本發(fā)明涉及一種微生物油脂提取技術(shù)，特別涉及一種提取裂殖壺菌油脂的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，簡(jiǎn)稱DHA)是重要的ω-3多不飽和脂肪酸，俗稱“腦黃金”，具有促進(jìn)腦細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、保護(hù)視力、防治心血管疾病、抗癌及提高免疫能力等多種重要的生理功能。由于人體自身難以合成DHA，必須從體外攝入。深海魚(yú)油是DHA的傳統(tǒng)來(lái)源，但其品質(zhì)易受到魚(yú)的種類、季節(jié)和地理位置等的影響，此外，還存在DHA含量低、脂肪酸組成復(fù)雜、有魚(yú)腥味和海洋污染物等缺點(diǎn)，難以滿足市場(chǎng)需求。海洋真菌裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)具有生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)和DHA含量高等優(yōu)勢(shì)，已被證實(shí)是理想的DHA生產(chǎn)菌株之一。

裂殖壺菌的脂質(zhì)主要存在于由細(xì)胞壁所包裹的菌體細(xì)胞內(nèi)。為了提取胞內(nèi)油脂，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壁。不同的細(xì)胞破碎方法直接影響到油脂的產(chǎn)量、品質(zhì)及生產(chǎn)成本。因此，開(kāi)發(fā)低成本、高效的細(xì)胞破碎技術(shù)是實(shí)現(xiàn)DHA油脂大規(guī)模生產(chǎn)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

目前，已報(bào)道的裂殖壺菌細(xì)胞破碎方法主要有：物理法(研磨法、均質(zhì)法、超聲波法、凍融法和微波法)、化學(xué)法(酸法、堿法)和生物法(酶法)。其中，超聲波法、凍融法和微波法僅適用于實(shí)驗(yàn)室處理少量樣品，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用；酸法中由于使用濃鹽酸含有氯離子，會(huì)造成不銹鋼設(shè)備的腐蝕。因此，工業(yè)上常使用研磨法、均質(zhì)法、酶法或兩種以上相結(jié)合的方法來(lái)破碎細(xì)胞。采用酶法時(shí)，酶與底物的空間位阻會(huì)影響酶解效果；高壓均質(zhì)法單次破碎效果差，在工業(yè)化生產(chǎn)中需要多次重復(fù)破碎，不僅易造成物料升溫，而且會(huì)造成機(jī)械損耗。超高壓均質(zhì)技術(shù)(Ultra-High Pressure Homogenization，簡(jiǎn)稱UHPH)是基于傳統(tǒng)均質(zhì)技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種非熱加工技術(shù)，壓力一般在60MPa以上，最高可達(dá)400MPa。在UHPH處理過(guò)程中，利用超高壓能量使樣品通過(guò)狹縫瞬間釋放，在剪切效應(yīng)、空穴效應(yīng)、碰撞效應(yīng)的作用下，使細(xì)胞破碎。因全過(guò)程在4℃-6℃的低溫循環(huán)水浴中進(jìn)行，可保持原有物質(zhì)活性和性能，現(xiàn)已應(yīng)用于紅色諾卡氏菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、雨生紅球藻、小球藻、酵母等破壁研究中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種提取裂殖壺菌油脂的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述的提取裂殖壺菌油脂的方法的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種提取裂殖壺菌油脂的方法，包括以下步驟：

(1)將裂殖壺菌菌液在溫度4℃～10℃、150MPa以上的條件下進(jìn)行超高壓均質(zhì)破壁，得到破碎菌液；

(2)在步驟(1)得到的破碎菌液中加入堿性蛋白酶，酶解，得到酶解菌液；

(3)用萃取劑將步驟(2)得到的酶解菌液進(jìn)行萃取，得到萃取液；

(4)將步驟(3)制備得到的萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，得到油脂。

步驟(1)中所述的裂殖壺菌菌液的菌體濃度(濕重)優(yōu)選為200g/L～300g/L；進(jìn)一步優(yōu)選為200g/L。

步驟(1)中所述的超高壓均質(zhì)破壁的壓力優(yōu)選為150MPa～200MPa。

步驟(1)中所述的超高壓均質(zhì)破壁的破壁次數(shù)優(yōu)選為1次或2次，進(jìn)一步優(yōu)選為1次。

步驟(1)中所述的超高壓均質(zhì)破壁的溫度優(yōu)選為4℃～6℃；進(jìn)一步優(yōu)選為4℃。

步驟(2)中所述的堿性蛋白酶優(yōu)選為液體堿性蛋白酶，酶活為24萬(wàn)U/mL。

步驟(2)中所述的堿性蛋白酶的酶用量?jī)?yōu)選為0.5％～6％；進(jìn)一步優(yōu)選為2％。

步驟(2)中所述的恒溫酶解的時(shí)間優(yōu)選為3h。

步驟(2)中所述的恒溫酶解的反應(yīng)條件優(yōu)選為所用堿性蛋白酶的最適條件。

步驟(3)中所述的萃取劑優(yōu)選為正己烷。

步驟(4)中所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的條件優(yōu)選為操作壓力為-0.095MPa、蒸發(fā)溫度為40℃。

所述的油脂優(yōu)選為ω-3多不飽和脂肪酸；進(jìn)一步優(yōu)選為二十二碳六烯酸(DHA)。

所述提取裂殖壺菌油脂的方法除了提取裂殖壺菌油脂，還可從被孢霉屬、隱甲藻屬或破囊壺菌目微生物中提取多不飽和脂肪酸。

所述的破囊壺菌目微生物優(yōu)選為裂殖壺菌。

所述的多不飽和脂肪酸優(yōu)選為ω-3多不飽和脂肪酸；進(jìn)一步優(yōu)選為二十二碳六烯酸(DHA)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

超高壓均質(zhì)技術(shù)全過(guò)程在4℃～10℃的低溫循環(huán)水浴中進(jìn)行，可使裂殖壺菌油脂避免在高溫條件下發(fā)生變化，所得到的油脂酸價(jià)和過(guò)氧化值低，油脂質(zhì)量更好；同時(shí)實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)樣、出樣，破碎效率高；酶法破壁條件溫和，耗能少，工藝簡(jiǎn)單。采用兩種方法相結(jié)合來(lái)破碎裂殖壺菌，不僅適合于大規(guī)模的連續(xù)作業(yè)，而且毛油提取率高于單一法。

附圖說(shuō)明

圖1是破碎次數(shù)影響裂殖壺菌毛油提取率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

圖2是菌體濃度影響裂殖壺菌毛油提取率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

圖3是破碎壓力影響裂殖壺菌毛油提取率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

圖4是酶用量(0.25％、0.5％、1％)影響裂殖壺菌毛油提取率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

圖5是酶用量(2％、4％、6％)影響裂殖壺菌毛油提取率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備、裂殖壺菌發(fā)酵液制備方法及毛油提取率測(cè)定方法說(shuō)明：

1.實(shí)驗(yàn)材料

裂殖壺菌為Schizochytrium sp.(ATCC 20888)；正己烷、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；粉狀堿性蛋白酶(最適條件：pH為9.5，溫度為55℃，酶活為24萬(wàn)U/mL)，南寧龐博生物工程有限公司；液體堿性蛋白酶(最適條件：pH為10.5，溫度為45℃，酶活為24萬(wàn)U/mL)，南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司。

2.儀器設(shè)備

JN-02C低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀，廣州聚能納米生物科技股份有限公司；PB-10pH計(jì)、PRACTUM1102-1CN電子天平，賽多利斯公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CR 22GⅡ高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；Milli-Q Direct8純水超純水一體機(jī)，密理博中國(guó)有限公司。

3.裂殖壺菌發(fā)酵液制備方法

以下實(shí)施例所用的裂殖壺菌發(fā)酵液根據(jù)文獻(xiàn)(陳麗珠.高密度培養(yǎng)裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸[D].福建廈門:廈門大學(xué),2008.)中的裂殖壺菌5L發(fā)酵罐間歇發(fā)酵工藝(該文獻(xiàn)第三章)制備得到，具體發(fā)酵條件為該文獻(xiàn)第三章的最終優(yōu)化方案，即：在25℃，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，pH5.5，溶氧水平30％，通氣量4L/min的條件下5L發(fā)酵罐培養(yǎng)裂殖壺菌。

4.毛油提取率測(cè)定方法

用恒重蒸發(fā)瓶收集萃取的油脂，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡溶劑后稱重記為m。提油率(Y)計(jì)算公式如下：

Y＝(m/W)×100％

式中：Y-毛油提取率，％

m-毛油質(zhì)量，g

W-裂殖壺菌中的油脂理論量(由酸熱法測(cè)定)，g

所有數(shù)據(jù)均在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)測(cè)定三次。

實(shí)施例1

(1)將裂殖壺菌發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，棄去上層液，得到菌泥，分別稱取100g和125g菌泥，用去離子水重懸配制成菌體濃度為200g/L(濕重)和250g/L(濕重)的裂殖壺菌菌液各500mL，備用。

(2)步驟(1)中制得的200g/L(濕重)和250g/L(濕重)裂殖壺菌菌液分別各取3組，每組50mL，在溫度4℃，壓力為200MPa的條件下，進(jìn)行超高壓均質(zhì)破壁，3組裂殖壺菌菌液分別破碎1次、2次、3次，得到破碎菌液。

(3)在步驟(2)中得到的破碎菌液中分別加入等體積量的正己烷，充分振蕩后，靜置分層，取上層液，重復(fù)3～5次，至上層液為無(wú)色，合并上層液得正己烷萃取液。

(4)將步驟(3)中的6組正己烷萃取液分別在操作壓力為-0.095MPa、蒸發(fā)溫度為40℃的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正己烷，同時(shí)得到毛油。

結(jié)果如圖1所示，兩種菌體濃度下的裂殖壺菌菌液毛油提取率都隨著破碎次數(shù)的增加而降低，在相同破碎次數(shù)時(shí)，菌體濃度為250g/L(濕重)的毛油提取率要低于菌體濃度為200g/L(濕重)的毛油提取率，其中，菌體濃度為250g/L(濕重)的菌液破碎3次后的毛油提取率最低僅為66.67％。本發(fā)明的研究人員發(fā)現(xiàn)，隨著破碎次數(shù)的增加，處理時(shí)間變長(zhǎng)，樣品損失也急劇增加，會(huì)造成毛油提取率的降低。

實(shí)施例2

(1)將裂殖壺菌發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，棄去上清液，得到菌泥，分別稱取100g、125g、150g、175g、200g菌泥，用去離子水重懸配制成菌體濃度為200g/L(濕重)、250g/L(濕重)、300g/L(濕重)、350g/L(濕重)、400g/L(濕重)的5組的裂殖壺菌菌液各500mL，備用。

(2)步驟(1)中制得的5組裂殖壺菌菌液分別各取50mL，在溫度4℃，壓力為200MPa的條件下，進(jìn)行超高壓均質(zhì)破壁，5組裂殖壺菌菌液均破碎1次，得到破碎菌液。

(3)在步驟(2)中得到的破碎菌液中分別加入等體積量的正己烷，充分振蕩后，靜置分層，取上層液，重復(fù)3～5次，至上層液為無(wú)色，合并上層液得正己烷萃取液。

(4)將步驟(3)中的5組正己烷萃取液分別在操作壓力為-0.095MPa、蒸發(fā)溫度為40℃的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正己烷，同時(shí)得到毛油。

結(jié)果如圖2所示，毛油提取率隨著菌體濃度的增加而降低，其中，菌體濃度為400g/L(濕重)的菌液破碎1次后的毛油提取率最低僅為59.8％。本發(fā)明的研究人員研究分析認(rèn)為，隨著菌體濃度的增加，菌液粘度變大，易造成單向閥堵塞，而且破碎過(guò)程摩擦阻力變大，破碎時(shí)溫度升高，在生產(chǎn)上會(huì)造成毛油提取率下降，設(shè)備損耗過(guò)大。而菌體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致每次收集到的碎片的量較少，使得生產(chǎn)效率低下，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

實(shí)施例3

(1)將裂殖壺菌發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，棄去上清液，得到菌泥，稱取100g菌泥，用去離子水重懸配制成菌體濃度為200g/L(濕重)的裂殖壺菌菌液500mL，備用。

(2)取步驟(1)中制得的裂殖壺菌菌液50mL，取3組，在溫度4℃，壓力分別為100MPa、150MPa、200MPa的條件下，進(jìn)行超高壓均質(zhì)破壁，3組裂殖壺菌菌液均破碎1次，得到破碎菌液。

(3)在步驟(2)中得到的破碎菌液中分別加入等體積量的正己烷，充分振蕩后，靜置分層，取上層液，重復(fù)3～5次，至上層液為無(wú)色，合并上層液得正己烷萃取液。

(4)將步驟(3)中的3組正己烷萃取液分別在操作壓力為-0.095MPa、蒸發(fā)溫度為40℃的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正己烷，同時(shí)得到毛油。

結(jié)果如圖3所示，毛油提取率隨著破碎壓力的增加而升高，其中在破碎壓力為200MPa時(shí)，毛油提取率最高可達(dá)80％。壓力是超高壓均質(zhì)技術(shù)的重要技術(shù)參數(shù)，其大小對(duì)裂殖壺菌細(xì)胞的破壁會(huì)產(chǎn)生重要影響。在一定壓力范圍內(nèi)(150MPa～200MPa)，隨著壓力的升高，作用于菌體細(xì)胞的作用力增強(qiáng)，細(xì)胞壁被破壞的數(shù)量增加，從菌體細(xì)胞釋放出的油脂越來(lái)越多，但壓力過(guò)高，會(huì)造成設(shè)備成本較高。

實(shí)施例4

(1)將裂殖壺菌發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，棄去上清液，得到菌泥，稱取100g菌泥，用去離子水重懸配制成菌體濃度為200g/L(濕重)的裂殖壺菌菌液500mL，備用。

(2)取步驟(1)中制得的裂殖壺菌菌液50mL，在溫度10℃，壓力為200MPa的條件下，進(jìn)行超高壓均質(zhì)破壁，裂殖壺菌菌液破碎1次，得到破碎菌液。

(3)在步驟(2)中得到的破碎菌液中分別加入等體積量的正己烷，充分振蕩后，靜置分層，取上層液，重復(fù)3～5次，至上層液為無(wú)色，合并上層液得正己烷萃取液。

(4)將步驟(3)中的萃取液分別在操作壓力為-0.095MPa、蒸發(fā)溫度40℃的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正己烷，同時(shí)得到毛油。

經(jīng)測(cè)定，毛油提取率高達(dá)78.85％。

實(shí)施例5

(1)將裂殖壺菌發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，棄去上清液，得到菌泥，稱取100g菌泥，用去離子水重懸配制成菌體濃度為200g/L(濕重)的裂殖壺菌菌液500mL，備用。

(2)取步驟(1)中制得的裂殖壺菌菌液50mL，在溫度4℃，壓力為200MPa的條件下，進(jìn)行超高壓均質(zhì)破壁，破碎1次，得到破碎菌液。

(3)取步驟(2)中所得的破碎菌液于100mL燒杯中，分別用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，在溫度為45℃的條件下分別添加0.25％、0.5％、1％、2％、4％、6％(重量百分比)的液態(tài)堿性蛋白酶或粉狀堿性蛋白酶(酶活為24萬(wàn)U/mL)，分別置于250mL圓底燒瓶中，恒溫中速攪拌酶解3h。

(4)在步驟(3)中得到的酶解后的破碎菌液中分別加入等體積量的正己烷，充分振蕩后，靜置分層，取上層液，重復(fù)3～5次，至上層液為無(wú)色，合并上層液得正己烷萃取液。

(5)將步驟(4)中的正己烷萃取液分別在操作壓力為-0.095MPa、蒸發(fā)溫度為40℃的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正己烷，同時(shí)得到毛油。

結(jié)果如圖4、圖5所示，分別加入兩種堿性蛋白酶后，毛油提取率都隨著酶用量的增加先升高后略有降低。本發(fā)明的研究人員研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌液經(jīng)過(guò)超高壓均質(zhì)破碎后，酶與底物的空間位阻減弱，合適用量的酶會(huì)對(duì)細(xì)胞壁的特定組分進(jìn)一步降解破壁，從而提高油脂提取率。其中，加入4％的液體堿性蛋白酶時(shí)毛油提取率最高可達(dá)93.70％。但當(dāng)加入6％的液體堿性蛋白酶后，酶的添加量已過(guò)量，過(guò)量的酶會(huì)影響后續(xù)的萃取，反而降低了毛油提取率。

實(shí)施例6

(1)將裂殖壺菌發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，棄去上清液，得到菌泥，稱取100g菌泥，用去離子水重懸配制成菌體濃度為200g/L(濕重)的裂殖壺菌菌液500mL，備用。

(2)取步驟(1)中制得的裂殖壺菌菌液50mL，在溫度4℃，壓力為200MPa的條件下，進(jìn)行超高壓均質(zhì)破壁，破碎1次，得到破碎菌液。

(3)取步驟(2)中所得的破碎菌液于100mL燒杯中，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，在溫度為45℃的條件下添加2％(重量百分比)的液體堿性蛋白酶(酶活為24萬(wàn)U/mL)，置于250mL圓底燒瓶中，恒溫中速攪拌酶解3h。

(4)在步驟(3)中得到的酶解后的破碎菌液中加入等體積量的正己烷，充分振蕩后，靜置分層，取上層液，重復(fù)3～5次，至上層液為無(wú)色，合并上層液得正己烷萃取液。

(5)將步驟(4)中的正己烷萃取液在操作壓力為-0.095MPa、蒸發(fā)溫度為40℃的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正己烷，同時(shí)得到毛油。

經(jīng)檢測(cè)，毛油提取率高達(dá)92.12％。

對(duì)比例

1.酸熱法

稱取50mL的菌體濃度為200g/L(濕重)的裂殖壺菌菌液至圓底燒瓶中，按照V(濃鹽酸)/V(菌液)＝4/3的比例加入濃鹽酸，置于70℃恒溫水浴中，攪拌反應(yīng)50min后結(jié)束，冷卻降溫至室溫。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入等體積正己烷充分振蕩混勻，靜置分層后取正己烷層移至蒸發(fā)瓶，旋蒸至恒重，稱量。

酸價(jià)依據(jù)《GB/T 5009.37-2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

過(guò)氧化值依據(jù)《GB/T 5009.37-2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的第一法滴定法進(jìn)行測(cè)定。

表1不同提取方法得到的毛油對(duì)比

結(jié)果如表1所示，采用本發(fā)明的提取方法，毛油提取率高達(dá)92.12％；同時(shí)，通過(guò)本發(fā)明的提取方法所獲得的毛油品質(zhì)(酸價(jià)和過(guò)氧化值)都優(yōu)于酸熱法。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。