本發(fā)明涉及二十二碳六烯酸，尤其是涉及一種發(fā)酵罐底物流加生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法。

背景技術(shù)：

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是主要的高度不飽和脂肪酸之一，屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸。其分子式為C₂₂H₃₂O₂，相對(duì)分子質(zhì)量為328.49，又稱為“腦黃金”，具有促進(jìn)嬰幼兒腦部發(fā)育、保護(hù)視力和預(yù)防、治療心血管疾病等多種重要的生理功能(Crawford P.1987；Birch EE.et al.2002；Uauy R.et al.2006)，常作為功能性因子添加到保健食品和功能食品中而受到了廣泛關(guān)注(Agren JJ.et al.1996；Smith Jr SC.et al.2006)。由于它的廣泛用途，其全球市場(chǎng)需求量也大大增加。當(dāng)前魚油是商業(yè)DHA的主要來源，特別是寒冷海域生活的魚類，被認(rèn)為是豐富、廉價(jià)的DHA資源。但因其魚腥味重、DHA含量較低、脂肪酸組成復(fù)雜、純化困難、資源有限及不利于環(huán)境保護(hù)等缺點(diǎn)(Song XJ.et al.2007)，難以滿足市場(chǎng)需求，因此尋找微生物來源的DHA越來越迫切。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA可克服傳統(tǒng)魚油提取的不足，可用于大量生產(chǎn)DHA，具有廣闊的應(yīng)用前景，因此備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注(Bailey RB.et al.2003；Gill I.et al.1997)。國(guó)外對(duì)DHA的發(fā)酵研究比較早，且其生產(chǎn)在一些歐美國(guó)家和日本已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段(Bailey RB.et al.2003)。近年來，國(guó)內(nèi)一些研究機(jī)構(gòu)對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA進(jìn)行了研究，并取得一定進(jìn)展(Ren LJ.et al.2009；Zhou L.et al.2007)。

目前，合成DHA的微生物主要是一些海洋甲藻類生物，如隱甲藻(Crythecodinium)、破囊壺菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌(Schizochytrium)等(Sijtsma L.et al.2004)。這些微生物為異養(yǎng)型微生物，可以通過發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，進(jìn)而規(guī)?；a(chǎn)DHA。由于海洋甲藻類培養(yǎng)對(duì)于光要求較高，難以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)和利益最大化，故破囊壺菌目來源的DHA生產(chǎn)技術(shù)得到更為廣泛的關(guān)注，并主要集中于兩種菌：破囊壺菌和裂殖壺菌。由于裂殖壺菌生長(zhǎng)繁殖較快，又比其他破囊壺菌耐受機(jī)械攪拌，對(duì)剪切力抵抗作用更強(qiáng)，且脂質(zhì)中PUFAs含量高，故適宜發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)。此外，裂殖壺菌產(chǎn)生的脂質(zhì)中PUFAs含量高，且成分、比例與母乳中的脂質(zhì)組成相近，已被美國(guó)及歐洲有關(guān)食品權(quán)利機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)添加至相關(guān)食物中使用，因此裂殖壺菌被認(rèn)為是產(chǎn)DHA較有前景的微生物資源(Bailey RB.et al.2003；Zhang L.et al.2013)。

目前關(guān)于微生物來源DHA的研究主要集中在篩選優(yōu)良菌株、DHA的生物合成、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化和工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)工藝的探索上。除菌株本身對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的影響外，培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件對(duì)其生長(zhǎng)及產(chǎn)物積累都有很大的影響，如最佳的碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)溫度、pH和溶氧等。只有選擇了經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基組成和最佳的培養(yǎng)條件，才有利于工業(yè)化的發(fā)酵生產(chǎn)。

不同種類和濃度的碳源對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA效果顯著。破囊壺菌目的微生物在利用碳源的能力上有很大的區(qū)別，一般認(rèn)為葡萄糖、果糖和甘油是最適的碳源(Raghukumar S.et al.2008)。Yokochi等(Yokochi T.et al.1998)對(duì)Schizochytrium limacinum SR21菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖、果糖或甘油作為碳源，細(xì)胞能較好的生長(zhǎng)，能達(dá)到較高的DHA產(chǎn)量，且DHA占總脂量的比例達(dá)到30％，產(chǎn)生的其它不飽和酸只有DPA和1％的EPA和AA；而且還發(fā)現(xiàn)麥芽糖和淀粉明顯不利于合成DHA。Wu等(Wu ST.et al.2005)同樣認(rèn)為葡萄糖是裂殖壺菌生長(zhǎng)繁殖的最佳碳源，果糖，蔗糖，乳糖和麥芽糖次之，對(duì)可溶性淀粉利用較難。Chi等(Chi Z.et al.2007)用含甘油的生物柴油工業(yè)副產(chǎn)品來培養(yǎng)Schizochytrium Limacinu，DHA產(chǎn)量可達(dá)4.9g/L?？傊?，不同的微生物因自身酶系構(gòu)成不同，其吸收利用碳源能力也大大的不同，因此選擇適宜、經(jīng)濟(jì)的碳源非常重要。盡管在前人的研究基礎(chǔ)上DHA的產(chǎn)量已有所提高，但若要滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，建立一種有效的DHA生產(chǎn)新策略，進(jìn)一步提高DHA的產(chǎn)量，從而降低生產(chǎn)成本，這對(duì)于滿足市場(chǎng)需求和促進(jìn)我國(guó)食品與生物工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵罐底物流加生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)菌種活化：將菌種轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得活化的菌種，所述菌種為裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310，已于2016年07月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No.12528；

在步驟1)中，所述平板培養(yǎng)基的組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，瓊脂15，pH調(diào)至6.5；所述培養(yǎng)的條件可為：28℃培養(yǎng)24～48h。

2)一級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟1)得到的平板菌落中活化的菌種接入裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶培養(yǎng)，得一級(jí)種子培養(yǎng)液；

在步驟2)中，所述種子培養(yǎng)基的組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5；所述培養(yǎng)的條件可為28℃、200rpm培養(yǎng)24～48h。

3)二級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟2)得到的一級(jí)種子培養(yǎng)液接入裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶培養(yǎng)，得二級(jí)種子培養(yǎng)液；

在步驟3)中，所述種子培養(yǎng)基的組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5；所述接入裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶培養(yǎng)的一級(jí)種子培養(yǎng)液的接種量按體積百分比可為一級(jí)種子培養(yǎng)液的4％；所述培養(yǎng)的條件可為28℃、200rpm培養(yǎng)24h。

4)搖瓶發(fā)酵：將步驟3)得到的二級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)；

在步驟4)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(g/L)：葡萄糖120，谷氨酸鈉5，玉米漿粉5，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10，泛酸鈣3.2，MnCl₂·4H₂O 3，ZnSO₄·7H₂O 3，NiSO₄·6H₂O 2，CuSO₄·5H₂O 2，CoCl₂·6H₂O 0.04，Na₂MoO₄·2H₂O 0.04；維生素組成(mg/L)：VB₁ 9.5，VB₁₂ 0.1，pH調(diào)至6.5；所述培養(yǎng)的條件可為28℃、200rpm培養(yǎng)120h。

5)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將步驟4)得到發(fā)酵培養(yǎng)液，以4％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過流加2M NaOH或1M檸檬酸(CA)自動(dòng)控制發(fā)酵液pH，每4h取樣測(cè)定葡萄糖濃度，每12h取樣測(cè)定生物量、油脂和DHA產(chǎn)量。

在步驟5)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(g/L)：葡萄糖120(5L罐)或葡萄糖40(1T罐)，谷氨酸鈉5，玉米漿粉5，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10，泛酸鈣3.2，MnCl₂·4H₂O 3，ZnSO₄·7H₂O 3，NiSO₄·6H₂O 2，CuSO₄·5H₂O 2，CoCl₂·6H₂O 0.04，Na₂MoO₄·2H₂O 0.04；維生素組成(mg/L)：VB₁9.5，VB₁₂ 0.1，pH調(diào)至6.5；所述培養(yǎng)的條件可在28℃和2vvm的通氣量下培養(yǎng)。

所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的工藝可用于工業(yè)化生產(chǎn)DHA。

通過發(fā)酵過程中底物的添加提高裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310產(chǎn)DHA產(chǎn)量的方法，且通過培養(yǎng)基中復(fù)合氮源的利用，大大縮短發(fā)酵周期。葡萄糖是工業(yè)生產(chǎn)中一種經(jīng)濟(jì)易得的碳源，通過葡萄糖的分批補(bǔ)料策咯，以獲得裂殖壺菌高密度生產(chǎn)DHA。實(shí)驗(yàn)首先通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)DHA的生產(chǎn)菌株裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310進(jìn)行分批補(bǔ)料濃度的優(yōu)化，在搖瓶實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，在5L發(fā)酵罐，1T發(fā)酵罐中進(jìn)行裂殖壺菌的流加分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。通過流加高濃度的葡萄糖溶液，控制發(fā)酵過程參數(shù)，研究底物對(duì)發(fā)酵過程的影響，得到最佳的補(bǔ)料工藝條件。采用該發(fā)酵工藝生產(chǎn)DHA，可以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，有效提高多不飽和脂肪酸和DHA的產(chǎn)量，能夠在較短發(fā)酵周期內(nèi)實(shí)現(xiàn)DHA的高產(chǎn)量積累，從而降低生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化應(yīng)用。

本發(fā)明主要是對(duì)新發(fā)酵工藝的開發(fā)，采用的DHA菌株是從浙江溫州樂清灣西門島南岙山紅樹林分離篩選獲得，經(jīng)由18s rRNA測(cè)序及演化樹比對(duì)后確定為裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310。最終在1T生產(chǎn)罐中裂殖壺菌的生物量可達(dá)100g/L以上，總油占56％，DHA產(chǎn)量占總油的57.1％，生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，具有很大的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為實(shí)施例中DHA生產(chǎn)菌裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310在不補(bǔ)加糖策略下發(fā)酵生產(chǎn)DHA的過程曲線(對(duì)照組)。

圖2為實(shí)施例中DHA生產(chǎn)菌裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310在補(bǔ)加糖后維持殘?zhí)菨舛葹?0g/L左右下發(fā)酵生產(chǎn)DHA的過程曲線。

在圖1和2中，橫坐標(biāo)為時(shí)間Time(h)，左縱坐標(biāo)為葡萄糖濃度Glucose(×)，第一右縱坐標(biāo)為菌體生物量Biomass(●)，第二右縱坐標(biāo)為油脂產(chǎn)量Lipid(■)，第三右縱坐標(biāo)為DHA產(chǎn)量(▲)。

圖3為實(shí)施例中DHA生產(chǎn)菌裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310在優(yōu)化的補(bǔ)糖策略條件下5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線。

圖4為實(shí)施例中DHA生產(chǎn)菌裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310在優(yōu)化的補(bǔ)糖策略條件下1T發(fā)酵罐分批發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線。

在圖3和 4中，橫坐標(biāo)為時(shí)間Time(h)，左縱坐標(biāo)為葡萄糖濃度Glucose(×)，第一右縱坐標(biāo)為菌體生物量Biomass(●)，第二右縱坐標(biāo)為油脂產(chǎn)量Lipid(■)，第三右縱坐標(biāo)為DHA產(chǎn)量(▲)。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

1)菌種活化：將保藏于-70℃的菌種裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24～48h，得活化的菌種，觀察菌落形態(tài)。平板培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O0.17，瓊脂15，pH調(diào)至6.5。

2)一級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟1)中的平板菌落，選擇形態(tài)良好的菌落，用接種環(huán)挑取接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶中，28℃、200rpm培養(yǎng)24～48h；種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得一級(jí)種子培養(yǎng)液。

3)二級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟2)中的一級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶，28℃、200rpm培養(yǎng)24h，用于接種搖瓶發(fā)酵。種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得二級(jí)種子培養(yǎng)液。

4)搖瓶發(fā)酵：將步驟3)中的二級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28℃、200rpm培養(yǎng)144h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖120，谷氨酸鈉5，玉米漿粉5，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10，泛酸鈣3.2，MnCl₂·4H₂O 3，ZnSO₄·7H₂O 3，NiSO₄·6H₂O2，CuSO₄·5H₂O 2，CoCl₂·6H₂O 0.04，Na₂MoO₄·2H₂O 0.04。維生素組成(mg/L)：VB₁9.5，VB₁₂ 0.1，pH調(diào)至6.5。每4h取樣測(cè)定葡萄糖濃度，每12h取樣測(cè)定生物量、油脂和DHA產(chǎn)量。

油脂提取及甲酯化方法：取一定量的油脂置于50mL磨口錐形瓶中，加入5mL的0.5M的KOH-CH₃OH溶液于65℃水浴回流10min進(jìn)行皂化；待油珠溶解冷卻后，加入5mL 30％的三氟化硼乙醚反應(yīng)30min；冷卻后加入5mL正己烷和50μL 40g/L的二十烷酸甲酯，混勻振蕩，接著加入2mL飽和氯化鈉溶液防止乳化，靜置分層后取上層正己烷相并加入無水硫酸鈉脫水，最后使用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后即可進(jìn)行氣相色譜分析。

GC檢測(cè)條件：Agilent 7890A氣相色譜儀，Supelco SP-2560(100m×0.25mm ID，0.20μm film)色譜柱，柱長(zhǎng)100m，直徑0.25mm；進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣溫度260℃，分流比100:1；程序升溫：初始溫度140℃，維持5min；然后以3℃/min速度升溫至240℃，并維持10min；載氣：氦氣，20cm/s；檢測(cè)器溫度：260℃。

經(jīng)過以上色譜條件測(cè)定，菌體生物量可達(dá)58.9g/L，總油產(chǎn)量可達(dá)57％，DHA產(chǎn)量可達(dá)46.9％(發(fā)酵過程曲線如圖1)。

實(shí)施例2

1)菌種活化：將保藏于-70℃的菌種裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24～48h，得活化的菌種，觀察菌落形態(tài)。平板培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O0.17，瓊脂15，pH調(diào)至6.5。

2)一級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟1)中的平板菌落，選擇形態(tài)良好的菌落，用接種環(huán)挑取接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶中，28℃、200rpm培養(yǎng)24～48h；種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得一級(jí)種子培養(yǎng)液。

3)二級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟2)中的一級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶，28℃、200rpm培養(yǎng)24h，用于接種搖瓶發(fā)酵。種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得二級(jí)種子培養(yǎng)液。

4)搖瓶發(fā)酵：將步驟3)中的二級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28℃、200rpm培養(yǎng)144h。發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?g/L時(shí)就開始流加高濃度的葡萄糖溶液，使殘?zhí)菨舛染S持在30g/L左右，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖120，谷氨酸鈉5，玉米漿粉5，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10，泛酸鈣3.2，MnCl₂·4H₂O 3，ZnSO₄·7H₂O 3，NiSO₄·6H₂O 2，CuSO₄·5H₂O 2，CoCl₂·6H₂O 0.04，Na₂MoO₄·2H₂O 0.04。維生素組成(mg/L)：VB₁9.5，VB₁₂ 0.1，pH調(diào)至6.5。每4h取樣測(cè)定葡萄糖濃度，每12h取樣測(cè)定生物量、油脂和DHA產(chǎn)量。

油脂提取及甲酯化方法：取一定量的油脂置于50mL磨口錐形瓶中，加入5mL的0.5M的KOH-CH₃OH溶液于65℃水浴回流10min進(jìn)行皂化；待油珠溶解冷卻后，加入5mL 30％的三氟化硼乙醚反應(yīng)30min；冷卻后加入5mL正己烷和50μL 40g/L的二十烷酸甲酯，混勻振蕩，接著加入2mL飽和氯化鈉溶液防止乳化，靜置分層后取上層正己烷相并加入無水硫酸鈉脫水，最后使用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后即可進(jìn)行氣相色譜分析。

GC檢測(cè)條件：Agilent 7890A氣相色譜儀，Supelco SP-2560(100m×0.25mm ID，0.20μm film)色譜柱，柱長(zhǎng)100m，直徑0.25mm；進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣溫度260℃，分流比100:1；程序升溫：初始溫度140℃，維持5min；然后以3℃/min速度升溫至240℃，并維持10min；載氣：氦氣，20cm/s；檢測(cè)器溫度：260℃。

經(jīng)過以上色譜條件測(cè)定，菌體生物量可達(dá)78.6g/L，總油產(chǎn)量可達(dá)57.3％，DHA產(chǎn)量可達(dá)47.2％(發(fā)酵過程曲線如圖2)。

實(shí)施例3

1)菌種活化：將保藏于-70℃的菌種裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24～48h，得活化的菌種，觀察菌落形態(tài)。平板培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O0.17，瓊脂15，pH調(diào)至6.5。

2)一級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟1)中的平板菌落，選擇形態(tài)良好的菌落，用接種環(huán)挑取接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶中，28℃、200rpm培養(yǎng)24～48h；種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得一級(jí)種子培養(yǎng)液。

3)二級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟2)中的一級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶，28℃、200rpm培養(yǎng)24h，用于接種搖瓶發(fā)酵。種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得二級(jí)種子培養(yǎng)液。

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將步驟3)中的二級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在溫度28℃，轉(zhuǎn)速500rpm和2vvm的通氣量下培養(yǎng)120h。通過流加2M NaOH或1M檸檬酸(CA)自動(dòng)控制發(fā)酵液pH。發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?g/L時(shí)就開始流加高濃度的葡萄糖溶液，使殘?zhí)菨舛染S持在30g/L左右，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖120，谷氨酸鈉5，玉米漿粉5，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10，泛酸鈣3.2，MnCl₂·4H₂O 3，ZnSO₄·7H₂O3，NiSO₄·6H₂O 2，CuSO₄·5H₂O 2，CoCl₂·6H₂O 0.04，Na₂MoO₄·2H₂O 0.04。維生素組成(mg/L)：VB₁ 9.5，VB₁₂ 0.1，pH調(diào)至6.5。每4h取樣測(cè)定葡萄糖濃度，每12h取樣測(cè)定生物量、油脂和DHA產(chǎn)量。

油脂提取及甲酯化方法：取一定量的油脂置于50mL磨口錐形瓶中，加入5mL的0.5M的KOH-CH₃OH溶液于65℃水浴回流10min進(jìn)行皂化；待油珠溶解冷卻后，加入5mL 30％的三氟化硼乙醚反應(yīng)30min；冷卻后加入5mL正己烷和50μL 40g/L的二十烷酸甲酯，混勻振蕩，接著加入2mL飽和氯化鈉溶液防止乳化，靜置分層后取上層正己烷相并加入無水硫酸鈉脫水，最后使用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后即可進(jìn)行氣相色譜分析。

GC檢測(cè)條件：Agilent 7890A氣相色譜儀，Supelco SP-2560(100m×0.25mm ID，0.20μm film)色譜柱，柱長(zhǎng)100m，直徑0.25mm；進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣溫度260℃，分流比100:1；程序升溫：初始溫度140℃，維持5min；然后以3℃/min速度升溫至240℃，并維持10min；載氣：氦氣，20cm/s；檢測(cè)器溫度：260℃。

經(jīng)過以上色譜條件測(cè)定，菌體生物量可達(dá)128.7g/L，總油產(chǎn)量可達(dá)59.3％，DHA產(chǎn)量可達(dá)49.8％(發(fā)酵過程曲線如圖3)。

實(shí)施例4

1)菌種活化：將保藏于-70℃的菌種裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)LU310轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24～48h，得活化的菌種，觀察菌落形態(tài)。平板培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O0.17，瓊脂15，pH調(diào)至6.5。

2)一級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟1)中的平板菌落，選擇形態(tài)良好的菌落，用接種環(huán)挑取接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶中，28℃、200rpm培養(yǎng)24～48h；種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得一級(jí)種子培養(yǎng)液。

3)二級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟2)中的一級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL平底錐形瓶，28℃、200rpm培養(yǎng)24h，用于接種搖瓶發(fā)酵。種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉10，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄ 1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄ 0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，pH調(diào)至6.5，得二級(jí)種子培養(yǎng)液。

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將步驟3)中的二級(jí)種子培養(yǎng)液，以4％的接種量接入裝有400L發(fā)酵培養(yǎng)基的1T發(fā)酵罐中，在溫度28℃、攪拌轉(zhuǎn)速160rpm、罐壓0.04Mpa和20m³/h的通氣量下培養(yǎng)84h。通過流加2M NaOH或1M檸檬酸(CA)自動(dòng)控制發(fā)酵液pH。發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?g/L時(shí)就開始流加高濃度的葡萄糖溶液，使殘?zhí)菨舛染S持在30g/L左右，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖40，谷氨酸鈉5，玉米漿粉5，Na₂SO₄ 12，MgSO₄ 2，KH₂PO₄1，(NH₄)₂SO₄ 1，K₂SO₄0.65，KCl 0.5，CaCl₂.2H₂O 0.17，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10，泛酸鈣3.2，MnCl₂·4H₂O 3，ZnSO₄·7H₂O 3，NiSO₄·6H₂O 2，CuSO₄·5H₂O 2，CoCl₂·6H₂O 0.04，Na₂MoO₄·2H₂O 0.04。維生素組成(mg/L)：VB₁ 9.5，VB₁₂ 0.1，pH調(diào)至6.5。每4h取樣測(cè)定葡萄糖濃度，每12h取樣測(cè)定生物量、油脂和DHA產(chǎn)量。

油脂提取及甲酯化方法：取一定量的油脂置于50mL磨口錐形瓶中，加入5mL的0.5M的KOH-CH₃OH溶液于65℃水浴回流10min進(jìn)行皂化；待油珠溶解冷卻后，加入5mL 30％的三氟化硼乙醚反應(yīng)30min；冷卻后加入5mL正己烷和50μL 40g/L的二十烷酸甲酯，混勻振蕩，接著加入2mL飽和氯化鈉溶液防止乳化，靜置分層后取上層正己烷相并加入無水硫酸鈉脫水，最后使用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后即可進(jìn)行氣相色譜分析。

GC檢測(cè)條件：Agilent 7890A氣相色譜儀，Supelco SP-2560(100m×0.25mm ID，0.20μm film)色譜柱，柱長(zhǎng)100m，直徑0.25mm；進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣溫度260℃，分流比100:1；程序升溫：初始溫度140℃，維持5min；然后以3℃/min速度升溫至240℃，并維持10min；載氣：氦氣，20cm/s；檢測(cè)器溫度：260℃。

經(jīng)過以上色譜條件測(cè)定，菌體生物量可達(dá)104.4g/L，總油產(chǎn)量可達(dá)56％，DHA產(chǎn)量可達(dá)57.1％(發(fā)酵過程曲線如圖4)。