccctga ttatgacaag 840cttgtcaact actatgtgaa ggagaagtac actctgcgtt acaccggagg aatggtccct 900gatgtcaacc agatcatcgt gaaggagaag 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權利要求
1.一種改善植物中碳同化的方法，所述方法包括下列步驟a)在植物的基因組中插入以5’到3’方向包含下列元件的核酸序列i)在所述植物的細胞中起作用的啟動子，所述啟動子可操作性地連接于；ii)導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列，所述結構核酸序列可操作性地連接于；iii)在所述植物的所述細胞中起作用、導致轉錄終止的3’非翻譯核酸序列；b)獲得包含步驟(a)的核酸序列的轉化植物細胞；和c)從所述轉化植物細胞再生在所述植物細胞中過量表達所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的轉化植株。
2.權利要求1的方法，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于與所述結構核酸序列所插入的植物異源的來源。
3.權利要求2的方法，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于細菌微生物。
4.權利要求3的方法，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列源于Ralstonia。
5.權利要求2的方法，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于綠藻。
6.權利要求5的方法，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于小球藻屬(Chlorella)。
7.權利要求2的方法，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于與所述結構核酸序列所插入的植物異種的植物物種。
8.權利要求1的方法，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列對于所述結構核酸序列所插入的植物是內源序列，并且與未受轉化而不包含所述插入的結構核酸序列的植物相比，可操作性地連接所述序列的所述啟動子能夠以更高水平表達所述插入的內源景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶。
9.權利要求1的方法，其中所述植物是單子葉植物。
10.權利要求1的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
11.權利要求1的方法，其中所述植物選自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯、苜蓿、大麥、棉花、大豆、canola、向日葵和甜菜。
12.權利要求1的方法，其中所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶對于光去調節(jié)。
13.一種分離的核酸序列，所述核酸序列包括(a)在植物細胞中起作用的啟動子，所述啟動子可操作性地連接于；(b)導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的有義方向的結構核酸序列，所述結構核酸序列可操作性地連接于；和(c)在所述植物的所述細胞中起作用、導致轉錄終止的3’非翻譯核酸序列。
14.權利要求13的分離的核酸序列，所述核酸序列還包含內含子。
15.權利要求13的分離的核酸序列，所述核酸序列還包含5’非翻譯前導序列。
16.權利要求13的分離的核酸序列，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于細菌微生物。
17.權利要求16的分離的核酸序列，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于Ralstonia。
18.權利要求13的分離的核酸序列，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于綠藻。
19.權利要求18的分離的核酸序列，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于小球藻屬。
20.權利要求19的分離的核酸序列，其中所述導致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶產生的結構核酸序列來源于植物。
21.權利要求13的分離的核酸序列，其中所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶針對光去調節(jié)。
22.一種分離的核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO20的核苷酸序列，或SEQ ID NO20的簡并變異體。
23.一種分離的核酸序列，所述核酸序列包含編碼多肽的序列，其中所述多肽具有SEQ ID NO12的氨基酸序列，或具有包含保守氨基酸取代的SEQ ID NO12的氨基酸序列。
24.一種分離的核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO20至少85％相同的序列。
25.一種分離的核酸序列，所述核酸序列包含編碼多肽的序列，其中所述多肽具有與SEQ ID NO12至少85％相似的氨基酸序列。
全文摘要
景天庚酮糖－1,7－二磷酸酶(SBPase)是催化景天庚酮糖－1,7－二磷酸轉化生成景天庚酮糖－7－磷酸的反應的酶。該酶位于葉和莖的葉綠體中。提供SBPase在轉基因植物中的過量表達,通過特別增加葉淀粉的生物合成能力并一般性地增加蔗糖生產,從而改善作物產量。還提供了該酶的去調節(jié)變異體。
文檔編號C12N15/55GK1360635SQ00809941
公開日2002年7月24日 申請日期2000年5月12日 優(yōu)先權日1999年5月13日
發(fā)明者R·L·斯陶布, P·W·米勒 申請人:孟山都技術有限公司