本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體而言，涉及一種冬蟲夏草發(fā)酵廢液的再利用方法。

背景技術(shù)：

冬蟲夏草又名蟲草、冬蟲草、夏草冬蟲。為麥角菌科植物冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠科昆蟲幼蟲體上的子坐及幼蟲尸體內(nèi)為菌核的復(fù)合體。主產(chǎn)于四川、青海、西藏、云南等地。夏至前后挖取，曬干或烘干，生用?，F(xiàn)代研究表明，冬蟲夏草具有重要的食用、藥用和其它經(jīng)濟(jì)價(jià)值，蟲草中含有豐富的蟲草酸、蟲草素及各類氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有擴(kuò)張氣管、鎮(zhèn)靜、抗各類細(xì)菌、降血壓的功效。近年來，美國、日本等相繼報(bào)道蟲草具有提高人體抑止腫瘤能力，能加強(qiáng)人體排異作用。解放后我國也對食用菌和冬蟲夏草的人工引種、馴化、栽培、遺傳、應(yīng)用等方面進(jìn)行了很多研究。

目前我國冬蟲夏草培養(yǎng)大部分是人工栽培培養(yǎng)，由于受地理環(huán)境、氣候、水土及蟲草品種等各方面的自然條件影響，冬蟲夏草的質(zhì)量和產(chǎn)量極不穩(wěn)定，難于實(shí)現(xiàn)規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。采用深層發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌絲體，一方面很容易從培養(yǎng)液中分離和提取出各種有效成份物質(zhì)，例如提取蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖等有用物質(zhì)和具有抗癌作用的冬蟲夏草素及多種氨基酸，另一方面利用大容積的發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)能夠提高產(chǎn)量，保證篩選用藥的物質(zhì)來源，緩解蟲草資源的緊張狀況。

冬蟲夏草的人工培養(yǎng)的過程中，經(jīng)發(fā)酵后的菌絲體一般只占發(fā)酵物總量的3％左右，而將其余97％的發(fā)酵液當(dāng)作廢液棄去，對發(fā)酵液成分進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖的發(fā)酵廢液內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、D-甘露糖、麥角甾醇、和微量元素，如果直接將蟲草發(fā)酵廢液棄去，則不但浪費(fèi)資源，同時(shí)也會造成環(huán)境污染。因此，本領(lǐng)域亟需一種能夠回收利用蟲草發(fā)酵廢液，降低資源浪費(fèi)和環(huán)境污染的方法。

本領(lǐng)域已有將生物發(fā)酵產(chǎn)生的廢液經(jīng)過處理后再次作為培養(yǎng)基的組成部分循環(huán)使用，但基于發(fā)酵菌種和產(chǎn)物的不同，如何循環(huán)利用生物發(fā)酵廢液，并沒有固定的方法，也不可能借鑒已有方法而直接套用，而是需要根據(jù)菌種發(fā)酵廢液的具體情況，通過不斷的嘗試才能得出。生物發(fā)酵產(chǎn)生的廢液中除了包含上述有效成分以及一些殘?zhí)侵?，還包括一些能夠抑制微生物生長的物質(zhì)，為了實(shí)現(xiàn)發(fā)酵廢液的循環(huán)利用，需要對這些抑制物質(zhì)進(jìn)行處理，消除對菌種生長繁殖的抑制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種能夠有效回收和利用冬蟲夏草發(fā)酵廢液的方法，即將發(fā)酵廢液在添加特定的營養(yǎng)物質(zhì)后按照特定比例返回培養(yǎng)基循環(huán)利用的方法。具體步驟如下：

(1)收集冬蟲夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過濾器進(jìn)行過濾，收集濾液A；

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級機(jī)械精密過濾器進(jìn)行處理，得到濾液B；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級培養(yǎng)基。

具體而言，步驟(1)中的冬蟲夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無性型-中國被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過濾時(shí)的壓力0.35-0.45Mpa，經(jīng)300目濾布過濾；

步驟(2)中，使用排渣三級機(jī)械精密過濾器精密過濾濾液A的具體過程為，在排渣三級機(jī)械精密過濾器內(nèi)依次通過100μm一級精密過濾器、10μm二級精密過濾器和1μm二級精密過濾器處理；

步驟(3)中，濃縮溫度為60-70℃；

步驟(4)中，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.2-1.3Mpa，超濾溫度20-30℃，pH值為6.2～6.8；

步驟(5)中，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉5.5-6％、玉米粉4.5-5％、葡萄糖6-7％、酵母膏2.0-2.5％、蛋白胨1.2-1.8％、硫酸鎂0.4-0.8％、磷酸氫二鉀0.05-0.1％。

步驟(6)中，原三級培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為3：1-5：1。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

本發(fā)明以冬蟲夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液為原料，經(jīng)過處理后除去了抑制冬蟲夏草真菌生長的抑制物質(zhì)，并保留了對冬蟲夏草真菌生長和繁殖有利的物質(zhì)，有效利用了冬蟲夏草發(fā)酵廢液中殘存的營養(yǎng)物質(zhì)，并通過循環(huán)使用回收的發(fā)酵液，意外的發(fā)現(xiàn)其可提高冬蟲夏草菌絲體的產(chǎn)量。通過該方法，達(dá)到了既減少了對資源的浪費(fèi)，又解決了發(fā)酵液對環(huán)境造成污染的問題，并且提高了冬蟲夏草菌絲體的產(chǎn)量的綜合良好效果，同時(shí)降低了企業(yè)生產(chǎn)的成本，提高了產(chǎn)業(yè)的附加值，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明循環(huán)利用冬蟲夏草發(fā)酵廢液的流程示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)收集冬蟲夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過濾器進(jìn)行過濾，收集濾液A；冬蟲夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無性型-中國被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過濾時(shí)的壓力0.35Mpa，經(jīng)300目濾布過濾；具體的發(fā)酵過程可參見中國專利CN201210389147.5的說明書。

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級機(jī)械精密過濾器進(jìn)行處理，得到濾液B，使用排渣三級機(jī)械精密過濾器精密過濾濾液A的具體過程為，在排渣三級機(jī)械精密過濾器內(nèi)依次通過100μm一級精密過濾器、10μm二級精密過濾器和1μm二級精密過濾器處理；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C，濃縮溫度為60℃；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.3Mpa，超濾溫度20℃，pH值為6.2；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉6％、玉米粉4.5％、葡萄糖7％、酵母膏2.0％、蛋白胨1.2％、硫酸鎂0.4％、磷酸氫二鉀0.1％；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為3：1，經(jīng)過四級發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

實(shí)施例2

(1)收集冬蟲夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過濾器進(jìn)行過濾，收集濾液A；冬蟲夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無性型-中國被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過濾時(shí)的壓力0.4Mpa，經(jīng)300目濾布過濾；具體的發(fā)酵過程可參見中國專利CN201210389147.5的說明書。

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級機(jī)械精密過濾器進(jìn)行處理，得到濾液B，使用排渣三級機(jī)械精密過濾器精密過濾濾液A的具體過程為，在排渣三級機(jī)械精密過濾器內(nèi)依次通過100μm一級精密過濾器、10μm二級精密過濾器和1μm二級精密過濾器處理；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C，濃縮溫度為65℃；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.2Mpa，超濾溫度25℃，pH值為6.5；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉5.8％、玉米粉4.8％、葡萄糖6.5％、酵母膏2.2％、蛋白胨1.5％、硫酸鎂0.6％、磷酸氫二鉀0.07％；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為4：1，經(jīng)過四級發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

實(shí)施例3

(1)收集冬蟲夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過濾器進(jìn)行過濾，收集濾液A；冬蟲夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無性型-中國被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過濾時(shí)的壓力0.45Mpa，經(jīng)300目濾布過濾；具體的發(fā)酵過程可參見中國專利CN201210389147.5的說明書。

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級機(jī)械精密過濾器進(jìn)行處理，得到濾液B，使用排渣三級機(jī)械精密過濾器精密過濾濾液A的具體過程為，在排渣三級機(jī)械精密過濾器內(nèi)依次通過100μm一級精密過濾器、10μm二級精密過濾器和1μm二級精密過濾器處理；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C，濃縮溫度為70℃；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.3Mpa，超濾溫度30℃，pH值為6.8；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉5.5％、玉米粉5％、葡萄糖6％、酵母膏2.5％、蛋白胨1.8％、硫酸鎂0.8％、磷酸氫二鉀0.05％；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為5：1，經(jīng)過四級發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對比例1

配置冬蟲夏草真菌的無性型-中國被毛孢三級補(bǔ)加培養(yǎng)液，具體成分為(按百分質(zhì)量)：蠶豆粉6％、玉米粉4.5％、葡萄糖7％、酵母膏2.0％、蛋白胨1.2％、硫酸鎂0.4％、磷酸氫二鉀0.1％，其余為水；將該補(bǔ)加培養(yǎng)液加入三級培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級培養(yǎng)基與加入的補(bǔ)加培養(yǎng)液的體積比為3：1，經(jīng)過四級發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對比例2

配置冬蟲夏草真菌的無性型-中國被毛孢三級培養(yǎng)液，具體成分為(按百分質(zhì)量)：蠶豆粉5.8％、玉米粉4.8％、葡萄糖6.5％、酵母膏2.2％、蛋白胨1.5％、硫酸鎂0.6％、磷酸氫二鉀0.07％，其余為水；將該補(bǔ)加培養(yǎng)液加入三級培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級培養(yǎng)基與加入的補(bǔ)加培養(yǎng)液的體積比為4：1,經(jīng)過四級發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對比例3

配置冬蟲夏草真菌的無性型-中國被毛孢三級培養(yǎng)液，具體成分為(按百分質(zhì)量)：蠶豆粉5.5％、玉米粉5％、葡萄糖6％、酵母膏2.5％、蛋白胨1.8％、硫酸鎂0.8％、磷酸氫二鉀0.05％，其余為水；將該補(bǔ)加培養(yǎng)液加入三級培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級培養(yǎng)基與加入的補(bǔ)加培養(yǎng)液的體積比為5：1,經(jīng)過四級發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對比例4

按照CN201210389147.5實(shí)施例5中的方法進(jìn)行發(fā)酵，在三級發(fā)酵時(shí)不添加培養(yǎng)基，經(jīng)過四級發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

按《中華人民共和國藥典2005年版》中所記載的測定方法，將實(shí)施例1-3所制得的產(chǎn)品與對比例1-4所制得的產(chǎn)品進(jìn)行對比試驗(yàn)，結(jié)果見下表：

由上述測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液經(jīng)過處理后返回添加至三級培養(yǎng)基中，既減少了對資源的浪費(fèi)，又解決了發(fā)酵液對環(huán)境造成污染的問題，同時(shí)還意外的發(fā)現(xiàn)可以提高冬蟲夏草發(fā)酵所得的菌絲體的產(chǎn)量以及質(zhì)量，推測出現(xiàn)該效果的原因?yàn)槎x夏草的發(fā)酵廢液中含有對冬蟲夏草真菌生長和繁殖或者對產(chǎn)生有效代謝產(chǎn)物有利的物質(zhì)成分。