一種鑒定冬蟲(chóng)夏草粉末混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥材的鑒定方法，具體來(lái)說(shuō)，涉及一種鑒定冬蟲(chóng)夏草粉末中是否混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉及初步判斷混入比例的分析方法。
技術(shù)背景
[0002]冬蟲(chóng)夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.(又稱(chēng)冬蟲(chóng)草、中國(guó)蟲(chóng)草)是一種麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體。冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)于海拔3500?5000米的高原和高山地區(qū)，分布于我國(guó)四川、青海、西藏和云南等地，素與人參、鹿茸并稱(chēng)中國(guó)三大補(bǔ)藥。冬蟲(chóng)夏草傳統(tǒng)始載于《本草從新》，味甘、性溫，入肺、腎經(jīng)，有補(bǔ)肺腎、止嗽、益虛損、扶精氣之功效。作為一味傳統(tǒng)的名貴中藥，它具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種藥理作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)用于治療慢性肝炎、腎炎、支氣管炎、冠心病、高血脂和腫瘤等，因其臨床療效確切而被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)隨著采挖力度的加大，資源日漸匱乏，價(jià)格也越來(lái)越昂貴。發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉(發(fā)酵中華被毛孢菌絲體)是從冬蟲(chóng)夏草里分離出來(lái)的菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)而得到，其化學(xué)成分和藥理活性與冬蟲(chóng)夏草較類(lèi)似，可作為一種冬蟲(chóng)夏草供不應(yīng)求的替代品。但是其功效和價(jià)格都跟野生冬蟲(chóng)夏草有較大的差別。于是很多不法商販為謀取暴利，在冬蟲(chóng)夏草中加入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉等類(lèi)似品，以次充好、以假亂真、導(dǎo)致市場(chǎng)摻偽現(xiàn)象嚴(yán)重，偽品泛濫。
[0003]目前文獻(xiàn)資料報(bào)道的冬蟲(chóng)夏草純粉顯微鑒定和紅外鑒定能夠有效的鑒別和區(qū)分冬蟲(chóng)夏草中是否混入了亞香棒蟲(chóng)草、涼山蟲(chóng)草等非正品蟲(chóng)草或者在其中摻入泥土、膠水、淀粉等，但是不能有效的鑒定冬蟲(chóng)夏草中是否混入了其類(lèi)似物-發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉。由于野生冬蟲(chóng)夏草與發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉在化學(xué)成分上十分類(lèi)似，薄層層析和高效液相色譜這些傳統(tǒng)的方法也都很難鑒別冬蟲(chóng)夏草中混入低比例的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉。冬蟲(chóng)夏草市面上大量存在一些以冬蟲(chóng)夏草純粉制作的片劑和膠囊，因此建立一種快速準(zhǔn)確鑒別冬蟲(chóng)夏草純粉中是否混入偽品和類(lèi)似品的技術(shù)，對(duì)保證藥材質(zhì)量和規(guī)范市場(chǎng)次序有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有鑒別技術(shù)存在的缺陷或不足，以及目前市面上銷(xiāo)售的冬蟲(chóng)夏草純粉膠囊和片劑中可能會(huì)摻入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的質(zhì)量問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種冬蟲(chóng)夏草純粉中是否混入一定比例的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉和初步判斷混入比例的鑒別技術(shù)，可做定性定量分析。
[0005]具體的，本發(fā)明提供了一種冬蟲(chóng)夏草粉末混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的分析方法，由以下步驟組成:
[0006]I)取0.05g待測(cè)樣品于1mL 30 %乙醇水溶液，401(氏頻率超聲提取25min，5000rpm離心lOmin，取上清液稀釋4倍，0.45ym濾膜過(guò)濾，得到提取物；
[0007]2)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作為參比溶液，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)步驟I)中的樣品提取物進(jìn)行紫外圖譜掃描，其掃描范圍為350-220nm，光譜分辨率為2nm ;
[0008]3)觀察待測(cè)樣品紫外掃描圖譜是否在275-250nm波段內(nèi)存在負(fù)的吸收值，若無(wú)負(fù)值，則表明冬蟲(chóng)夏草中混入了發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉；若有負(fù)值，說(shuō)明未混入10%以上質(zhì)量比例的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉。
[0009]此外，本發(fā)明還可以通過(guò)在冬蟲(chóng)夏草純粉樣品中添加不同比例的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立模型圖譜，通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)圖譜來(lái)對(duì)待測(cè)樣品中混入的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉比例進(jìn)行定量分析進(jìn)行定量分析，具體的方法由以下步驟組成:
[0010]a)各取0.05g的待測(cè)樣品、冬蟲(chóng)夏草純粉樣品、發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品和分別含有不同質(zhì)量比例發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草樣品置于1mL 30%乙醇水溶液中，40KHZ頻率超聲提取25min，5000rpm離心lOmin，取上清液稀釋4倍，0.45 μ m濾膜過(guò)濾，得到各樣品提取物；
[0011 ] b)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作為參比溶液，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)步驟a)中的各樣品提取物進(jìn)行紫外圖譜掃描，其掃描范圍為350-220nm，光譜分辨率為2nm ;
[0012]c)將冬蟲(chóng)夏草純粉樣品，發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品和分別含有不同質(zhì)量比例發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草樣品的紫外掃描圖譜進(jìn)行疊加，建立標(biāo)準(zhǔn)模型圖譜；
[0013]d)將待測(cè)樣品紫外掃描圖譜與步驟c)中模型圖譜對(duì)比，根據(jù)圖譜位置確定待測(cè)樣品中混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的比例。
[0014]本發(fā)明方法的技術(shù)有益效果如下:
[0015](I)本方法需要樣品量很小，鑒別快速準(zhǔn)確，方便進(jìn)行批量鑒定，經(jīng)濟(jì)適用性強(qiáng)。
[0016](2)樣品不需要復(fù)雜處理，不需要大型精密儀器，對(duì)操作者技能無(wú)特殊要求。
[0017](3)本方法使用濃度為12.5 μ g/mL的腺苷作為參比溶液，能夠通過(guò)觀察在275-250nm段是否有負(fù)吸收值清晰直觀的判斷是否混入了 10%以上發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉，與模型圖譜比對(duì)能初步判斷混入發(fā)酵中華被毛孢菌絲體的比例。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是市售冬蟲(chóng)夏草膠囊樣品A定性分析紫外吸收光譜圖；
[0019]圖2是市售冬蟲(chóng)夏草含片樣品B定性分析紫外吸收光譜圖；
[0020]圖3是冬蟲(chóng)夏草樣品(A)、分別混入10% (B) ,20% (C) ,40% (D) ,50% (E)發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草樣品和發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品(F)紫外掃描圖疊加建立的標(biāo)準(zhǔn)模型圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例子僅為了闡明本發(fā)明，而非為了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0022]實(shí)施例1
[0023]取一份市售冬蟲(chóng)夏草膠囊樣品A，將其中粉末取出進(jìn)行研磨粉碎，過(guò)100目篩，然后稱(chēng)取0.050g樣品置于10mL的圓底三角瓶中，加入30%乙醇水溶液10mL，40嗎頻率超聲提取25min，5000rpm離心1min取上清液。將上清液取出后稀釋4倍，使用0.45 ym微孔濾膜過(guò)濾，以12.5 μ g/mL腺苷標(biāo)準(zhǔn)品作為參比進(jìn)行紫外光譜掃描，其掃描條件為:掃描范圍350-220nm，光譜分辨率2nm。所得光譜圖見(jiàn)圖1。由樣品的紫外吸收光譜圖可以看出，在275-250nm波段內(nèi)不存在負(fù)的吸收值，表明所售冬蟲(chóng)夏草膠囊中混入了發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉。
[0024]實(shí)施例2
[0025]取一份市售冬蟲(chóng)夏草含片樣品B，將其研磨粉碎，過(guò)100目篩，然后稱(chēng)取0.050g樣品置于10mL的圓底三角瓶中，加入30%乙醇水溶液10mL，40KHz頻率超聲提取25min，5000rpm離心1min取上清液。將上清液取出后稀釋4倍，使用0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，以12.5 μ g/mL腺苷標(biāo)準(zhǔn)品作為參比進(jìn)行紫外光譜掃描，其掃描條件為:掃描范圍350-220nm，光譜分辨率2nm。所得光譜圖見(jiàn)圖2。由樣品的紫外吸收光譜圖可以看出，在275_250nm波段內(nèi)有負(fù)的吸收值，表明所售冬蟲(chóng)夏草含片中未混入10%以上發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉。
[0026]實(shí)施例3
[0027]取市售冬蟲(chóng)夏草膠囊樣品A，從中國(guó)食品藥品檢定研宄院購(gòu)買(mǎi)的野生冬蟲(chóng)夏草標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品和含有10 %、20 %、40 %、50 %發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草粉末7個(gè)樣品，粉碎，分別過(guò)100目篩，然后各稱(chēng)取0.050g，分別置于10mL的圓底三角瓶中，各加入30%乙醇水溶液10mL，40KHZ頻率超聲提取25min，5000rpm離心1min取上清液。將上清液取出后稀釋4倍，使用0.45 y m微孔濾膜過(guò)濾，以12.5 μ g/mL的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為參比，對(duì)以上7個(gè)樣品分別進(jìn)行紫外光譜掃描，其條件為:掃描范圍350-220nm，光譜分辨率2nm。將野生冬蟲(chóng)夏草樣品，發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品和含有10%、20%、40%、50%發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草所得紫外掃描圖譜進(jìn)行疊加建立紫外光譜標(biāo)準(zhǔn)模型圖譜，見(jiàn)圖3。將市售冬蟲(chóng)夏草膠囊樣品與建立的紫外光譜標(biāo)準(zhǔn)模型圖譜進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)其圖譜中275-250nm處吸收值的位置，判斷市售冬蟲(chóng)夏草膠囊樣品中發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的比例為70-80%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種冬蟲(chóng)夏草粉末中混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的分析方法，其特征在于，由以下步驟組成: 1)取0.05g待測(cè)樣品，加入1mL 30%乙醇水溶液，401(氏頻率超聲提取25min，5000rpm離心lOmin，取上清液稀釋4倍，0.45ym濾膜過(guò)濾，得到提取物； 2)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作為參比溶液，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)步驟I)中的樣品提取物進(jìn)行紫外圖譜掃描，其掃描范圍為350-220nm，光譜分辨率為2nm ; 3)觀察待測(cè)樣品紫外掃描圖譜是否在275-250nm波段內(nèi)存在負(fù)的吸收值，若無(wú)負(fù)值，則表明冬蟲(chóng)夏草中混入了發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉；若有負(fù)值，說(shuō)明未混入10%以上質(zhì)量比例的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還可以在冬蟲(chóng)夏草純粉樣品中添加不同比例的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)模型圖譜，通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)圖譜來(lái)對(duì)待測(cè)樣品中混入的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉比例進(jìn)行定量分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，由以下步驟組成: a)各取0.05g的待測(cè)樣品、冬蟲(chóng)夏草純粉樣品、發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品和分別含有不同質(zhì)量比例發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草樣品置于1mL 30%乙醇水溶液中，40KHZ頻率超聲提取25min，5000rpm離心lOmin，取上清液稀釋4倍，0.45 μ m濾膜過(guò)濾，得到各樣品提取物； b)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作為參比溶液，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)步驟a)中的各樣品提取物進(jìn)行紫外圖譜掃描，其掃描范圍為350-220nm，光譜分辨率為2nm ； c)將冬蟲(chóng)夏草純粉樣品，發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品和分別含有不同質(zhì)量比例發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草樣品的紫外掃描圖譜進(jìn)行疊加，建立標(biāo)準(zhǔn)模型圖譜； d)將待測(cè)樣品紫外掃描圖譜與步驟c)中模型圖譜對(duì)比，根據(jù)圖譜275-250nm處的位置確定待測(cè)樣品中混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的比例。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種冬蟲(chóng)夏草粉末中是否混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉和初步判斷混入比例的紫外光譜分析鑒定方法。利用濃度為12.5μg/mL的腺苷溶液為參比溶液進(jìn)行350-220nm的紫外光譜掃描。觀察待測(cè)樣品在275-250nm區(qū)段內(nèi)是否存在負(fù)的吸收值即可判斷是否混入了發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉。將冬蟲(chóng)夏草純粉樣品，發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品和含有不同比例的發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉標(biāo)準(zhǔn)品的冬蟲(chóng)夏草樣品的掃描圖譜疊加，建立標(biāo)準(zhǔn)模型圖譜。將待測(cè)樣品圖譜與建立的模型圖譜比對(duì)，可以初步判斷混入發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉的比例。本發(fā)明所述的鑒定方法對(duì)樣品需求量很小，且操作簡(jiǎn)單，分析快速，易于操作，不需大型貴重儀器，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠進(jìn)行批量鑒定。
【IPC分類(lèi)】G01N21-33
【公開(kāi)號(hào)】CN104568802
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410856231
【發(fā)明人】李文佳, 艾中, 錢(qián)正明, 周建橋, 李文慶, 李光榮
【申請(qǐng)人】廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日